欒崇林，蔣曉華，金 剛，代建國(guó)

（深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518088）

多肽檢測(cè)方法研究進(jìn)展*

欒崇林，蔣曉華，金 剛，代建國(guó)

（深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518088）

本文對(duì)質(zhì)譜法（MS）、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）、毛細(xì)管電泳質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）法、光譜分析法等在多肽檢測(cè)中的最新進(jìn)展進(jìn)行了綜述．質(zhì)譜檢測(cè)多肽最大的優(yōu)勢(shì)在于穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確性高．采用色譜或電泳分離技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用可解決相同氨基酸組成但序列不同的多肽的檢測(cè)．光譜技術(shù)檢測(cè)多肽，通常無(wú)需樣品預(yù)處理分離，且光譜技術(shù)設(shè)計(jì)的多肽傳感方式靈活多變，但光譜技術(shù)往往需要借助其他方法才可對(duì)多肽進(jìn)行定性分析，因此該方法不具有普遍性．

多肽；質(zhì)譜；色譜；熒光；檢測(cè)

多肽通常是指由10~100個(gè)氨基酸分子脫水縮合而成的化合物．也有文獻(xiàn)將2~10個(gè)氨基酸組成的肽稱(chēng)為寡肽，10~50個(gè)氨基酸的組成的肽稱(chēng)為多肽，50個(gè)以上氨基酸組成的肽稱(chēng)為蛋白質(zhì)[1]．多肽種類(lèi)繁多，幾乎參與生物體的生長(zhǎng)、發(fā)育、免疫、新陳代謝等各個(gè)環(huán)節(jié)，如促進(jìn)礦物質(zhì)吸收的肽（CPPS）、酶調(diào)節(jié)劑（如促胰酶肽）、激素肽（如生長(zhǎng)激素釋放因子GRFS）等[2]．多肽作為生物標(biāo)志物還涉及到某些疾病的病理研究，如 β淀粉樣肽在腦中的沉積與阿爾茲海馬病密切相關(guān)[3-6]，血清多肽對(duì)于一些惡性腫瘤的診斷也很有幫助[7]．除此以外，某些動(dòng)物在受到外界刺激時(shí)，會(huì)產(chǎn)生大量的具有抗菌活性的多肽，這些多肽不僅具有很強(qiáng)的殺菌能力，有的還可殺死腫瘤細(xì)胞[8]，這類(lèi)特殊的多肽被稱(chēng)為抗菌肽，目前并已被應(yīng)用于食品、飼料添加劑及藥物的開(kāi)發(fā)等．本文根據(jù)檢測(cè)技術(shù)的分類(lèi)，對(duì)檢測(cè)多肽的新方法研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對(duì)多肽檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展前景進(jìn)行展望．

1 質(zhì)譜法及其聯(lián)用方法

用質(zhì)譜所檢測(cè)出的多肽質(zhì)量譜圖，通常被稱(chēng)為指紋圖譜．質(zhì)譜檢測(cè)的多肽最大的優(yōu)勢(shì)在于穩(wěn)定性、重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確性高．目前將質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于多肽檢測(cè)主要有基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）方法、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS）方法以及毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）方法．

MALDI-TOF-MS法所用儀器主要由2部分組成：基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（MALDI）和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（TOF）．MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，電離過(guò)程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離．TOF的原理是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)，即測(cè)定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時(shí)間成正比．MALDI-TOF-MS法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高、分辨率高及自動(dòng)化程度高、分析速度快等特點(diǎn)，而且能滿(mǎn)足多肽組學(xué)和蛋白組學(xué)高通量檢測(cè)分析的要求．然而MALDI-TOF-MS法對(duì)多肽檢測(cè)時(shí)，它僅對(duì)含精氨酸的多肽有較高的精確度．2000年，Hale課題組提出將賴(lài)氨酸上的ε氨基修飾O-甲基異脲，使其變成高精氨酸，這樣使得賴(lài)氨酸也很容易被檢測(cè)到，此方法大大提高了檢測(cè)胰蛋白酶分解的多肽片段的靈敏度，并對(duì)于含有很高的（賴(lài)氨酸/精氨酸）含量比值的多肽的檢測(cè)非常有效[9]．2010年，Wu課題組首次報(bào)道了將半胱氨酸修飾的 Mn2+摻雜 ZnS納米顆粒（即Mn2+-doped ZnS@cysteine NPs）作為基質(zhì)，用MALDI-TOF-MS檢測(cè)多肽的方法[10]．與其他的基質(zhì)相比，如ZnS NPs、Zn@Cyseine NPs以及α-氰基-4-羥基肉桂酸（CHCA），在水相中合成的該Mn2+-doped ZnS@cysteine NPs納米基質(zhì)在檢測(cè)小分子多肽方面以及在檢測(cè)靈敏度方面更具優(yōu)越性，并且此方法成功應(yīng)用到了尿樣中多肽混合物的檢測(cè)．隨后，2011年Lie課題組研究出了簡(jiǎn)單、靈敏、高通量的用MALDI-TOF-MS檢測(cè)多肽的新方法，他們通過(guò)將量子點(diǎn)加入基質(zhì)中使其得以改善，檢測(cè)多肽及混合物時(shí)，靈敏度大大提高[11]．

以上2種方法均是通過(guò)改善基質(zhì)來(lái)提高多肽檢測(cè)的靈敏度．也有研究者通過(guò)改善樣品前處理過(guò)程，以達(dá)到提高檢測(cè)靈敏度的目的．2012年，Nadnudda等人設(shè)計(jì)了一種非常靈敏的用MALDI-MS法檢測(cè)血清中多肽的新方案，他們利用正電或者負(fù)電兩性均聚物形成反向膠束，對(duì)預(yù)先除去HSA和IgG的血清中的低豐度多肽如血管緩激肽、C4a、ITIH4等以及生物標(biāo)志物前列腺抗原（PSA）分別進(jìn)行選擇性的預(yù)富集處理，再利用MALDI-MS對(duì)經(jīng)過(guò)預(yù)富集處理后的樣品進(jìn)行檢測(cè)，靈敏度大大增強(qiáng)，檢測(cè)血管緩激肽、C4a、ITIH4檢出限分別為0.5、0.08、0.2 ng/mL，PSA的檢出限為0.5 ng/mL[12]．2013年，Lai課題組著重于改善MALDI-TOF質(zhì)譜法的免疫共沉淀的預(yù)處理步驟，設(shè)計(jì)了一種非常靈敏的檢測(cè)淀粉肽β1-28的新方法，并實(shí)現(xiàn)了其在人血漿中靈敏度低至6.14 pm的檢測(cè)[13]．他們通過(guò)提高抗體與小分子多肽的親和力，對(duì)其在復(fù)雜的人血漿基質(zhì)中進(jìn)行預(yù)富集．合成含有6E10和4GB兩種淀粉肽β1-28單克隆抗體組合而成的F(ab’)-(PEG)24小球，通過(guò)兩種抗體對(duì)目標(biāo)多肽的共同的親和作用力將其分離，使得檢測(cè)靈敏度大大增強(qiáng)．

除以上的一些方法以外，也有研究者對(duì)某些含有特殊氨基酸的多肽進(jìn)行了檢測(cè)．有數(shù)據(jù)表明97%的蛋白和17%的多肽片段都含有半胱氨酸，因此若能提高半胱氨酸的檢測(cè)靈敏度便能提高質(zhì)譜低豐度蛋白、多肽檢測(cè)靈敏度．2012年Shimada等人設(shè)計(jì)了 6種半胱氨酸的標(biāo)記物，大大提高了MALDI-TOF-MS檢測(cè)含有半胱氨酸的多肽的檢測(cè)靈敏度，從而也提高了親水性多肽、低豐度多肽的檢測(cè)靈敏度[14]．

然而，質(zhì)譜在檢測(cè)具有相同氨基酸組成但序列不同的多肽時(shí)，由于它們具有相同的分子量，給出等同的分子離子峰，因此不能滿(mǎn)足多肽結(jié)構(gòu)的解析工作．采用色譜或電泳分離技術(shù)與質(zhì)譜聯(lián)用是解決這一問(wèn)題的很好途徑．2003年，Thomas等人將液相色譜法與質(zhì)譜聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)了血管緊張肽Ⅱ、鈴蟾肽、緩激肽、黑化誘導(dǎo)神經(jīng)肽、神經(jīng)降壓肽和P物質(zhì)等多種多肽的檢測(cè)，檢出限低至1 ng/mL，線性范圍1-100 ng/mL，并隨后用質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)了含氯水中的多肽氧化產(chǎn)物的定性檢測(cè)[15]．2005年，Karine等人發(fā)展了一種將高場(chǎng)非對(duì)稱(chēng)波形離子遷移譜（FAIMS）與納米液相色譜-質(zhì)譜（nanoLC-MS）結(jié)合的方法，即nanoLC-FAIMS-MS，該法可從復(fù)雜的胰蛋白酶水解物中靈敏而選擇性地檢測(cè)多電荷的肽離子．FAIMS技術(shù)作為一種氣相離子分離技術(shù)，可以減少化學(xué)噪音，增強(qiáng)多肽的檢測(cè)信號(hào)，與傳統(tǒng)的nanoLC-MS技術(shù)比，信噪比提升了6~12倍，可檢測(cè)出的多肽的數(shù)量提升了 20%[16]．2006年，Mario等人利用LC-MS技術(shù)實(shí)現(xiàn)了人類(lèi)尿液中興奮劑胰島素類(lèi)似物的靈敏檢測(cè)，他們將固相微萃取技術(shù)與免疫親和純化技術(shù)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了人類(lèi)尿液中目標(biāo)物的濃縮富集和分離，隨后利用在線質(zhì)譜進(jìn)行定性，然后再通過(guò)LC-MS技術(shù)對(duì)賴(lài)脯胰島素（Humalog LisPro）、門(mén)冬胰島素（Novolog Aspart）以及賴(lài)谷胰島素（Apidra Glulisine）進(jìn)行了定量分析，檢出限低至0.05 ng/mL (9 fmol/mL)[17]．2009年，Andreas等人也利用LC-MS實(shí)現(xiàn)了人類(lèi)尿液中二十四肽促皮質(zhì)素的檢測(cè)，他們用表面覆蓋抗體的磁性小球?qū)δ繕?biāo)物進(jìn)行磁分離（免疫親和純化技術(shù)）預(yù)富集處理，隨后用LC-MS進(jìn)行定性定量分析，最后實(shí)現(xiàn)了尿樣中目標(biāo)物二十四肽促皮質(zhì)素的檢測(cè)，檢出限低至3 pg/mL[18]．2009年，劉麗紅等建立了一種氨基酸組成相同序列不同的多肽的LC-ESI-MS分析新方法．在反向色譜模式下，2種小分子三肽Gly-Phe-Ser和Gly-Ser-Phe實(shí)現(xiàn)了較好的分離，實(shí)驗(yàn)證實(shí)，流動(dòng)相組成及pH值對(duì)分離行為及檢測(cè)靈敏度具有重要影響，在以20mmol/L乙酸銨-水-乙腈（50:45:5，V/V/V）作為流動(dòng)相在pH7的條件下洗脫，該方法重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高、靈敏度高．此方法的建立對(duì)其他此類(lèi)氨基酸組成相同序列不同的蛋白質(zhì)及多肽的分離分析具有參考意義[19]．

與HPLC相比，毛細(xì)管電泳（CE）的分離效率更高、上樣量更少，是一種靈敏的多肽檢測(cè)方法．周?chē)?guó)華等以血管緊張素Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、P-物質(zhì)和生長(zhǎng)激素抑制劑混合物為測(cè)定對(duì)象，用CE-ESI-MS法分離鑒定了5種生物活性肽．pH為5.0和4.5的NH4Ac緩沖液能在LPA涂層柱和胺涂層柱上很好地分離上述5種肽類(lèi)混合物．在選擇的離子檢測(cè)模式下，檢出限（3δ）分別約為193、240、804、153和185 fmol，測(cè)定相對(duì)誤差（%）分別為0.015、-0.067、0.064、-0.031和0.074[20]．Varesio E.等建立了一種測(cè)定人血漿中 amyloid-β肽（Mr=4330.0，40個(gè)氨基酸）的CE-MS方法．并利用柱切換技術(shù)克服了毛細(xì)管柱底靈敏度，不易進(jìn)行體內(nèi)低濃度樣品測(cè)定的缺點(diǎn)．采用HP1100 MSD單級(jí)四級(jí)桿質(zhì)譜，選用ESI離子源，正離子檢測(cè)，采用SIM模式．最低檢測(cè)限為50ng/mL[21]．

2 多肽熒光光譜分析法

熒光光譜多肽分析法通常通過(guò)體系中多肽的含量所引起的體系熒光強(qiáng)弱的變化而實(shí)現(xiàn)多肽的檢測(cè)．2009年，Hamachi課題組設(shè)計(jì)了一種新型的針對(duì)雙磷酸化多肽的熒光探針 1-2Zn()Ⅱ，實(shí)現(xiàn)了 10-6mol/L雙磷酸化多肽的檢測(cè)．現(xiàn)有的2-2Zn( )Ⅱ探針對(duì)于不同位點(diǎn)磷酸化(i, i + n)的多肽都能檢測(cè)，但選擇性較差，而 1-2Zn()Ⅱ探針專(zhuān)門(mén)針對(duì)雙磷酸化位點(diǎn)為（i, i+1）的多肽，因此與現(xiàn)有的雙磷酸化多肽探針 2-2Zn()Ⅱ相比，性能更優(yōu)越，選擇性更好[22]．2010年，Lim等人合成了一種選擇性檢測(cè)半胱氨酸或者含 N-端半胱氨酸殘基多肽的熒光探針，該探針為不飽和醛基功能化的發(fā)色團(tuán)，該物質(zhì)與含巰基的半胱氨酸或者半胱氨酸殘基反應(yīng)后的生成物，可產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光，即產(chǎn)生與目標(biāo)物相關(guān)的“turn-on”模式的信號(hào)響應(yīng)[23]．近些年，隨著熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）火熱發(fā)展，F(xiàn)RET技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到了各類(lèi)生物和化學(xué)物質(zhì)的分析檢測(cè)之中[24-27]，多肽的檢測(cè)也不例外．2012年，Takahashi等人設(shè)計(jì)出了一種可檢測(cè)淀粉體多肽Aβ1-42的蛋白，并將其命名為CPYAB4，由熒光供體藍(lán)綠色熒光蛋白 CFP、熒光受體黃色熒光蛋白YFP以及連接序列GGS三部分構(gòu)成．體系中不含目標(biāo)物情況下，CPYAB4發(fā)生分子內(nèi)的FRET效應(yīng)，CFP熒光有效猝滅，熒光強(qiáng)度極弱；當(dāng)體系中含有目標(biāo)物淀粉體多肽Aβ1-42時(shí)，CPYAB4與其發(fā)生反應(yīng)，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，CFP與YFP之間距離發(fā)生變化，于是阻礙了CPYAB4分子內(nèi)的FRET效應(yīng)，CFP的熒光不能被有效猝滅，體系熒光大大增強(qiáng)，其增強(qiáng)程度與Aβ1-42的濃度密切相關(guān)[28]．

除了上述利用熒光方法檢測(cè)多肽以外，其他的一些光譜技術(shù)也逐漸深入到多肽檢測(cè)的領(lǐng)域中來(lái)．例如，在2005年Xie等人用拉曼光譜來(lái)表征氨基酸，通常磷酸化的氨基酸和多肽由于–OPO32-與–OPO3H-的存在隨著體系pH的變化而變化，而拉曼光譜中，980 cm-1和 1080 cm-1處的磷酸絲氨酸帶（–OPO3H-）和磷酸蘇氨酸帶（–OPO32-）容易受臨近基團(tuán)的影響，從而為磷酸化的氨基酸和多肽的表征帶來(lái)了困難，于是 Xie等人利用 drop coating deposition Roman（DCDR）方法很好地解決了以上問(wèn)題，順利地對(duì)不同pH體系中的磷酸質(zhì)子化的多肽和氨基酸進(jìn)行了表征[29]．另外，在 2010年，Mustafa等人利用橢圓偏振光譜測(cè)量的內(nèi)部全反射模式（TIRE）檢測(cè)β-淀粉樣肽Aβ（1-16），在該法中，利用Aβ（1-16）以及其單克隆抗體DE2直接免疫反應(yīng)而形成的復(fù)合物靜電吸附于金表面，從而實(shí)現(xiàn)了β-淀粉樣肽（1-16）在0.05 ng/ml ~ 5 ug/ml范圍內(nèi)的免標(biāo)記檢測(cè)[30]．隨后在2011年，Wang等人設(shè)計(jì)了一種共振光散射檢測(cè)β-淀粉肽1-42的方法．基于納米金聚集后產(chǎn)生更強(qiáng)的光散射信號(hào)，目標(biāo)分子的出現(xiàn)會(huì)引起納米金的聚集狀態(tài)．當(dāng)體系中沒(méi)有Aβ1-42時(shí)，預(yù)先存在的Zn2+首先會(huì)引起生物素修飾的Aβ1-16聚集，親和素修飾的納米金也因表面的親和素與生物素間較強(qiáng)的作用而產(chǎn)生聚集，因而產(chǎn)生很強(qiáng)的共振光散射信號(hào)；體系中含有Aβ1-42時(shí)，Zn2+與 Aβ1-42 作用力更強(qiáng)而優(yōu)先與之發(fā)生反應(yīng)，使得之前的納米金聚集反應(yīng)無(wú)法順利進(jìn)行，共振光散射信號(hào)明顯減弱，其信號(hào)減弱程度與目標(biāo)物Aβ1-42的濃度密切相關(guān)[31]．

總之，利用光譜技術(shù)檢測(cè)多肽，通常無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理分離技術(shù)，且光譜技術(shù)設(shè)計(jì)的多肽傳感器靈活多變，適用于各種不同體系下的多肽檢測(cè)．

3 其他多肽檢測(cè)法

Hou等發(fā)展了一種簡(jiǎn)單、快速，超靈敏的檢測(cè)生物素修飾的多肽的方法[32]．該方法首先將生物素修飾的多肽固載于硝化纖維膜上，通過(guò)抗體與生物素之間的反應(yīng)，抗體修飾的納米金發(fā)生反應(yīng)后形成紅點(diǎn)，紅點(diǎn)的強(qiáng)度通過(guò)Quantity One（一種定量分析軟件）記錄．檢出限低至100 amol，檢出范圍是1pmoL~1μmol．隨后用銀進(jìn)行信號(hào)放大，靈敏度低至100 zmol，檢出范圍100 zmoL~100 fmol．再如，Brambilla等人將毛細(xì)管電泳與激光誘導(dǎo)熒光結(jié)合（CE-LIF），有效地檢測(cè)并監(jiān)控了β-淀粉樣多肽與聚合納米顆粒的相互作用，為CE-LIF法的開(kāi)發(fā)提供了一定的實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)，開(kāi)辟了新的研究前景[33]．Kawulka 等采用同位素標(biāo)記技術(shù)，以13C、15N 標(biāo)記化合物的核磁共振（NMR）新技術(shù)測(cè)定了一種分離自一種細(xì)菌Bacillus subtilis 中新的抗微生物多肽Subtilosin A的結(jié)構(gòu)，最新出現(xiàn)的HPLC-MS-NMR聯(lián)用集合了HPLC-MS 與HPLC-NMR 這兩種聯(lián)用技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，使得在線獲得更多的多肽產(chǎn)物樣品的結(jié)構(gòu)信息成為可能[34]．Louden 等以D2O 為流動(dòng)相在線聯(lián)用HPLC-UV-IR，-HNMR-MS技術(shù)分離分析了Sileneotites，Silenenutans，Silenef rivaldiskyana的提取物中的20 種蛻皮激素和蛻皮類(lèi)固醇[35]．楊茜璐等建立了一種非探針標(biāo)記型磷酸化多肽的電化學(xué)檢測(cè)方法，該方法以N，N-二（羧甲基）–L-賴(lài)氨酸（Lys-NTA）和Fe3+修飾的金電極作為磷酸化多肽的捕獲和傳感界面，利用磷酸化多肽能夠與之形成金屬離子螯合物而發(fā)生特異性結(jié)合并引起電極表面修飾層通透性改變等特點(diǎn)，采用鐵氰化鉀作為電化學(xué)指示劑，用循環(huán)伏安法和交流阻抗法對(duì)磷酸化多肽的結(jié)合進(jìn)行表征和檢測(cè)．磷酸化多肽濃度在5~75 μmo l/L時(shí)，循環(huán)伏安圖中峰電流隨著磷酸化多肽濃度的增大而增大，而非磷酸化多肽不能引起峰電流變化[36]．

4 展 望

研究者已經(jīng)開(kāi)發(fā)出多種依賴(lài)不同的檢測(cè)技術(shù)的多肽檢測(cè)方法，并已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了多肽超高靈敏性，高選擇性的檢測(cè)，并為生物醫(yī)藥、臨床病理論等方面的研究提供了強(qiáng)有力的支持．然而，很多多肽片段因其分子量小，結(jié)構(gòu)普通，對(duì)它們的在復(fù)雜基質(zhì)中（如尿液，血漿等）超痕量的檢測(cè)仍然存在著巨大的挑戰(zhàn)，多肽檢測(cè)方法的開(kāi)發(fā)仍然還有很大的探索空間．尤其是電化學(xué)方法作為新興的多肽檢測(cè)方法，具有所用儀器簡(jiǎn)單、靈敏、快速等特點(diǎn)，是一個(gè)很有發(fā)展?jié)摿Φ姆治黾夹g(shù)．

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Peptide Detection: A Brief Review

LUAN Chonglin, JIANG Xiaohua, JIN Gang, DAI Jianguo

（School of Applied Chemistry and Biotechnology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen, Guangdong 518055,China）

In this paper, a review was made on study of mass spectrometry, liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), capillary electrophoresis-mass spectrometry (CE-MS), spectroscopic method and other approaches in detection of polypeptide. Mass spectrometry approach is characterized by good stability，reproducibility and accuracy. LC-MS or CE-MS can detect polypeptide with the same amino acid composition but different sequence of amino acid. Spectrometry can detect Polypeptide with great flexibility to transduce the detecting signals without sample pretreatment and separation, but it cannot conduct a qualitative analysis of polypeptide, which limits its wide application.

peptide; mass-spectrum; chromatograph; fluorescence; detection

O656.31

A

1672-0318（2014）05-0054-06

10.13899/j.cnki.szptxb.2014·05, 011

2014-01-15

*項(xiàng)目來(lái)源：深圳市基礎(chǔ)研究計(jì)劃資助項(xiàng)目（No. 20120531204110）

欒崇林（1965-），山東人，博士，教授，主要研究方向：電化學(xué)傳感技術(shù)．