萬三連， 梁 鵬， 劉文波， 張 宇， 繆衛(wèi)國， 鄭服叢

（海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實驗室／海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228）

橡膠樹與白粉病菌Oidium heveae親和互作組織細(xì)胞學(xué)研究

萬三連， 梁 鵬， 劉文波， 張 宇， 繆衛(wèi)國*， 鄭服叢*

（海南省熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實驗室／海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，?？?570228）

摘要白粉病是橡膠樹生產(chǎn)中最重要的病害之一，是由粉孢屬病菌Oidium heveae Steinm.引起。目前，對該病原菌在寄主中侵染行為及其與寄主互作的組織細(xì)胞學(xué)尚缺乏系統(tǒng)研究。本文利用顯微技術(shù)，結(jié)合多種染色方法，觀察了橡膠樹白粉菌侵染橡膠樹葉組織的細(xì)胞學(xué)變化及寄主的抗性反應(yīng)。O.heveae在寄主上發(fā)育要經(jīng)歷5個關(guān)鍵發(fā)育時間點(diǎn)，即分生孢子萌發(fā)高峰（4 hpi）、附著胞形成高峰（8 hpi）、侵入結(jié)構(gòu)（初生吸器）形成高峰（15 hpi）、次生菌絲形成高峰（24 hpi）、分生孢子梗形成高峰（5 dpi）；分生孢子萌發(fā)侵入寄主前，其能量來自自身貯存的能量物質(zhì)。在互作過程中，病原菌初生吸器形成之后，橡膠樹葉組織開始出現(xiàn)明顯的氧暴發(fā)、胼胝質(zhì)和乳突等抗性反應(yīng)，活性氧在橡膠樹與病原菌互作中起到了重要的作用，當(dāng)橡膠樹葉片中活性氧積累較低時，有利于O.heveae的發(fā)育及入侵，活性氧積累較高時，則引發(fā)寄主氧暴發(fā)等以阻止病原菌進(jìn)一步擴(kuò)展。O.heveae在寄主上發(fā)育的5個關(guān)鍵發(fā)育時間點(diǎn)分別屬于病原菌侵染前期、潛育期和侵染后期，橡膠樹葉組織早期親和互作與中后期非親和互作保持了專性寄生菌與寄主間發(fā)育平衡的進(jìn)化關(guān)系。

關(guān)鍵詞橡膠樹； 橡膠樹白粉菌； 侵染； 細(xì)胞學(xué)

橡膠樹是熱帶及亞熱帶的重要經(jīng)濟(jì)林木，橡膠樹白粉菌（Oidium heveae Steinm.）是引起橡膠樹白粉病的病原菌［1］。橡膠樹白粉病最早1918年報道于印尼爪哇，自1951年中國首次報道在海南發(fā)現(xiàn)后，相繼在中國的各植膠區(qū)都有發(fā)現(xiàn)［2-3］，目前已成為我國早春防治橡膠樹“兩病一蟲”的重點(diǎn)［3］，該病在適宜條件下具有發(fā)病快危害重的特點(diǎn)，嚴(yán)重感病時還可能造成第二次落葉［2，4-5］，使干膠產(chǎn)量明顯減少。橡膠樹白粉菌是一種活體專性寄生菌，無法進(jìn)行離體培養(yǎng)，國內(nèi)外學(xué)者對橡膠樹白粉病病原菌進(jìn)行了一定的探索性研究，在病原生物學(xué)方面，對其在葉片上的入侵情況進(jìn)行了初步的形態(tài)學(xué)方面的描述［6-9］。在寄主與病原菌互作方面，一些研究認(rèn)為寄主角質(zhì)層的厚度與抗病性存在一定正相關(guān)性［10-11］，而原生質(zhì)體大小僅在橡膠抗病品系的抗病性中可能具有重要作用，但研究者們未在橡膠品系中發(fā)現(xiàn)過敏性壞死反應(yīng)，以及其他主動抗病反應(yīng)，如胼胝體、木栓層等［11］。前人的研究結(jié)果多集中于橡膠樹白粉病菌侵染中后期寄主的表現(xiàn)行為，以及對該病害防治措施的探討，而對于病原菌在橡膠樹葉片上的具體侵染行為、侵染時期及對病原菌與寄主互作尚缺乏詳細(xì)的研究，尤其對于病原菌侵染前期或入侵早期的研究相對較少。橡膠樹白粉病菌4～8 d就繁殖一代，病害發(fā)生快［5］，因此探究橡膠樹白粉菌在寄主上的各發(fā)育關(guān)鍵性階段，及侵染后寄主細(xì)胞做出的反應(yīng)，有助于理解病原菌對寄主侵染行為及橡膠樹感病的原因，對提前預(yù)警流行、及早采取防治對策阻止病害的傳播與危害具有重要的理論意義和應(yīng)用價值。

由于禾谷類等寄主在受到白粉菌等病原物入侵時，可能會產(chǎn)生乳突、胼胝質(zhì)或者過敏性反應(yīng)來阻止病原菌的入侵或者入侵后的擴(kuò)展，可能會激發(fā)活性氧的迸發(fā)，而活性氧迸發(fā)被認(rèn)為是過敏性的特征反應(yīng)，也是植物與病原菌應(yīng)答的、最早期防衛(wèi)反應(yīng)之一［12-13］，同時被侵染的細(xì)胞及其鄰近細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)可能會形成顆粒狀或者細(xì)胞會潰散［11，14］。在白粉菌與大麥及小麥的互作研究中表明，不管是通過加固細(xì)胞壁（形成有效的乳突），或通過誘導(dǎo)過敏性反應(yīng)［13］，H2O2在寄主對白粉菌的抗性中起到了非常重要的作用。但是到目前為止，在有關(guān)白粉菌與橡膠樹的互作研究中還沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)的報道。

本研究的目的是檢查橡膠樹白粉病在寄主葉片上的早期病狀并且利用本實驗室單斑分離并保存的橡膠樹白粉菌（O.heveae）HO-73菌株，與橡膠樹品系‘熱研73-3-97’組成親和性互作組合，在人工控制的環(huán)境下，利用Lugol、Nile Red、DAB及考馬斯亮藍(lán)等染色技術(shù)，結(jié)合顯微技術(shù)觀察白粉菌侵染橡膠樹葉片組織時的早期癥狀及確定分生孢子的萌發(fā)以及侵染過程的各關(guān)鍵時間點(diǎn)，同時觀察了寄主對病原菌入侵做出的反應(yīng)。通過明確白粉菌與橡膠樹葉片互作時的各關(guān)鍵時間點(diǎn)，以及H2O2和胼胝質(zhì)是否在寄主早期防衛(wèi)反應(yīng)中起到一定的作用，為揭示橡膠樹葉片與白粉菌互作機(jī)制及對橡膠白粉菌的抗病機(jī)理奠定基礎(chǔ)，并可能為橡膠樹白粉病提前進(jìn)行更經(jīng)濟(jì)有效的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

橡膠樹品系：‘熱研73-3-97’，本試驗均采用大古銅期葉片，葉片顏色為古銅色且柔軟。

供試菌種：采自海南省儋州市橡膠林，經(jīng)單斑分離純化保存的橡膠樹白粉菌菌種HO-73，接種至橡膠樹大古銅期葉片上，并保持12 d，在接種前24 h輕搖感病葉片以除去老死孢子，采用24時齡的新生的白粉菌孢子作為本試驗所用菌種。

1.2 接種方法

為有效防止自然病原侵染，試驗在隔離的恒溫恒濕培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行，同時對將要接種植株的新梢，在抽芽時即進(jìn)行套袋隔離。選擇橡膠樹幼苗大古銅期葉片，取1×106個／m L分生孢子菌懸液10μL定點(diǎn)接種橡膠樹葉片，接種后置于溫度20～23℃、濕度＞60%的溫室內(nèi)。試驗設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)30株。

1.3 光鏡樣品制備及顯微觀察

1.3.1 考馬斯亮藍(lán)染色

將接種病原菌0、4、8、12、15、24、48 h及3、5、7 d后的橡膠樹葉片分別取樣，每次用打孔器隨機(jī)取下直徑為1.5 cm的葉碟3片，參照Wolf等［15］的考馬斯亮藍(lán)染色方法染色。染色后，存貯于V（冰乙酸）∶V（甘油）∶V（水）＝5∶20∶75的混合液中，以水為浮載劑，采用光學(xué)顯微鏡（Olympus BX51）觀察和記載病原菌在寄主葉面上的分生孢子萌發(fā)、附著胞形成、初生或者次生菌絲形成的時間和比率（%）等，每個處理隨機(jī)統(tǒng)計100個孢子，而分生孢子梗的形成時間則隨機(jī)統(tǒng)計30個孢子，高峰期以觀察靶標(biāo)超過觀察個體總量的50%計算。

1.3.2 寄主細(xì)胞應(yīng)對橡膠樹白粉菌侵染的H2O2原位檢測

按照1.3.1中的采樣方法取樣，參照Miao等［16］的DAB染色法，并結(jié)合Stone等［17］的苯胺藍(lán)染色法，將染色后的樣品用50%的甘油固定保存，鏡檢時以水為浮載劑，用光學(xué)顯微鏡（Olympus BX51）觀察并拍照，通過定性觀察葉片是否出現(xiàn)紅褐色沉淀及沉淀的多少，反映葉片產(chǎn)生H2O2的強(qiáng)弱；利用苯胺藍(lán)來檢測胼胝質(zhì)的形成，在395 nm波長的紫外激發(fā)光下觀察到藍(lán)色光，用Olympus BX51來觀察染色的葉片，分別在接種0、4、8、12、15、24、48 h觀測并記載乳突形成率、胼胝質(zhì)形成率及過敏性反應(yīng)形成率（%）；每個處理隨機(jī)檢查30個侵染點(diǎn)。

1.3.3 寄主細(xì)胞壞死斑的觀察

按照1.3.1中的采樣方法取樣，采用Vogel等［18］的臺盼藍(lán)染色，檢測寄主葉組織中的壞死斑及真菌菌絲。首先用乙醇乳酚清洗脫色，乙醇乳酚包含1體積的乳酚（V酚∶V甘油∶V乳酸∶V水＝1∶1∶1∶1）及2體積的乙醇，然后用乳酚沖洗后，將樣品置于含250μg／m L臺盼藍(lán)染液的試管中，沸水浴2 min，緊接著冷卻1 h，隨后在乳酚中脫色1 h。最后，樣品保存于50%的甘油中，鏡檢時以水為浮載劑，用光學(xué)顯微鏡（Olympus BX51）觀察是否存在壞死斑，記錄并拍照。

1.3.4 Lugol染色及Nile Red染色

將供試白粉菌置于玻片上，采用Lugol及Nile Red兩種染色方法［19］，分別對玻片表面的HO-73分生孢子的萌發(fā)過程進(jìn)行染色觀察。Lugol染色法是將樣品玻片直接置于Lugol染液中迅速染色，在光學(xué)顯微鏡下分生孢子中糖原呈棕黃色，淀粉呈藍(lán)色。Nile Red染色法是直接將樣品玻片置于Nile Red染液中染色5～10 min，用PBS（phosphate buffer solution，PBS）沖洗3次，于450～490 nm激發(fā)光下觀察。Lugol染液的組成：60 mg／L KI，10 mg／L I2，0.1%Triton X-100（9-diethylamino-5H-benzo［a］phenoxazine-5-one；Sigma）。Nile Red染液的組成：50 mmol／L Tris／maleate緩沖液（p H 7.5），20 mg／mL PVP（polyvinylpyrrolidone，PVP），2.5 mg／mL Nile Red噁酮，0.1%Triton X-100。

1.4 掃描電鏡樣品制備及觀察

按照1.3.1中的采樣時間進(jìn)行取樣，將樣品切成約0.5 cm2小塊，參照康振生等［20-21］方法，制備用于掃描電鏡檢查的樣品：在4%戊二醛（PBS，p H＝6.8）中固定8 h，之后用0.1 mol／L的PBS漂洗3次并浸泡8 h，用系列乙醇（30%、50%、70%、75%、80%、85%、90%、95%乙醇）分別脫水20 min；100%乙醇脫水置換3次，每次20 min；醋酸異戊酯交換處理2次，每次30 min；CO2臨界點(diǎn)干燥，離子濺射鍍金后，將處理好的樣品置于掃描電鏡（日立Hitachi S-3000N）下拍照觀察。每處理重復(fù)3次。

1.5 共聚焦顯微鏡樣品制備及觀察

按照1.3.1中的采樣時間進(jìn)行取樣，首先用乙醇乳酚清洗脫色后，參照Xu等［22］的方法，將樣品置于含DAPI染液中染色5～10 min，用PBS沖洗3次，于紫外光下，智能激光掃描共聚焦顯微鏡（OLYMPUS，F(xiàn)V10i）觀察。DAPI染液的組成：1μg／m L DAPI（Beyotime）和0.1%Triton X-100（9-diethylamino-5 H-benzo［a］phenoxazine-5-one；Sigma）溶于PBS溶液中。

1.6 橡膠樹葉組織內(nèi)H2O2含量測定

H2O2可以與鉬酸作用生成一種絡(luò)合物，在405 nm處測定其生成量可計算出H2O2的量。參照J(rèn)iang等［23］的方法，分別于接種后0、0.5、2、4、8、12、15、24、30、36 h，采用直徑1 cm打孔器取橡膠樹葉片，使用H2O2測定試劑盒（南京建成生物工程研究所），按照試劑盒的說明書測定橡膠樹葉組織內(nèi)H2O2含量，每個樣進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，并設(shè)健康的橡膠樹葉片為對照。

2 結(jié)果

2.1 白粉菌侵染橡膠樹葉組織過程中的發(fā)育關(guān)鍵時間點(diǎn)

運(yùn)用光學(xué)顯微鏡和掃描電鏡技術(shù)對白粉菌在感病寄主上侵染過程的組織病理學(xué)及超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。試驗結(jié)果表明，O.heveae在感病寄主橡膠樹‘熱研73-3-97’上侵染過程分6個階段（圖1～3）：分生孢子附著、分生孢子萌發(fā)、附著胞形成、吸器產(chǎn)生、菌絲形成與生長、分生孢子形成。分生孢子（圖2a）落于葉片表面2 h后，少量分生孢子開始從其近末端萌發(fā)長出初生芽管（圖2b），或分叉生長，4 hpi（hours post inoculation，hpi）達(dá)到分生孢子萌發(fā)高峰期（圖1），每個分生孢子可產(chǎn)生1條芽管，有極少數(shù)長出2條芽管，隨后初生芽管的頂端細(xì)胞形成橢圓或球狀突起（圖2b，c），而后逐漸膨大形成附著胞（圖2c、圖3a，8 hpi），附著胞與芽管之間有隔膜（圖3a，15 hpi），附著胞緊貼于寄主的表面。附著胞由于液泡的聚集形成，從附著胞的中間產(chǎn)生垂直于寄主的侵入釘（圖2e），侵入釘作用于寄主的角質(zhì)層及表皮細(xì)胞，若第一次侵染未成功便在附著胞另一側(cè)產(chǎn)生分瓣，形成耳垂?fàn)罱Y(jié)構(gòu)，以進(jìn)行第二次侵染（圖2d、圖3a，8 hpi），8 hpi達(dá)到附著胞形成高峰期（圖1）。在附著胞形成時期，橡膠樹白粉菌分生孢子中的細(xì)胞質(zhì)通過芽管積聚到附著胞，并形成一定的膨壓，導(dǎo)致寄主細(xì)胞的葉片有極輕微的下凹現(xiàn)象（圖2d、圖4b），這說明病原菌侵入寄主的時候可能產(chǎn)生了一定的機(jī)械壓力。多數(shù)分生孢子都會經(jīng)歷兩次或者兩次以上的侵染嘗試，從而形成耳垂?fàn)畹母街?5 hpi后，侵入釘成功進(jìn)入到葉片表皮細(xì)胞后，開始發(fā)揮其功能，末端膨大，形成不規(guī)則狀吸器（圖2d），并獲取寄主體內(nèi)營養(yǎng)。15 hpi從附著胞芽管分化生成次生菌絲（圖3a），24～48 hpi，寄主表面形成的次生菌絲開始繼續(xù)分支，產(chǎn)生更多的次生菌絲（圖3）；到72 hpi時即接種后3 d（day post inoculation，dpi）肉眼可在葉片上看到交錯生長的菌絲（圖3a，b），形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；5 dpi產(chǎn)生分生孢子梗（圖3a，b），上端產(chǎn)生具圓形末端初生分生孢子，此時整個侵染循環(huán)過程已完成，而初生分生孢子落于葉片表面后，準(zhǔn)備萌發(fā)，開始下一個侵染循環(huán)，此時葉片上方已可見明顯白色粉狀物（圖3b）。

圖1 接種后不同時間白粉菌在寄主表面生長發(fā)育Fig.1 Different stages of Oidium heveae growth and development after inoculation

圖2 顯微觀察白粉病菌在寄主上的生長發(fā)育形態(tài)Fig.2 Microscopic analysis of developmental morphology of O.heveae in the host

與病原菌生長發(fā)育觀察同步，在病原菌孢子附著到葉片后2 d，可以在接種點(diǎn)肉眼或者借助放大鏡看到很細(xì)小的菌絲體（圖3b），3 dpi接種點(diǎn)菌絲體的擴(kuò)展速度明顯加快，3 dpi菌落長、寬度較2 dpi增加近1倍，菌落面積增加2倍，接種點(diǎn)表現(xiàn)為肉眼可見的白色潛育斑，菌絲生長稀疏，接種點(diǎn)葉組織顯輕微皺縮；4 dpi，菌絲生長變得稠密，接種點(diǎn)菌落面積又?jǐn)U大1倍，部分接種點(diǎn)葉組織皺縮并呈現(xiàn)扭曲狀；5～6 dpi后，在接種點(diǎn)周圍已經(jīng)形成典型的橡膠樹白粉病粉層癥狀，但成扭曲狀的葉組織有恢復(fù)平展的趨勢。

圖3 白粉病菌的細(xì)胞學(xué)行為觀察及其侵染橡膠樹葉片的癥狀形成過程Fig.3 Cytological analysis of O.heveae on the leaf surface and the symptom development in the rubber tree

在7 dpi，在感病葉片初期的銀白色輻射狀菌絲部位，后期在病斑上出現(xiàn)粉層，形成大小不一的白色病斑，從幾毫米到幾厘米不等，有時由于多個病斑聯(lián)合覆蓋了幾乎整個葉片，嚴(yán)重時病葉皺縮畸形、變黃、最后脫落。在后期隨著葉片的老化及溫度的升高，病斑可變成紅色斑（條件適宜具有較強(qiáng)的再侵染力）、白色癬狀斑（條件適宜具有較強(qiáng)的再侵染力）、黃色斑（條件適宜再侵染力已降低甚至消失）和不規(guī)則的褐色壞死斑（條件適宜再侵染力已消失）。

綜上所述，橡膠樹白粉菌侵染寄主有5個關(guān)鍵時間點(diǎn)：（1）接種后4 h為分生孢子萌發(fā)高峰；（2）接種后8 h為附著胞產(chǎn)生高峰；（3）接種后12～15 h，為侵入結(jié)構(gòu)及初生吸器產(chǎn)生高峰；（4）接種后15～24 h，為次生菌絲形成高峰；（5）接種后5 d，為分生孢子梗形成高峰，這為初侵染后完成第二次侵染提供大量的菌源。在5個關(guān)鍵時間點(diǎn)中，前3個屬于侵染前期，第4個屬于潛育期，第5個屬于侵染后期。

2.2 寄主細(xì)胞對于橡膠樹白粉菌的入侵反應(yīng)

2.2.1 寄主細(xì)胞無壞死反應(yīng)卻產(chǎn)生氧暴發(fā)和胼胝質(zhì)等抗性反應(yīng)

如果橡膠樹白粉菌的侵染破壞了橡膠樹葉片的細(xì)胞膜，則臺盼藍(lán)會進(jìn)入到其細(xì)胞質(zhì)，而健康的橡膠樹葉片細(xì)胞膜完好，臺盼藍(lán)不會進(jìn)入，因而細(xì)胞也不會被染色［24］。通常采用此方法檢測寄主細(xì)胞是否死亡。在本試驗中經(jīng)連續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)，在侵染早中期（0～48 hpi）均沒有發(fā)現(xiàn)有寄主細(xì)胞被染成藍(lán)色（圖4c），說明在侵染中前期O.heveae并未對寄主細(xì)胞產(chǎn)生破壞性行為。

乳突反應(yīng)是寄主對白粉病菌入侵產(chǎn)生的一種典型的非專化性防衛(wèi)反應(yīng)［25］，乳突中含有可溶性蛋白、過氧化氫、胼胝體及酚類物質(zhì)［26］。采用苯胺藍(lán)染色，乳突會呈藍(lán)色，由于白粉菌菌絲同樣會被苯胺藍(lán)染成藍(lán)色，而胼胝質(zhì)與苯胺藍(lán)結(jié)合會產(chǎn)生藍(lán)色熒光，因此，在使用普通光觀察的同時，也采用395 nm激發(fā)波長及495 nm發(fā)射波長觀察是否有藍(lán)色熒光，以確定胼胝質(zhì)的產(chǎn)生。利用DAB法的原位組織化學(xué)染色法主要用于檢測寄主細(xì)胞中H2O2的積累［16］，可以通過內(nèi)源過氧化物酶，使DAB與H2O2結(jié)合形成紅褐色聚合物，來檢測過氧化氫生成的位點(diǎn)，但DAB檢測無法看到病菌孢子及菌絲結(jié)構(gòu)，因此再通過苯胺藍(lán)染色可觀察接種點(diǎn)病原菌的形態(tài)和胼胝質(zhì)的形成。觀察結(jié)果顯示在病原菌侵染寄主過程中，產(chǎn)生初生吸器之前，未看到寄主產(chǎn)生抗性反應(yīng)，但在15 hpi之后，能夠觀察到寄主產(chǎn)生了一系列的抗性反應(yīng)，15 hpi病菌誘導(dǎo)寄主表皮細(xì)胞產(chǎn)生乳突，病原菌受到寄主抗性應(yīng)答后，附著胞呈現(xiàn)分瓣的畸形現(xiàn)象（圖4a），同時，一些附著胞意圖與寄主建立寄生關(guān)系時，附著胞下方的寄主葉肉細(xì)胞經(jīng)DAB染色呈現(xiàn)褐色沉淀，說明寄主積累H2O2，產(chǎn)生了氧暴發(fā)，氧暴發(fā)現(xiàn)象在36 hpi和3 dpi的檢測中均出現(xiàn)在寄主表細(xì)胞上（圖4c，e），且越到后期發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)氧暴發(fā)的現(xiàn)象越為明顯，在侵染早期只有少量呈棕褐色的細(xì)胞出現(xiàn)，少于10%。36 hpi，3 dpi病菌初生附著胞在引起寄主表皮細(xì)胞產(chǎn)生乳突（圖4d）的同時，也激發(fā)其產(chǎn)生胼胝質(zhì)沉積，葉肉細(xì)胞經(jīng)苯胺藍(lán)染色呈現(xiàn)熒光（圖4d、4f），但是在15 hpi的時候卻未發(fā)現(xiàn)有熒光現(xiàn)象出現(xiàn)在次生附著胞的下方，表明侵染早期并沒有胼胝質(zhì)的抗性反應(yīng)。

圖4 不同時段O.heveae誘導(dǎo)寄主細(xì)胞產(chǎn)生抗性反應(yīng)*Fig.4 Host resistance responses induced by O.heveae*

2.2.2 侵染中后期寄主細(xì)胞會激發(fā)氧暴發(fā)阻止病原菌擴(kuò)展

如果白粉菌的侵染影響了橡膠樹葉組織的正常生長，橡膠樹葉組織產(chǎn)生氧暴發(fā)，經(jīng)DAB染色的表皮細(xì)胞上面有棕褐色沉淀。而在侵染的中后期（24～48 hpi）發(fā)現(xiàn)棕褐色細(xì)胞數(shù)量較侵染前期快速增加，棕褐色沉淀首先出現(xiàn)在受侵染的表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁（圖5 A、a）及其下方葉肉細(xì)胞（圖5B、b），而后才到表皮細(xì)胞（圖5C、c），且鄰近的細(xì)胞也受其影響開始出現(xiàn)有棕褐色沉積反應(yīng)并影響到了下層的葉肉細(xì)胞，葉肉細(xì)胞出現(xiàn)棕褐色沉淀，存在H2O2積累（圖6a）。

圖5 DAB染色后在侵染位點(diǎn)亞細(xì)胞間H2O2積累的檢測Fig.5 DAB stain detection of H2O2accumulation in different subcellular locations at infection sites

通過對吸器與寄主細(xì)胞接觸面觀察發(fā)現(xiàn)，感病寄主表皮細(xì)胞，在病原菌侵染釘?shù)闹車a(chǎn)生了乳突（圖6b），同時下方的葉肉細(xì)胞出現(xiàn)較弱的黃色，表明此時其下方的葉肉細(xì)胞也被激發(fā)產(chǎn)生了主動的氧暴發(fā)現(xiàn)象。但是在次生附著胞的下方就算是沒有明顯看到有侵染釘時，也可能會誘導(dǎo)寄主表皮細(xì)胞產(chǎn)生少量的氧暴發(fā)現(xiàn)象（圖6c）。在我們的試驗觀察中發(fā)現(xiàn)，在侵染的后期，并不是所有的次生附著胞都會誘導(dǎo)產(chǎn)生H2O2，在受侵染的表皮細(xì)胞中，次生吸器不僅影響受侵染釘入侵的表皮細(xì)胞，同時還可能影響到鄰近的表皮細(xì)胞，并使得周圍幾個表皮細(xì)胞壁潰敗、融合（圖6d）。盡管橡膠樹白粉菌產(chǎn)生的吸器只侵染橡膠樹葉片的表皮細(xì)胞，但隨著病原菌侵染擴(kuò)張對寄主表皮下方葉肉細(xì)胞也造成一定影響。H2O2先在吸器的下端葉肉細(xì)胞積累數(shù)小時（圖4a、5b）；而后，受刺激的持續(xù)影響積累的第二波，使表皮細(xì)胞壁染色明顯加深（圖5a、6a），這是由于受侵細(xì)胞不斷向侵入孔的周圍分泌沉積物質(zhì)形成細(xì)胞壁沉積或者胼胝體等（圖4d、4f），H2O2繼續(xù)會充滿整個被侵染的表皮細(xì)胞（圖4c、6b），從而誘導(dǎo)寄主細(xì)胞產(chǎn)生氧暴發(fā)，同時將信號傳遞給鄰近的細(xì)胞，使得周圍的細(xì)胞產(chǎn)生一定程度氧暴發(fā)（圖6a、6d）。因此，受侵染的寄主經(jīng)歷了氧暴發(fā)的出現(xiàn)－氧暴發(fā)現(xiàn)象快速增加－接種點(diǎn)鄰近的細(xì)胞出現(xiàn)氧暴發(fā)的過程。

圖6 接種后48～72 h橡膠樹白粉病菌激發(fā)寄主組織產(chǎn)生抗性反應(yīng)Fig.6 Host resistance responses induced by O.heveae at 48－72 hpi

檢測接種后寄主葉組織中H2O2含量，并與健康橡膠樹葉組織對比（表1），發(fā)現(xiàn)病原菌附著于寄主表面時（0～4 hpi），葉片中H2O2含量沒有明顯變化，但是在4 hpi－分生孢子萌發(fā)高峰，12 hpi－侵染釘形成入侵的高峰期及24 hpi－次生菌絲形成的高峰時間段，葉組織中H2O2含量出現(xiàn)明顯的下降，但是在8 hpi－附著胞形成的高峰期，葉組織中H2O2含量出現(xiàn)明顯的上升，恢復(fù)到接近初始的階段，而在15 hpi－初生吸器侵入到寄主細(xì)胞中的高峰點(diǎn)，葉組織中H2O2含量回升，而在次生菌絲出現(xiàn)，即表示侵染成功之后已開始從寄主體內(nèi)吸取營養(yǎng)，其H2O2含量又開始慢慢回升接近正常葉片的水平。

表1 接種后不同時間測得的H2O2含量Table 1 H2O2content in different time points after inoculation

2.3 孢子萌發(fā)過程中糖原及脂肪變化

糖原及脂肪是兩種能量貯存物質(zhì)，Lugol染液與糖原反應(yīng)呈棕褐色，而與支鏈淀粉或者糊精類反應(yīng)則呈淡棕色或者淺黃色［16］。采用Lugol染色液觀察不同發(fā)育期的O.heveae分生孢子（圖7），可以看到，在萌發(fā)過程中，隨著芽管不斷伸長，分生孢子棕褐色越來越淡，并逐漸向芽管端聚集呈深棕褐色（圖7a～c）。采用Nile Red染色，O.heveae分生孢子紅色熒光呈慢慢變?nèi)醯膽B(tài)勢，且其熒光的聚集是從孢子內(nèi)部通過芽管輸入到芽管頂端細(xì)胞及附著胞中，隨著附著胞的形成，紅色熒光逐漸變強(qiáng)（圖7d～f）。在萌發(fā)過程中分生孢子消耗了本身貯存的糖原及脂肪等物質(zhì)，隨著孢子的生長發(fā)育，其顏色越來越弱，說明糖原及脂肪不斷被分解，以提供能量給孢子的生長發(fā)育，芽管只起到輸送營養(yǎng)的作用，并不積累或者貯存營養(yǎng)。

圖7 糖原及脂質(zhì)在孢子發(fā)育過程中的變化Fig.7 Glycogen and lipid changes in conidia development process

3 討論

橡膠樹白粉菌作為一種專性寄生菌，4～8 d就繁殖一代，病害發(fā)生快，一般肉眼可見病斑時，已是病原菌接觸到寄主表面并開始大量擴(kuò)展及產(chǎn)孢。已有研究報道O.heveae在接觸到葉片2 h萌發(fā)，在活體4 h產(chǎn)生芽管和附著胞，而在離體12 h才產(chǎn)生伸長芽管和附著胞，10～12 h達(dá)到病菌孢子萌發(fā)高峰［7，10］，但對其他各時期具體發(fā)育時間并沒有確切的說法。在本試驗中我們發(fā)現(xiàn)O.heveae分生孢子在落于葉片表面大約4 h后，已達(dá)到其萌發(fā)高峰期，并確定了其他生長發(fā)育結(jié)構(gòu)或者侵染結(jié)構(gòu)形成的開始時間與高峰，而肉眼可見的白粉病癥狀出現(xiàn)在接種后3 d。因此，相對肉眼觀察白粉病癥狀形成及其相應(yīng)的防治時期，在有利于白粉病發(fā)生的物候期中，可將防治時期再提前2～3 d。

病原菌侵入寄主所需的機(jī)械壓力或所需的酶是否來自于O.heveae自身分生孢子液泡中的內(nèi)含物尚不清楚。在分生孢子中存在大量的液泡，且在自由水中會導(dǎo)致白粉菌液泡吸水膨脹破裂而釋放出有害物質(zhì)影響孢子的正常萌發(fā)［9］，在7 g／L葡萄糖水溶液中能保存完整的形態(tài)并進(jìn)行正常的萌發(fā)及產(chǎn)生附著胞等（試驗結(jié)果待發(fā)表），正是由于葡萄糖溶液中保持了一定的滲透壓，使得分生孢子內(nèi)外的滲透壓達(dá)到平衡。這似乎說明了真菌中細(xì)胞的滲透壓是維持菌絲生長及入侵機(jī)械力的主要動力來源。我們通過多種染色方法在菌絲中發(fā)現(xiàn)存在有大量的液泡流動（圖片未顯示），液泡中攜帶眾多的酚、蛋白、細(xì)胞壁合成酶類等，液泡膜在生長頂端與菌絲細(xì)胞的質(zhì)膜融合聚集，形成突起（圖2c）。菌絲形態(tài)和分支特點(diǎn)主要靠液泡的釋放速度和液泡輸送中心的線性轉(zhuǎn)移來控制［27-28］。病原真菌的侵入釘在侵染過程中將遇到很高的機(jī)械阻力，通過調(diào)整細(xì)胞壁的強(qiáng)度和液泡的聚集，芽管的頂端細(xì)胞即膨大的附著胞產(chǎn)生一定的膨壓而使壓力集中，形成侵入釘，侵入釘垂直于寄主的表面，并給寄主表皮細(xì)胞施壓，使其穿透寄主的表皮細(xì)胞，最終形成有效的侵入生長結(jié)構(gòu)［29］，但尚不清楚侵入釘在侵入寄主時是否僅靠機(jī)械壓力。我們在顯微觀察中看到一些附著胞周圍會產(chǎn)生類似于黏液的物質(zhì)，這些物質(zhì)是來自寄主還是病原菌以及是否與病原菌成功建立侵染有關(guān)尚待進(jìn)一步研究。

寄主在受到病原物入侵時，可能會產(chǎn)生乳突或者氧暴發(fā)來阻止病原菌的入侵或者入侵后的擴(kuò)展，同時被侵染的細(xì)胞及其鄰近細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)可能會形成顆粒狀或者細(xì)胞會潰散［30-31］。大麥和小麥白粉菌在寄主表面發(fā)育及侵入后寄主也做出相應(yīng)的回應(yīng)，如產(chǎn)生乳突、胼胝質(zhì)等［12］，同時侵入寄主后可能會激發(fā)活性氧的迸發(fā)，而活性氧迸發(fā)被認(rèn)為是過敏性的特征反應(yīng)，也是植物對病原菌進(jìn)行應(yīng)答的最早期防衛(wèi)反應(yīng)之一［13］。H2O2在其對白粉菌的抗性中起到了非常重要的作用，是通過加固細(xì)胞壁（形成有效的乳突），或誘導(dǎo)過敏性反應(yīng)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，侵染點(diǎn)附近的附著胞存在兩個或者多個耳垂?fàn)罱Y(jié)構(gòu)，這說明附著胞嘗試兩次或者多次的入侵。盡管在少量的O.heveae耳垂體狀附著胞下方存在H2O2的積累、胼胝質(zhì)及乳突出現(xiàn)（圖4a、6b），但是并沒有完全阻止病原菌在寄主葉片表面進(jìn)一步的入侵嘗試，同時在侵染點(diǎn)附近的表皮細(xì)胞細(xì)胞壁稍變厚，應(yīng)是受侵染的寄主細(xì)胞不斷向吸器頸部分泌沉積物質(zhì)而使細(xì)胞壁加厚［10］。

有意思的是，在本研究中，病原菌在侵染寄主葉組織時，寄主表皮細(xì)胞似乎表現(xiàn)消極的抵抗，很少產(chǎn)生或者延遲產(chǎn)生氧暴發(fā)，而寄主葉肉細(xì)胞則會較快產(chǎn)生明顯的氧暴發(fā)。此結(jié)果與大麥－白粉菌病原系統(tǒng)結(jié)果類似，由Mla12調(diào)控的小種特異性抗性中，寄主通常是在表皮細(xì)胞被侵染的24 h內(nèi)死亡，并且將入侵信號迅速地傳遞到鄰近的葉肉細(xì)胞層。在禾谷類作物的白粉菌中，Li等人［13］發(fā)現(xiàn)在病原菌接種后14 h，H2O2首先在葉肉細(xì)胞中積累，接種后20～24 h，再在表皮細(xì)胞中積累，因此早期H2O2的積累是在葉肉細(xì)胞中，而后慢慢影響到寄主葉片的表皮細(xì)胞，并誘導(dǎo)積累H2O2。

在本試驗中，我們未檢測到過敏性壞死反應(yīng)，雖然在侵染早期檢測到乳突或者胼胝質(zhì)等抗性反應(yīng)，但是寄主并沒有完全形成有效的物理屏障以阻止白粉菌的入侵，在接菌后的24 h～3 d時段中，發(fā)現(xiàn)有大量的氧暴發(fā)（圖4e），氧暴發(fā)首先出現(xiàn)在葉肉細(xì)胞或者細(xì)胞壁，隨后才出現(xiàn)在表皮細(xì)胞及鄰近的細(xì)胞，以阻止病原菌的進(jìn)一步擴(kuò)展。這說明寄主對于橡膠樹白粉菌的反應(yīng)有一定的延時，當(dāng)白粉菌已經(jīng)完全侵入到寄主，與寄主建立起寄生關(guān)系后，才產(chǎn)生相應(yīng)的寄主抗性反應(yīng)，以期阻止白粉菌的進(jìn)一步擴(kuò)展。然而在此時，白粉菌可以從其他寄主細(xì)胞中獲取營養(yǎng)，并繼續(xù)隨著次生菌絲的分化及伸長而形成更多的次生吸器，以供其完成生活史，此時寄主與病原菌可能處于一個互作的平衡體系［32-33］，這可能是專性寄生菌與寄主共同進(jìn)化的結(jié)果。

分生孢子中能量的來源是糖原及脂肪物質(zhì)［19］。Lugol染色發(fā)現(xiàn)，分生孢子在萌發(fā)過程中，顏色越來越淺，并在萌發(fā)時，首先集聚到近末端（圖7b）即芽管萌發(fā)的位點(diǎn)，說明在萌發(fā)的過程中，在液泡往芽管頂端輸送的過程中，內(nèi)源能量物質(zhì)慢慢地被消耗。有學(xué)者的試驗表明，如果加入某些外源糖原物質(zhì)［34］，可以有效地阻止分生孢子的死亡，說明不管是在非親和寄主或者非寄主介質(zhì)上，其吸器死亡的主要原因是由于內(nèi)部能量消耗殆盡，而又無法獲得外源能量供其持續(xù)生長。在其他種類白粉菌的萌發(fā)及形成附著胞過程中，發(fā)現(xiàn)有相關(guān)的代謝途徑，及相關(guān)基因的上調(diào)。在大麥白粉菌萌發(fā)過程中，存在與8條糖代謝途徑、3條脂肪代謝途徑相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)［19，32，35］。而對于O.heveae在發(fā)育過程中還需要驗證是否是相類似的基因參與了此類的代謝、供能過程。

4 結(jié)論

綜合本文的研究結(jié)果，明確了橡膠樹白粉病菌分生孢子侵染的生活史，確定了橡膠樹白粉病病菌侵染寄主具有5個關(guān)鍵時間點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)病原菌分生孢子附著寄主葉片萌發(fā)，到肉眼可見典型白粉病癥狀具有2～3 d的物候期，可對制定該病害合理的防治時期提供參考。病菌與寄主互作早期，寄主很少產(chǎn)生抗性反應(yīng)，但在初生吸器形成后，寄主葉肉細(xì)胞至表皮細(xì)胞會產(chǎn)生氧暴發(fā)、胼胝質(zhì)、乳突等抗性反應(yīng)，氧暴發(fā)是橡膠樹與白粉病菌互作的主要抗性反應(yīng)，但是未發(fā)現(xiàn)寄主產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)。因此，對于橡膠樹白粉菌這一類專性寄生菌與其寄主的早期親和互作，及中后期非親和互作，應(yīng)是寄主與病原物發(fā)育進(jìn)化平衡發(fā)展的一種結(jié)果。

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致 謝： 浙江大學(xué)胡東維老師在樣品制備與細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析方面提供幫助

中圖分類號：Q 932

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.3969／j.issn.0529-1542.2014.03.005

收稿日期：2013-07-31

修訂日期：2013-09-02

基金項目：國家重大基礎(chǔ)研究計劃（2011CB111612）；國家自然科學(xué)基金（31160359）；國家農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（CARS-34-GW8）；教育部博士點(diǎn)基金（20104601110004）；海南大學(xué)科研啟動資金（kyqd1006）

*通信作者E-mail：zhengfucong＠126.com，weiguomiao1105＠126.com

Cytological analysis of compatible interactions between rubber tree and Oidium heveae

Wan Sanlian， Liang Peng， Liu Wenbo， Zhang Yu， Miao Weiguo， Zheng Fucong
（Hainan Key Laboratory for Sustainable Utilization of Tropical Bioresources／College of Environmental and Plant Protection，Hainan University，Haikou 570228，China）

AbstractPowdery mildew，a disease caused by Oidium heveae Steinm.is one of the most important leaf diseases that affect rubber tree plantations.Yet，at present there is a lack of systematic cytological research on the infection process and host-pathogen interactions.This study used a combination of various staining techniques and microscopy to observe the O.heveae infection process and the cytological changes in the infected leaves associated with host resistance response.The infection of O.heveae in the host developed through 5 crucial time points：conidia germination peak at 4 hours post infection（hpi），appressoria formation peak（8 hpi），penetration structure（primary haustoria）formation peak（15 hpi），secondary hyphae formation peak（24 hpi）and conidiophore formation peak at 5 days post infection.Prior to haustorium penetration into the host cells，the energy for the process came from conidium’s own energy reserves.After the formation of pathogen’s primary haustoria，in response to pathogen penetration，the rubber tree leaves initiated resistance reactions，including reactive oxygen burst and formation of calluses and papillae.Reactive oxygen species played an important role in the rubber treepathogen interactions.Low ROS levels in the rubber tree leaves allowed the development and penetration of O.heveae.In contrast，high levels of ROS and resultant oxygen burst prevent further pathogen expansion.The development of O.heveae infection in the host proceeded through 5 crucial time points，including the initial peri-od of pathogen infection，latent period and post-infection period.In the leaves of rubber tree，an early phase of compatible host-pathogen interactions and later phase of incompatible interactions preserve the balance in the evolution of obligatory host-pathogen relationships.

Key wordsrubber tree； Oidium heveae； infection； cytology