陳捷 林蕾

HIF-1α基因多態(tài)性與大動脈粥樣硬化型腦梗死的相關性研究

陳捷 林蕾

目的 探討HIF-1α（rs11549467）基因多態(tài)性與大動脈粥樣硬化（LAA）型腦梗死間的相關性。方法 將125例LAA型腦梗死患者（腦梗死組）和180例健康體檢者（對照組）作為研究對象，利用聚合酶鏈限制性長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）及基因測序檢測HIF-1α（rs11549467）基因的多態(tài)性。 結果 腦梗死組和對照組間基因型頻率有統(tǒng)計學差異（χ2=6．55，P= 0．04），GG基因型為腦梗死發(fā)病的危險因素（OR=1．96，95%CI=1．17～3．29，χ2=6．54，P=0．01），GA基因型為腦梗死發(fā)病的保護因素（OR=0．53，95%CI=0．31～0．89，χ2=5．72，P=0．02）。logistic回歸分析提示GG基因型（OR=2．53，95%CI=1．03～17．03，P=0．03）、吸煙史（OR=2．02，95%CI=1．18～3．47，P=0．01）、高血壓病史（OR=2．28，95%CI=1．35～3．85，P=0．00）均為危險因素，踝臂指數(shù)（OR=0．32，95%CI=0．21～0．89，P=0．01）為保護因素。結論 HIF-1α（rs11549467）基因多態(tài)性與LAA型腦梗死發(fā)生具有相關性。

HIF-1α 腦梗死 多態(tài)性 單核苷酸

腦卒中是目前導致人類死亡的三大主要疾病之一，缺血性腦卒中是其中最常見的類型，發(fā)病率占所有腦卒中的87%，在我國腦卒中患者中的比例約為60%～80%[1]。缺血性腦卒中發(fā)病機制復雜，是一種復雜的多因素疾病。環(huán)境因素、遺傳因素、動脈粥樣硬化、高血壓、高血脂、糖尿病等均是缺血性腦卒中的高危因素，其中大動脈粥樣硬化（large artery atherosclerotic，LAA）型腦梗死具有明顯的家族遺傳傾向。近年來缺氧誘導因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）已成為許多疾病的重要候選基因[2]，rs11549467（G1790A）是該基因的常見單核苷酸多態(tài)性位點，但該基因與腦梗死的相關性研究尚未見于報道。本研究探討了浙江省臺州地區(qū)人群HIF-1α基因多態(tài)性與LAA型腦梗死易感性之間的關系，分析腦梗死的危險因素及其作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇本院2011-01—2014-03門診及住院腦梗死患者共125例為腦梗死組，均符合1995年全國第四次腦血管病學術會議制定的腦梗死標準[3]，并經(jīng)頭部CT和（或）MRI檢查確診，根據(jù)類肝素藥物治療急性缺血性腦卒中試驗（trail of org 10172 in acute stroke treatment，TOAST）病因分型選取LAA型腦梗死病例。納入標準：全部患者均經(jīng)顱腦CT和（或）MRI確診腦梗死，并行經(jīng)顱多普勒（TCD）或顱腦彩超、顱腦磁共振血管造影（MRA）、CT血管造影（CTA）或數(shù)字減影血管造影（DSA）、心臟超聲等檢查明確腦血管和心臟病變情況。排除標準：（1）心源性栓塞；（2）其他病因或不明原因型卒中；（3）嚴重心臟疾病，近期發(fā)生心肌梗死或心絞痛疾病；（4）嚴重感染；（5）嚴重肝、腎功能不全；（6）血栓性疾病；（7）腫瘤。

180例對照組為同期在我院健康體檢者，既往無卒中病史，顱腦CT或MRI證實無腦梗死病灶，TCD、顱腦MRA或CTA等檢查證實無腦血管病變。并排除冠心病、腦血管病家族史、1型糖尿病、肝腎疾病、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病及妊娠者。

1.2 臨床資料獲取 兩組研究對象均為浙江地區(qū)漢族人，均為無血緣關系的散發(fā)人群，記錄以下指標：年齡、性別、吸煙史、高血壓病史、糖尿病病史、LDL、踝臂指數(shù)、同型半胱氨酸（HCY）、頸動脈彩色多普勒檢查結果。本研究得到醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均充分了解研究方案并簽署知情同意書，所有標本的收集均經(jīng)受試者本人或家屬同意。

1.3 HIF-1α基因型檢測

1.3.1 DNA提取 所有受檢者均晨起抽取靜脈血3ml，采用DNA試劑盒（上海華舜生物工程有限公司）提取人類白細胞基因組DNA。將提取好的DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設計與合成[4]引物由上海華舜生物工程有限公司合成，上游引物：5＇-TGT GGC CAT TGT AAA AAC TCA-3＇，下游引物：5＇-TTT AAT TCA TCA GTG GTG GCA-3＇。

1.3.3 基因多態(tài)性的檢測 用聚合酶鏈限制性長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP）技術檢測HIF-1α基因多態(tài)性。PCR反應體系總體積為20μl，其中內含100ng基因組DNA，Taq酶PCR混合試劑15μl，上下游引物（10pmol/ L）各0.5μl，最后補充去離子水至終體積20μl。PCR反應條件：94℃預變性5min，94℃變性1min，58℃退火及復性1min，共35個循環(huán)，末次延伸72℃5min。PCR產(chǎn)物進行AciⅠ酶酶切，3%瓊脂糖凝膠電泳分離，在電泳圖譜上鑒定不同的基因型。即GG基因型（終產(chǎn)物為114bp和143bp的兩條帶），GA基因型（終產(chǎn)物為114bp、143bp、255bp的三條帶），AA基因型（終產(chǎn)物為255bp的一條帶）。并隨機抽取10%樣本進行重復基因測序，基因測序不同基因型見圖1-3。

圖1 SNP rs11549467測序GG基因型

圖2 SNP rs11549467測序GA基因型

圖3 SNP rs11549467測序AA基因型

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，分析等位基因和基因型頻率與腦梗死的相關性。計量資料以表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗。基因型及等位基因頻率的比較行χ2檢驗。經(jīng)Hardy-Weinberg平衡檢驗確認樣本的群體代表性。采用二分類非條件logistic回歸分析HIF-1α（rs11549467）基因多態(tài)性與LAA型腦梗死發(fā)病的關系。

2 結果

2.1 兩組受試者臨床指標比較 結果顯示兩組受試者年齡、性別、糖尿病病史比較均無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05）。腦梗死組吸煙史，高血壓病史，頸動脈粥樣硬化發(fā)生率、HCY、LDL含量均高于對照組，踝臂指數(shù)低于對照組，均有統(tǒng)計學差異（P＜0.05或0.01），見表1。

表1 兩組受試者臨床指標比較

2.2 兩組受試者HIF-1α（rs11549467）基因多態(tài)性比較兩組受試者間HIF-1α（rs11549467）基因型頻率和等位基因頻率分別比較，基因型頻率有統(tǒng)計學差異（χ2=6.55，P=0.04）；腦梗死組和對照組G型等位基因頻率分別為88%和81%，比較有統(tǒng)計學差異（χ2=5.96，P=0.02）。進一步結果顯示，GG基因型為腦梗死發(fā)病的危險因素（P=0.01），GA基因型為腦梗死發(fā)病的保護因素（P=0.02），見表2。

表2 兩組受試者HIF-1α基因多態(tài)性比較

2.3 Hardy-Weinberg平衡檢驗 兩組受試者HIF-1α（rs11549467）基因多態(tài)性Hardy-Weinberg平衡檢驗結果顯示，腦梗死組χ2=0.03，P=0.87，對照組χ2=0.74，P= 0.39，可以認為兩組趨向于遺傳平衡，見表3。

表3 兩組受試者HIF-1α基因多態(tài)性Hardy-Weinberg平衡檢驗

2.4 腦梗死發(fā)病危險因素分析 將單因素分析篩選出的可能危險因素進行多因素logistic回歸分析，最終進入模型的因素有：GG基因型（P=0.03）、吸煙史（P=0.01）、高血壓病史（P=0.00）為危險因素，踝臂指數(shù)（P=0.01）為保護因素，見表4。

3 討論

HIF-1α是機體細胞在低氧環(huán)境中產(chǎn)生的一種轉錄因子[5]，參與血管生成、紅細胞生成、葡萄糖、鐵、能量代謝和酸堿平衡調節(jié)和血管舒縮等重要生物學進程，在腦梗死的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。近年來關于HIF-lα基因多態(tài)性與許多疾病如急性心肌梗死、糖尿病、癌癥等的相關性研究取得了一系列進展[2]，rs11549467（G1790A）是HIF-1α基因的常見單核苷酸多態(tài)性位點。

表4 腦梗死易感基因多態(tài)性的logistic回歸分析

本研究結果發(fā)現(xiàn)，腦梗死組HIF-1α（rs11549467）G型等位基因頻率明顯高于對照組，說明該位點G型等位基因可能增加LAA型腦梗死發(fā)病風險。進一步分析基因型頻率發(fā)現(xiàn)，腦梗死組GG基因型頻率明顯高于對照組，提示該基因型可能增加LAA型腦梗死發(fā)病風險；而GA基因型頻率明顯低于對照組，提示該基因型可能減少LAA型腦梗死發(fā)病風險。logistic回歸分析提示，GG基因型為LAA型腦梗死的危險因素，由此可得出結論，HIF-1α（rs11549467）基因多態(tài)性與LAA型腦梗死易感性具有一定的相關性。

多因素回歸分析提示，除了GG基因型外，吸煙史、高血壓病史也是LAA型腦梗死的危險因素，而踝臂指數(shù)為保護因素。吸煙史與高血壓已成為公認的腦梗死危險因素，而目前踝臂指數(shù)已經(jīng)作為動脈粥樣硬化的一種無創(chuàng)測量手段正受到越來越多的關注[6]。當踝臂指數(shù)降低時，說明周圍血管的狹窄程度由于斑塊及動脈粥樣硬化等原因而增加，從而使血流速度減慢，血流量下降，而且大中型血管的病變也與之類似，如腦血管大動脈粥樣硬化的改變可導致缺血性腦卒中、短暫性腦缺血發(fā)作等血管事件的發(fā)生。

傅志超等[7]報道，HIF-1α（rs11549467）基因多態(tài)性與鼻咽部腫瘤灶的放射敏感性相關，從而影響鼻咽癌的局部療效。傅志超等[7]及Ollerenshaw等[8]研究均發(fā)現(xiàn)，rs11549467的單核苷酸替換導致HIF-1α蛋白質序列中588位的丙氨酸被羥丁氨酸替代，從而影響402位和564位的脯氨酸羥化。在低氧狀態(tài)下，GA基因型的基因轉錄活性較GG型高，從而發(fā)揮更高的氧穩(wěn)態(tài)作用，本研究結果與上述研究結果類似。眾所周知，多因素所致的動脈粥樣硬化是LAA型腦梗死的先決條件，動脈粥樣硬化的進展與血管腔缺血缺氧有關，當缺氧時多種血管生成因子的表達，促進血管壁內的微血管大量生成，從而使血管腔進一步狹窄。故推測在低氧狀態(tài)下，GA基因型轉錄活性較GG型高，在缺血缺氧及再灌注等條件下具有保護血管內皮細胞功能，減少內皮細胞凋亡等作用。

本研究通過比較LAA型腦梗死患者與正常對照者的HIF-1α（rs11549467）基因多態(tài)性，結果提示HIF-1α（rs11549467）基因多態(tài)性與LAA型腦梗死發(fā)生存在一定的相關性。但本研究仍存在一些局限性，如樣本量仍偏小，兩組受試者的其他生活習慣及環(huán)境因素控制欠佳等。進一步研究除了擴大樣本量外，還應具體探討HIF-1α（rs11549467）基因多態(tài)性與LAA型腦梗死發(fā)生機制。

[1]中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會腦血管病學組急性缺血性腦卒中診治指南撰寫組．中國急性缺血性腦卒中診治指南2010[J]．中華神經(jīng)科雜志, 2010,43(2):146-153．

[2]Kim H O,Jo Y H,Lee J,et al．The C1772T genetic polymorphism in human HIF-1alpha gene associates with expression of HIF-1alphaproteinin breastcancer[J]．OncolRep,2008,20(5):1181-1187．

[3]中華神經(jīng)科學會．各類腦血管疾病診斷要點[J]．中華神經(jīng)科雜志,1996, 29(6):379-380．

[4]Kuo W H,Shih C M,Lin C W,et al．Association of hypoxia inducible factor-1α polymorphisms with susceptibility to non-small-cell lung cancer[J]．Transl Res,2012,159(1):42-50．

[5]Smaldone M C,Maranchie J K．Clinical implications of hypoxia inducible factor in renal cell carcinoma[J]．Urol Oncol,2009,27(3): 238-245．

[6]劉偉,肖建新,李晟．腦梗死患者踝臂指數(shù)與動脈粥樣硬化的相關性[J]．中華老年心腦血管病雜志,2011,13(3):270．

[7]傅志超,程惠華,李東石,等．HIF-1α基因多態(tài)性與鼻咽癌放療敏感性的相關性研究[J]．中華放射醫(yī)學與防護雜志,2011,31(4):430-432．

[8]Ollerenshaw M,Page T,Hammonds J,et al．Polymorphisms in the hypoxia inducible factor-1α gene(HIF-1A)are associated with the renal cell carcinoma phenotype[J]．Cancer Genet Cytogenet, 2004,153(2):122-126．

Association between HIF-1α gene polymorphisms and large artery atherosclerotic cerebral infarction

Objective To investigate the association of HIF-1α gene(rs11549467)polymorphisms with large artery atherosclerotic(LAA)cerebral infarction．Methods One hundred and twenty five patients with LAA cerebral infarction and 180 healthy controls were included in the study．The polymorphisms of HIF-1α gene(rs11549467)was detected by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)method and sequence-based genotyping．Results The HIF-1α gene(rs11549467)polymorphisms were significantly associated with LAA cerebral infarction(χ2=6．55,P=0．04)．The individuals with GG genotype showed statistically significant increased risk for LAA cerebral infarction(OR=1．96,95%CI=1．17～3．29;χ2=6．54;P=0．01);whereas the individuals with GA genotype showed protection against LAA cerebral infarction．(OR=0．53, 95%CI=0．31～0．89;χ2=5．72;P=0．02)．Logistic regression analysis showed that the GG genotype(OR=2．53,95%CI=1．03～17．03; P=0．03),smoke(OR=2．02,95%CI=1．18～3．47;P=0．01)and hypertension(OR=2．28,95%CI=1．35～3．85;P=0．00)were risk factors for LAA cerebral infarction;whereas ankle brachial index(OR=0．32,95%CI=0．21～0．89;P=0．01)was a protection factor．Conclusion The rs11549467 variant of HIF-1α gene may be a genetic risk factor for developing large artery atherosclerotic cerebral infarction．

Hypoxia-inducible factor-1α Cerebral infarction Polymorphism Single nucleotide

2014-06-09）

（本文編輯：胥昀）

318020 臺州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內科通信作者：林蕾，E-mail：21313102@qq.com