錢國華， 張夢玲， 徐玲玲， 敬應(yīng)春*

（1.上海雷允上藥業(yè)有限公司， 上海 201401； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)， 上海 201203）

SPE-HPLC法測定珍菊降壓片中鹽酸可樂定的含量均勻度

錢國華1， 張夢玲1， 徐玲玲2， 敬應(yīng)春1*

（1.上海雷允上藥業(yè)有限公司， 上海 201401； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)， 上海 201203）

目的 采用固相萃取-高效液相色譜 (SPE-HPLC) 聯(lián)用技術(shù)建立珍菊降壓片 (野菊花膏粉、 珍珠層粉、 蘆丁、氫氯噻嗪、 鹽酸可樂定) 中鹽酸可樂定的含量均勻度測定方法。 方法 以 Cleanert SCX-SPE陽離子固相萃取小柱對樣品進(jìn)行前處理， 色譜柱為 Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm， 5 μm) ， 流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液 (10 ∶90)， 體積流量 1.0 mL/min， 柱溫 30 ℃， 檢測波長 220 nm。 結(jié)果 鹽酸可樂定在 1.234 ～123.4 ng的測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好； 平均回收率為96.37%， RSD為 0.18%。 6 批珍菊降壓片中鹽酸可樂定的含量均勻度分別為12.32、 17.17、10.95、 9.36、 7.77、 11.35。 結(jié)論 該方法有效地消除了陰性干擾， 專屬性、 靈敏度、 重復(fù)性和準(zhǔn)確度良好， 為珍菊降壓片中鹽酸可樂定的含量均勻度評價提供了可靠的技術(shù)手段。

珍菊降壓片；鹽酸可樂定；固相萃取；高效液相色譜法；含量均勻度

珍菊降壓片為臨床常用降壓藥，其處方由野菊花膏粉、珍珠層粉、蘆丁、氫氯噻嗪、鹽酸可樂定構(gòu)成，其中鹽酸可樂定為α受體激動劑，具中樞降壓作用，是主要有效成分。鹽酸可樂定在珍菊降壓片中理論含有量為 30 μg/片， 量少， 活性強(qiáng)，易出現(xiàn)含量均勻度方面的質(zhì)量問題，造成用藥安全隱患。由于鹽酸可樂定只有紫外末端吸收，且量少， 陰性干擾嚴(yán)重， 使其 HPLC法定量檢測異常困難，因此建立其專屬、靈敏、準(zhǔn)確的定量測定方法成為珍菊降壓片質(zhì)量控制和工藝評價需要首先解決的技術(shù)難題。珍菊降壓片所執(zhí)行的部頒標(biāo)準(zhǔn)中無鹽酸可樂定定量測定項目。現(xiàn)有文獻(xiàn) ［1-8］中基本都采用溶劑萃取與pH調(diào)節(jié)相結(jié)合的方式進(jìn)行樣品前處理，此類方法操作繁瑣，準(zhǔn)確度和可操作性存在較大問 題， 不 適用 于 日 常檢 測。 高 蘇 亞 等［9］、SU Shengmin 等［10］、 丁飛等［11］采用毛細(xì)管電泳技術(shù)同時測定珍菊降壓片中的鹽酸可樂定、氫氯噻嗪、蘆丁，取得較好的效果，但因儀器的普及問題， 難以在日常檢驗中推廣。 許諳等［12］將 C18固相萃取小柱用于樣品前處理，在測定珍菊降壓片中的鹽酸可樂定時取得了較好的效果，提供了新的思路。本實驗根據(jù)目標(biāo)組分與干擾組分間的電荷性質(zhì)差異， 采用 SPE-HPLC聯(lián)用技術(shù)，以陽離子固相萃取技術(shù)有效消除了鹽酸可樂定測定時的陰性干擾，顯著改善了方法的專屬性、靈敏度、重復(fù)性和準(zhǔn)確度，為珍菊降壓片的質(zhì)量控制提供了可靠的技術(shù)手段。

1 儀器與材料

Agilent1200 高 效 液 相 色 譜 儀 (VMD檢 測 器，自動進(jìn)樣器)、Agilent1100 高效液相色譜儀 (DAD檢測器， 自動進(jìn)樣器)， 美國安捷倫科技； LC-10AT高效液相色譜儀 (SPD檢測器)， 日本島津公司； BS224S 電子天平， Sartorius； SHZ-B水浴恒溫震蕩器，上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；CQ-250 型超聲波清洗器［(33 ±3)kHz，250W)］，上海新超超聲波儀器有限公司； SBEQ-CR1012 固相萃取 裝置， 德 國 CNW 公 司； Cleanert SCX-SPE (200 mg/6 mL) ， Agela Technologies公 司； Milli-Q超純水機(jī)，美國 Milli-Pore公司。

鹽酸可樂定對照品 (批號 H11279)， 美國 USP公司； 珍菊降壓片 (批號分別為 100717、 101031、101124、110406、 120309、 120310、120311，鹽酸可樂定標(biāo)示含有量為 30 μg/片)， 上海雷允上藥業(yè)有限公司； 珍菊降壓片陰性顆粒 (缺鹽酸可樂定)， 實驗室自制； 乙腈為色譜純， Merck； 超純水為實驗室自制；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液 取鹽酸可樂定對照品適量，用 0.1 mol/L的鹽酸溶液制成每 1 mL含鹽酸可樂定 1.2 μg的溶液， 即得。

2.1.2 供試品溶液 取珍菊降壓片 10 片， 置 10個磨口三角燒瓶中， 分別加入直徑4～5 mm玻璃珠 15 g，精密加入 0.1 mol/L鹽酸溶液 25 mL，密塞， 振搖至片芯完全破碎，超聲提取 15 min， 搖勻， 濾過， 收集續(xù)濾液備用； 取 SCX固相萃取小柱 (200 mg/6 mL)， 依次用甲醇、 0.1 mol/L鹽酸各5mL淋洗， 備用； 精密量取續(xù)濾液5.0mL上于SCX固相萃取小柱中， 待溶液流干后，依次用水、50%甲醇各 5 mL淋洗 (抽干)， 棄去淋洗液， 再用含2%氨水的 50%甲醇溶液 5 mL洗脫 (抽干)，收集洗脫液于10 mL量瓶中， 加入3 滴濃鹽酸， 再用 0.1 mol/L鹽酸溶液定容， 搖勻， 即得供試品溶液。

2.1.3 陰性對照溶液 取缺鹽酸可樂定陰性顆粒適量， 研成細(xì)粉， 取細(xì)粉 0.25 g， 按 “2.1.2” 項方法操作，即得陰性對照溶液。

2.2 色 譜 條 件與 系 統(tǒng) 適 應(yīng) 性 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm， 5 μm)； 流動相為乙腈-0.05%磷酸溶液 (10 ∶90)； 體積流量 1.0 mL/min；柱溫 30 ℃； 檢測波長 220 nm；進(jìn)樣量20 μL。 以鹽酸可樂定峰計算， 理論塔板數(shù)不低于8 000， 分離度不小于 2.0， 峰純度不小于 998， 該方法專屬性和系統(tǒng)適用性滿足定量測定要求。對照品、 供試品、陰性對照圖譜見圖1。

圖1 鹽酸可樂定測定 HPLC圖譜Fig.1 HPLC chromatogram s of content determ ination of clonidine hydrochloride

2.3 線性關(guān)系考察 精密量取對照品溶液 (質(zhì)量濃 度 1.234 μg/m L)1、 5、 10、 20、 30、 60、100 μL， 注入液相色譜儀，依法測定。以對照品進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)， 以鹽酸可樂定峰面積為縱坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得回歸方程 y=2.966 2x+ 0.048 5， r=0.999 99。 結(jié) 果 表 明 在 1.234 ～123.4 ng的進(jìn)樣范圍內(nèi)， 該方法線性關(guān)系良好。

2.4 穩(wěn)定性考察 取同一份供試品溶液 (批號100717)， 分別在制備后 0、 4、 8、 12、 24 h 進(jìn)樣檢測， 以測得的鹽酸可樂定峰面積計， RSD為0.24%。 表明供試品溶液在 24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 儀器精密度考察 取對照品溶液 20 μL， 重復(fù)進(jìn)樣6 次， 以測得的鹽酸可樂定峰面積計， RSD值為0.08%。 表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗 取同一批珍菊降壓片供試品(批號100717)，按供試品溶液制備方法平行制備6份供試液，依法測定，以測得的供試品中鹽酸可樂定計， RSD為0.44%。 表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 中間精密度試驗 取同一批珍菊降壓片供試品，分別考察不同時間、不同人員、不同儀器三個變動因素下的中間精密度。以測得的供試品中鹽酸可樂定計， 不同時間中間精密度 RSD值為 0.40%，不同人員中間精密度 RSD值為 1.27%， 不同儀器中間精密度 RSD值為 0.44%。表明該方法中間精密度良好。

2.8 回收率試驗 取鹽酸可樂定對照品貯備液(123.4 μg/mL)，用 0.1 mol/L的鹽酸溶液分別稀釋成質(zhì)量濃度為 0.987、 1.234、 1.481 μg/mL的對照品溶液；精密稱取珍菊降壓片陰性顆粒細(xì)粉(缺鹽酸可樂定)9 份， 每份 0.25 g， 精密稱定，分別置磨口三角燒瓶中，設(shè)高、中、低3種加入量， 分別精密加入 0.987、 1.234、 1.481 μg/mL對照品溶液 25 mL， 按 “2.1.2” 項方法制備供試品溶液， 依法測定。 平均回收率為 96.37%， RSD值為 0.18%， 表明該方法準(zhǔn)確度良好。 結(jié)果見表 1。

表1 回收率試驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

2.9 樣品測定 取 6 批上海雷允上藥業(yè)生產(chǎn)的珍菊 降 壓 片， 每 批 取 10 片， 編 號 1 ～10， 按“2.1.2” 項制備供試品溶液， 依法測定每片中的鹽酸可樂定， 并按 《中國藥典》 2010 年版二部附錄 X E項下規(guī)定計算含量均勻度。 結(jié)果見表2。

表2 6批珍菊降壓片中鹽酸可樂定測定結(jié)果及其含量均勻度計算 （%）Tab.2 Results of content uniform ity determ ination of six batches of Zhenju Jiangya Tablets（ %）

表 2 中批號 101031、 101124、 110406 為老工藝樣品， 批號 120309、 120310、 120311 為改進(jìn)后的新工藝樣品。《中國藥典》 規(guī)定含量均勻度限度標(biāo)準(zhǔn)為不超過15， 3 批老工藝樣品含量均勻度數(shù)值偏大， 其中批號 101124 已超過限度，不符合規(guī)定；3批新工藝樣品含量均勻度均符合規(guī)定，且數(shù)值較小，說明新工藝較好地解決了原工藝的含量均勻度問題。

3 討論

3.1 樣品破碎方法的考察 在珍菊降壓片含量均勻度測定的文獻(xiàn)報道中，有采用玻璃棒搗碎的方法進(jìn)行樣品破碎的， 該法費(fèi)時費(fèi)力，可操作性差［8］；有將藥片置溶劑中直接超聲溶解，但由于藥片中黏性成分的影響，需要長時間超聲才能完成，給測定結(jié)果帶來不確定因素［13］。 本實驗采用加入玻璃珠，在震蕩器上震蕩破碎的方法進(jìn)行樣品前處理，對玻璃珠用量、破碎時間等進(jìn)行了優(yōu)化，使方法更加簡便快捷，易于操作。

3.2 含量均勻度代替成分定量測定的探討 成分定量測定采用一定數(shù)量的樣品研碎后取樣測定，含量均勻度測定則是直接對10片樣品分別進(jìn)行測定，再根據(jù)測定結(jié)果進(jìn)行含量均勻度計算，從兩種方法的原理來看，含量均勻度既能反應(yīng)目標(biāo)成分在樣品的分布情況，又能給出準(zhǔn)確的含有量結(jié)果，在微量制劑的質(zhì)量控制中更有意義。因此在多組分復(fù)方制劑的質(zhì)量控制中可以考慮采用含量均勻度測定后得到的成分平均含有量代替成分定量測定結(jié)果，在充分保證各指標(biāo)成分質(zhì)量可控的前提下，適當(dāng)縮減檢測項目，降低檢測工作量，節(jié)省檢測成本。

3.3 含量均勻度的改進(jìn) 珍菊降壓片在生產(chǎn)中采用一步制粒工藝，由于處方中鹽酸可樂定用量極低，生產(chǎn)控制比較困難，極易出現(xiàn)含量和含量均勻度問題。為解決含量均勻度問題，對制粒工藝進(jìn)行了局部改進(jìn)，新工藝調(diào)整了物料加入順序，在不改變處方，不增加成本的情況下顯著改善了產(chǎn)品含量均勻性，使產(chǎn)品的批間質(zhì)量更加穩(wěn)定。新工藝的改進(jìn)兼顧了產(chǎn)品質(zhì)量和成本效益，對保證臨床用藥安全具有重要意義，具有良好的應(yīng)用價值。

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Uniform ity of dosage units of clonidine hydrochloride in Zhenju Jiangya Tablets by SPE-HPLC

QIAN Guo-hua1， ZHANGMeng-ling1， XU ling-ling2， JING Ying-chun1*
(1.Shanghai Lei Yun Shang Pharmaceutical Co.， Ltd， Shanghai201401， China； 2.Shanghai University of TCM， Shanghai 201203， China)

Zhenju Jiangya Tablets； clonidine hydrochloride； solid phase extraction； HPLC；contentuniformity

R944

:A

:1001-1528(2014)02-0321-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.023

2013-07-12

上海市科學(xué)技術(shù)委員會中藥現(xiàn)代化專項 (09DZ1977300)

錢國華 (1960—) ， 男， 工程師。 研究方向: 中藥新藥。 Tel:(021)64275618， E-mail:ghqian@shlys.com

*通 信 作 者: 敬 應(yīng) 春 (1979 —) ， 男， 碩 士， 高 級 工 程 師。 研 究 方 向: 中 藥 新 藥。 Tel:(021)37565589， E-mail:jorgyingchun @163.com