孫德四，張賢珍，肖國光

(九江學院 化學與環(huán)境工程學院，江西 九江，332005)

鉀是農(nóng)作物生長的重要元素。耕層土壤作為一個天然鉀庫，蘊藏著很多含鉀資源，但絕大部分是水難溶性的或不溶性的，不能直接被植物吸收利用。我國鉀肥生產(chǎn)量只占世界的0.34%，除青海、新疆外，幾乎沒有具規(guī)模的生產(chǎn)基地，而消耗量占世界的14.7%，可見我國的活性鉀非常短缺，主要依賴進口[1-2]。至今，國內(nèi)外主要采用高能耗、高污染的的物理化學方法從含鉀礦物中提取鉀，鮮見有關使用微生物技術提取鉀的實驗研究或工業(yè)應用的相關報道[3]。與傳統(tǒng)物理與化學工藝相比，生物浸出具有工藝簡單、成本低、環(huán)境友好及除雜選擇性好等優(yōu)點[4]，因此，開發(fā)環(huán)境友好的含鉀礦物的生物提鉀技術對發(fā)展生態(tài)與經(jīng)濟農(nóng)業(yè)具有十分重要的意義。土壤中的不溶性鉀主要賦存于鉀長石、伊利石、明礬石和云母等硅酸鹽礦物中，目前有關利用微生物風化分解這類硅酸鹽礦物的研究報道較多，主要集中于天然硅酸鹽礦物元素轉變過程中微生物所起的作用以及礦物分解的微生物效應。已有研究表明：由于K，F(xiàn)e 和P 等是微生物所需的生命元素，因此，自然界中各類微生物均對含有這些元素的硅酸鹽礦物具有一定的風化分解能力，但具有高效分解硅酸鹽礦物并能大量釋放其中的有價金屬元素(K，Si 和Al)的微生物種類較少[5]。通過對比已報道的含鉀硅酸鹽礦物微生物浸出的實驗結果可知：有較強的礦物風化分解能力且對K，Si 和Al 具有一定溶釋效果的微生物均為異養(yǎng)菌(主要是細菌及真菌)。其中，細菌中的膠質芽孢桿菌Bacillus mucilaginosus 與環(huán)狀芽孢桿菌Bacillus circulans(又稱“鉀”細菌或硅酸鹽細菌)對硅酸鹽礦物的分解能力最強；真菌中的菌根真菌Piloderma sp.、巖生真菌Rock-eating fungi 及黑曲霉Aspergillus niger 等對礦物中的不溶性鉀、硅、鋁具有較強的活化作用，但效果不如“鉀”細菌。Lian 等[6]綜述報道了Grudev 和Genchev 等利用不同來源的7 株Bacillus circulans 和28 株fungi 浸出高嶺石與伊利石的研究結果，發(fā)現(xiàn)搖瓶浸出30 d 后，不同來源的菌種的浸礦效果存在顯著的差異，Bacillus circulans 最高可浸出礦物中＞40%的Al2O3，而fungi 對Al2O3的浸出率最高只有30% 左右；而Aleksandrov 等研究發(fā)現(xiàn)，利用硅酸鹽細菌搖瓶浸出黑云母等含鉀硅酸鹽礦物，連續(xù)浸出40 d，K，Si 和Al 的浸出率最高分別只有10.22%，9.24% 與9.24%，且礦物的溶蝕及金屬的浸出主要發(fā)生在浸出的前5 d，但若定期(每隔5 d)更換或補充新鮮培養(yǎng)液6～8 次，則SiO2，Al2O3和K2O 的浸出率分別可達到50.28%，57.83%和51.74%。近年來，Lian 等[6-8]分別采用不同來源的野生與誘變的硅酸鹽細菌及真菌搖瓶浸出鋁硅酸鹽礦物，K，Si 和Al各金屬元素的浸出率與上述結果基本一致。微生物對硅酸鹽礦物的風化機理研究表明，不同來源異養(yǎng)菌之所以對礦物的分解能力不同，是由于它們的生長代謝差異所致；微生物主要通過有機酸的酸解、胞外聚合物的絡解、生物膜及氧化還原等多種因素的協(xié)同作用方式風化分解硅酸鹽礦物；微生物代謝產(chǎn)酸、產(chǎn)胞外聚合物及氧化還原酶的能力是影響其對礦物分解效果的關鍵因素[9]。然而，用于解鉀的微生物菌種主要用于制備生物菌肥，還鮮見有關利用微生物浸出含鉀礦物提取活性鉀、硅的實驗研究及相關工業(yè)應用的報道。目前，硅酸鹽礦物的生物浸出均采用搖瓶浸出形式，很少有關利用連續(xù)浸出方式浸出鉀礦物的報道。浸礦過程中細菌的活性是影響細菌浸礦效果的關鍵因素。有關硫化礦生物浸出實驗結果表明[10-12]：微生物在搖瓶浸出過程中存在明顯的生長延遲期、較短的對數(shù)生長期；而在分批攪拌浸出與連續(xù)浸出體系中的微生物對數(shù)生長期明顯延長，特別是在連續(xù)浸出體系中細菌沒有明顯的生長延遲期，整個浸出過程中細菌均保持較高的活性，因而，在合適的條件下具有較高的浸礦效率。對比分析單一與混合菌浸出硫化礦效果可知：混合菌的浸礦效果明顯要比單一菌的好，各菌種在浸礦過程中具有顯著的協(xié)同效應[13-14]。但至今尚無有關利用混合“鉀”細菌浸出鉀礦物中K，Si，Al 及鉀礦物浸礦過程中“鉀”細菌群落結構變化的研究報道。而有關硅酸鹽礦物的微生物風化分解的大量實驗結果表明：不同類型菌種對礦物的分解方式存在一定的差異[9,15-17]：氧化亞鐵硫桿菌可通過氧化作用風化分解硅酸鹽礦物，環(huán)狀芽孢桿菌對礦物中的鐵具有較好的還原作用，膠質芽孢桿菌主要通過酸解、絡解與絮凝分散作用釋放礦物中的 K，Si 和Al，而真菌可以通過菌絲生長所產(chǎn)生的機械力作用破壞礦物晶體結構。因此，各“硅酸鹽”細菌是否浸礦過程中具有協(xié)同作用，浸礦過程中微生物群落結構如何變化等是值得研究和探索的新課題。為此，本文選用3 株表型形態(tài)及生理生化特征具有較大差異的“鉀”細菌，采用單一與混合菌對富鉀火成巖進行搖瓶浸出與連續(xù)浸出，通過測定不同浸出上清液中的細菌濃度、pH、黏度及K，Si 和Al 含量，對比分析搖瓶浸出與連續(xù)浸出對細菌生長代謝及K，Si 和Al 溶出效率的影響。通過分析浸礦效果最好的連續(xù)浸出體系中混合菌的群落結構的演替規(guī)律，了解各菌種在浸礦過程中的地位與作用。

1 實驗

1.1 實驗礦樣

實驗用富鉀火成巖樣品購自浙江大學地質標本廠，樣品產(chǎn)地為安徽壽縣，呈淺褐色，斑狀結構。根據(jù)X 線衍射分析，其主要礦物組成為(質量分數(shù))：鉀長石66.12%；絹云母4.28%；堿性輝石7.21%；綠泥石6.09%；白榴石6.54%；鉀霞石9.51%。樣品的化學組成分析結果見表1。

表1 富鉀火成巖的主要化學成分及質量分數(shù)Table 1 Main chemical components in rich potassium igneous rock and their relative percentage %

1.2 菌種及培養(yǎng)條件

實驗中使用的3 株“鉀”細菌包括：膠質芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus，簡稱BMN)、環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans，簡稱BCM)、根瘤菌(Rhizobium spp.，簡稱RHJ07)。前2 株菌種購自中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)，并通過亞硝酸鈉誘變所得的突變菌株，后一個菌種由本實驗室從河南鋁土礦樣中分離得到。混合菌株(BMN+BCM+RHJ07)用CMR 表示。3 株菌均用Asby,s 基質礦物培養(yǎng)基(即硅酸鹽細菌培養(yǎng)基)進行活化與傳代培養(yǎng)。

1.3 富鉀火成巖浸出實驗

實驗采用了搖瓶浸出與連續(xù)浸出2 種浸出方式。

1.3.1 搖瓶浸出實驗

浸出實驗采用 500 mL 的錐形瓶作為容器，瓶內(nèi)裝入200 mL 滅菌的硅酸鹽細菌培養(yǎng)基，加入粒度為75 μm 的富鉀火成巖，使礦漿濃度為5%，接入對數(shù)生長期的各單一“鉀”細菌，混合菌 CMR 按各單一菌等量(1.4×107個/mL)接入錐形瓶中，使培養(yǎng)基中細菌初始濃度為4.2×107個/mL。在初始 pH 為7.2，溫度為35 ℃，搖床轉速為 240 r/min 的條件下進行浸出培養(yǎng)，每個實驗均設3 個平行組，并設無菌空白對照實驗(純培養(yǎng)基浸出實驗)。每隔1 d 取樣測定浸出液中的SiO2、Al2O3、K2O 的濃度、pH、黏度與細菌濃度，取樣后用新鮮培養(yǎng)基補足損失的浸出液。

1.3.2 連續(xù)浸出實驗

為保證連續(xù)浸出環(huán)境與搖瓶浸出及分批浸出的環(huán)境基本一致，連續(xù)浸出實驗在由自制的3 個容器(每個容量500 mL，均有攪拌器攪動)構成的浸出裝置中進行。首先將礦漿濃度為5%(粒度為75 μm)的富鉀火成巖礦粉培養(yǎng)基溶液分別加入到3 個容器中，使3 個容器的初始裝液量均為150 mL。然后繼續(xù)在第1 個容器中加入同樣配置的礦粉培養(yǎng)基溶液，至200 mL 后產(chǎn)生溢流，其溢流進入下一個容器，依次類推。溢流穩(wěn)定后，將各單一菌及混合菌按照搖瓶浸出中的方法分別接入3 個容器中，這樣可使3 個浸出容器中的浸出環(huán)境基本一致。在浸出過程中，從最后容器流出的礦漿每天過濾，濾液返回到第1 個容器，使細菌循環(huán)使用。同時用新鮮培養(yǎng)基補充由于過濾與取樣損失的水分。浸出周期為15 d，每隔1 d 分別從3 個容器中取樣1 mL，分別測定其 SiO2，Al2O3和K2O 濃度以及細菌濃度，取3 個容器樣的平均值。

1.4 物理化學分析

浸出液及浸渣中的硅(以SiO2計量)采用硅鉬藍分光光度法(上海光譜公司，721E 分光光度儀)測定；浸渣中的鋁(以Al2O3計量)采用鉻青天S 分光光度法測定；浸出液及浸渣中的鉀(以K2O 計量)采用四苯硼鈉分光光度法測定；pH 用PHS-3C 型pH 計(上海雷磁儀器廠)測定；浸礦上清液的黏度用黏度計測定，儀器型號為NDJ-5(上海天平廠)；培養(yǎng)液及浸礦上清液中的細菌數(shù)量在XS-212 生物顯微鏡(南京江南永新光學儀器)下用平板計數(shù)法測定；用SEM(TESCAN 公司，型號為 VEGIILSU)與 XRD(日本 Rigaku 生產(chǎn)的D/Max-2500 型X 線衍射儀)觀察細菌浸出前后礦樣的表面微觀形態(tài)及礦物組成變化；浸出液紅外光譜結構采用紅外光譜儀(Nicolet-360 FT-IR)在4 000～500 cm-1區(qū)域內(nèi)進行紅外光譜掃描，分析不同浸出體系中浸出液的紅外結構差異。

1.5 浸礦過程中混合菌CMR 的群落結構分析

在各細菌生理生化及表形特征相似的情況下，浸礦過程中混合菌群落的動態(tài)演替規(guī)律一般采用16S rDNA 的克隆和限制性長度多態(tài)性分析(RFLP)手段進行確定。而本實驗所使用的3 株“鉀”細菌的部分生理生化特征、表形特征及 DNA 分子堿基中的G+C 摩爾分數(shù)存在明顯的差異(結果見表2)，因此，浸礦過程中“鉀”細菌群落的動態(tài)演替是通過分析細菌生理生化特征、表形特征及DNA分子堿基中的G+C摩爾分數(shù)來確定的，這種方法較RFLP 更加簡單、直接且成本較低。實驗選用混合菌CMR 連續(xù)浸出體系作為研究對象，按照不同時間段從浸出液中取樣1 mL，然后進行梯度稀釋并涂布于含固體硅酸鹽細菌培養(yǎng)基的平板上，靜置培養(yǎng)直至長出菌落，隨機挑選200個菌落進行分析鑒定。3 株菌的生理生化特性與表型形態(tài)特征采用文獻[1-2]的常規(guī)方法進行；各細菌的DNA 采用上海生工生物技術有限公司提供的SK1201-UNIQ-10柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取細菌發(fā)酵液中的DNA，采用熱變性溫度法來測定DNA 中G+C 摩爾分數(shù)。

表2 3 株實驗“硅酸鹽”細菌的差異性特征Table 2 Different characteristics of tested three silicate bacterial strains

2 結果與討論

2.1 實驗菌株的生理生化特性

使用硅酸鹽細菌發(fā)酵培養(yǎng)基對細菌進行培養(yǎng)，在初始細菌濃度為4.2×107個/mL 的條件下，測定pH和溫度對BMN，BCM 和RHJ07 生長的影響，結果見表3 和表4。由表可見，3 株菌在pH 為5.0～9.1 和溫度為25～35 ℃的范圍內(nèi)都能生長；最佳pH 范圍為7.2～8.3，最適溫度范圍為28～30 ℃；BMN 生長的最佳pH 為7.2，最適溫度為35 ℃；BCM 生長的最適pH和溫度分別為8.3 與30 ℃；RHJ07 生長的最適pH 和溫度分別為7.2 和30 ℃。盡管3 株“鉀”細菌的最佳pH 和最適溫度的差別不大，但根據(jù)前期浸礦實驗結果，BMN 的浸礦效果明顯要比BCM 和RHJ07 的好，在浸礦中起主要作用，所以，在組合菌種的浸礦實驗中取pH=7.2，溫度為35 ℃。

表3 pH 對BMN，BCM 和RHJ07 生長的影響Table 3 Effect of pH value on growth of BMN, BCM and RHJ07

表4 溫度對BMN，BCM 和RHJ07 生長的影響Table 4 Effect of temperature on growth of BMN, BCM and RHJ07

在3 株實驗用“鉀”細菌的最適宜生長條件下，利用含富鉀火成巖礦物的硅酸鹽細菌培養(yǎng)基對它們進行培養(yǎng)，測定各細菌的生長曲線及發(fā)酵液中pH 與黏度隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律，結果如圖1 所示。從圖1(a)可見：BMN 菌的生長速度明顯要比其他2 株菌的快，且具有較高的細菌濃度，其延遲期、對數(shù)生長期與穩(wěn)定期分別為0～2，2～5 和 5～8 d；BCM 菌的延遲期、對數(shù)生長期與穩(wěn)定期分別為0～3，3～7 和7～9 d；而RHJ07 菌的各生長對應時期分別為0～3，3～6 和6～8 d，且發(fā)酵液中細菌濃度最低。各培養(yǎng)液的pH 與黏度與細菌生長具有很強的關聯(lián)性，在對數(shù)生長期pH 快速降低，黏度快速升高，隨后pH 平緩下降，黏度平緩上升。BMN 菌培養(yǎng)液中的pH 與黏度在第7 天分別下降至最低值(4.4)與上升至最高值(651 mPa·s)，而BCM與RHJ07 菌培養(yǎng)液中的pH 與黏度均在第9 天分別達到最低值(5.1，5.4)和最高值(575，511 mPa·s)。隨后隨著發(fā)酵時間的延長，培養(yǎng)液中的pH 開始緩慢上升，黏度開始緩慢降低，這是由于在發(fā)酵培養(yǎng)后期，環(huán)境的貧營養(yǎng)性致使細菌又重新利用自身代謝產(chǎn)生的有機酸、胞外多糖等所致。這表明，3 株菌均有一定的產(chǎn)酸與產(chǎn)胞外多糖的能力，其中BMN 菌的代謝能力最強。硅酸鹽礦物與微生物相互作用機理研究表明[6-8]，在硅酸鹽礦物微生物風化分解過程中，“鉀”細菌對含鉀硅酸鹽礦物中 K，Si 和Al 的溶出是由細菌產(chǎn)生的胞外多糖類物質與礦物中的金屬元素結合成絡合物的直接粘附作用以及細菌代謝產(chǎn)生的有機酸酸解硅酸鹽或鋁硅酸鹽的非直接作用2 部分組成的。

圖1 三株“鉀”細菌生長曲線與發(fā)酵液中pH、黏度隨時間的變化規(guī)律Fig.1 Growth curves of three potassium strains and change of pH and viscosity values of supernatants with time

2.2 富鉀火成巖細菌搖瓶浸出實驗

吳濤等[5,9-9]的研究結果表明：不同來源的“鉀”細菌對硅酸鹽礦物的風化分解能力存在較大差別，即使同一菌種也因生長環(huán)境不同而導致其有不同的礦物風化能力。一般認為，具有較強產(chǎn)多糖能力的 BMN對含鉀礦物的分解能力較強。而莫彬彬報道[7]及作者前期研究表明：RHJ07 與BCM 之所以能風化分解硅酸鹽礦物，除與它們產(chǎn)酸與產(chǎn)胞外多糖的能力有關外，還由于它們對礦物中的鐵、錳等金屬具有較強的還原作用，表明這類菌種在代謝過程中有產(chǎn)氧化還原酶的能力。正是由于不同菌種的生長代謝特性不同導致它們對礦物的風化分解機制也存在一定的差異，這種差異可能是各菌種在對礦物風化分解過程中具有一定協(xié)同作用的基礎。為驗證實驗用的3 株“鉀”細菌的浸礦協(xié)同作用，采用搖瓶浸出實驗對比分析了該3 株菌種及它們的混合菌對富鉀火成巖中主要金屬元素K，Si 和Al 的溶出效果，結果見圖2。

圖2 表明：BMN，RHJ07 與BCM 均對富鉀火成巖中的K，Si 和Al 有一定的浸出效果，但存在明顯的差別，BMN 菌的浸出效果最好，浸出過程中上清液中 K2O，SiO2和Al2O3的最高質量濃度分別為0.83，5.80 和2.1 g/L；其次為BCM，浸出液中K2O，SiO2和Al2O3的最高質量濃度分別為0.55，4.95 和1.75 g/L；RHJ07 的浸出效果最差，K2O，SiO2和Al2O3的最高質量濃度分別為0.41，3.01 和1.25 g/L；而混合菌CMR的浸礦效果明顯要好于各單一菌種，浸出液中K2O，SiO2和Al2O3的最高質量濃度分別達到1.38，6.26 和2.85 g/L，表明各菌種在風化分解富鉀火成巖的過程中具有協(xié)同作用。

從圖2 可以看出：在含不同細菌浸出體系中，盡管同一金屬元素的溶出動力學規(guī)律基本相同，但不同金屬元素(K，Si 和Al)的溶出動力學存在明顯不同的變化規(guī)律。

2.2.1 K 的溶出規(guī)律

在含單一與混合菌的4 種浸出體系中，浸出液中K2O 質量濃度變化趨勢基本一致，先后可以分為緩慢上升、快速上升、緩慢下降與輕度上升期 4 個階段(圖2(a))。但在不同的細菌浸出體系中，浸出液中 K2O 質量濃度變化的4 個階段略有差別，BMN 浸出體系的4個階段分別為1～4，4～7，7～13 和13～15 d；BCM，RHJ07 與CMR 浸出體系的4 個階段分別為(1～3，3～ 8，8～12，12～15 d)，(1～5，5～ 10，10～13，13～15 d)，(1～4，4～9，9～12，12～15 d)。對照細菌生長曲線結果(圖1(a))可知：K 的溶出與細菌生長密切相關，在浸出的第1階段，K2O 濃度緩慢上升，對應細菌生長的停滯期與對數(shù)生長前期，此階段由于細菌活性低且基本不產(chǎn)生各種代謝產(chǎn)物，K 的溶出是培養(yǎng)基溶液對礦物的微弱風化作用所致。在浸出的第2 階段(對應細菌的對數(shù)生長的中后期與穩(wěn)定期及衰亡期前期)，由于細菌代謝產(chǎn)生了一定量的有機酸、氧化還原酶與胞外多糖，酸解、絡解與氧化還原作用增強，K2O 質量濃度持續(xù)升高，同時細菌在對數(shù)生長期的活性最高，吸附在礦物表面的細菌在生長中會對礦物產(chǎn)生機械崩解作用，加速礦物顆粒的破碎，變得更細小，增大風化面積，使風化反應更易進行。在浸出的第三階段，K2O 的質量濃度輕微下降，導致這一結果的可能原因是 K 是細菌生長的必需元素，在此階段細菌 K 的溶出量低于細菌消耗量。在浸出的最后階段，K2O 的質量濃度又輕微上升的可能原因是該階段細胞發(fā)生分解，又釋放生長時消耗的K 所致。

2.2.2 Si 的溶出規(guī)律

在4 種單一與混合菌浸出體系中，在15 d 的浸出周期內(nèi)，各浸出液中SiO2質量濃度均持續(xù)升高，但溶出速率與細菌生長代謝活性密切相關(圖2(b))。在浸出前期(對應細菌生長的停滯期)，SiO2質量濃度上升緩慢，其原因可能是細菌代謝活性較低，較少產(chǎn)酸與胞外聚合物，因此富鉀火成巖通過質子交換與配體絡合2 種方式產(chǎn)生溶解的能力均較弱。而在浸出后期(細菌生長衰亡期中后期)SiO2質量濃度增幅速率很小的可能原因是該階段浸出液處于貧營養(yǎng)狀態(tài)，細菌開始自溶，細菌的氧化還原能力及酸解與絡解作用顯著降低所致。在細菌生長的對數(shù)期與穩(wěn)定期，浸出液中SiO2質量濃度增幅速率顯著，也可能是該階段細菌對礦物的機械破壞、質子交換、配體絡合及氧化還原作用增強所致。作者前期研究表明：礦物中不同金屬元素的溶出機制略有不同，K 與Si 的溶出主要受細菌間接作用機制的影響，而Al 的溶出主要受細菌直接作用機制的影響。因此，具有較強產(chǎn)小分子有機酸與胞外多糖能力的“鉀”細菌對硅酸鹽礦物中K 與Si 的溶出能力較強。

2.2.3 Al 的溶出規(guī)律

在4 種細菌浸出體系中，除浸出速率不同外，Al的溶出整體上均可以分為上升與下降2 個階段(圖2(c))。在細菌的對數(shù)生長期與穩(wěn)定期，浸出液中Al2O3的質量濃度顯著增加，與SiO2的溶出規(guī)律相同，但研究認為Al 的溶出主要受細菌—礦物直接作用機制的影響，特別是在細菌生長的對數(shù)期后期與穩(wěn)定期，由于礦物表面生物膜及細菌—礦物復合體的形成，提高了細菌及代謝產(chǎn)物對礦物中Al 的溶出能力，Al 的溶出量明顯大于代謝產(chǎn)物吸附絮凝沉淀的量。進入細菌生長的衰亡期后，Al2O3的質量濃度顯著降低，該階段的一個顯著特征是代謝產(chǎn)物與細菌出現(xiàn)了絮凝，形成了大量絮狀物，溶出的Al 因受代謝產(chǎn)物的絮凝沉淀而降低(由于細菌生長對Al 和Si 需求極少，因此，這一變化過程可能與細菌生長的吸收利用無關)。Zhou 等[17]研究結果表明：細菌—礦物直接接觸作用表現(xiàn)出細菌對Al 的溶出作用增強，而隔離實驗則反映了代謝產(chǎn)物對Al 的抑制作用；高嶺石、伊利石、葉蠟石與石英或Si 離子的微細顆粒在細菌所產(chǎn)生的多糖溶液中具有良好的分散性能，而同樣直徑的一水鋁石或Al 離子在該溶液中很快會絮凝沉淀。

圖2 搖瓶浸出實驗結果Fig.2 Results of flask bioleaching

2.3 富鉀火成巖細菌連續(xù)浸出實驗

目前有硅酸鹽礦物的微生物風化分解實驗均在搖瓶浸出體系中進行，尚無有關利用連續(xù)浸出工藝浸出含鉀硅酸鹽礦物的相關報道。有關金屬礦的微生物浸出實驗結果表明：連續(xù)浸出可以顯著提高細菌活性和浸出速率。為此，為進一步研究浸礦效果較好的單一菌BMN 和混合菌CMR 對礦物的風化分解能力，實驗采用連續(xù)浸出體系浸出富鉀火成巖。實驗過程中當連續(xù)浸出裝置的液流穩(wěn)定后，并在保證連續(xù)浸出裝置中的3 個容器的浸出環(huán)境基本一致的情況下，每隔1 d從3 個容器中取1 mL 浸出液并混合，分別測定其中的K2O、SiO2、Al2O3質量濃度，結果見圖3。同時，分析了浸出液中細菌數(shù)量及可溶性與不溶性金屬氧化物(K2O、SiO2、Al2O3)的質量分數(shù)，結果見圖4。

從圖3 可見：單一菌BMN 與混合菌CMR 在連續(xù)浸出體系中對富鉀火成巖中的K，Si 和Al 的溶出速率及溶出量明顯要比在搖瓶浸出體系中的快與高，且K 和Al 的溶出規(guī)律略有差異；在為期15 d 的浸出周期內(nèi)，BMN 與CMR 的浸出上清液中K2O 的最高質量濃度分別為1.21 和1.78 g/L，SiO2的最高質量濃度分別為7.41 和9.79 g/L，Al2O3的最高質量濃度分別為3.12 和4.58 g/L；到第15 d 浸出結束時，在BMN 的連續(xù)浸出體系中，K2O，SiO2和Al2O3的浸出率分別為30.50%，25.44%和28.39%，而在搖瓶浸出體系中的最終浸出率分別為18.44%，19.92%和7.25%；在CMR 連續(xù)浸出體系中，分別可以浸出52.36%的K2O，33.62%的SiO2與40.55%的Al2O3，而對應的搖瓶浸出率分別只有30.64%，21.49%和9.91%，這一結果說明連續(xù)浸出體系可以顯著促進富鉀火成巖的細菌風化分解能力，提高單一與混合菌的浸出效率。在 K，Si和Al 的溶出動力學規(guī)律上，浸出液中SiO2質量濃度隨浸出時間的變化規(guī)律與搖瓶浸出體系中的相似，而K 和Al 的溶出表現(xiàn)出略為不同的動力學特征。在連續(xù)浸出的15 d 內(nèi)，浸出液中K2O 質量濃度隨浸出時間的延長持續(xù)升高，沒有表現(xiàn)出在搖瓶浸出體系中K2O 質量濃度輕度下降的階段，這表明在整個浸出周期內(nèi)細菌對K 的溶出量大于細菌對K 的消耗量；對Al 的溶出，在浸出的前12 d，溶出規(guī)律與搖瓶浸出相似，可分為上升與下降2 個階段，但上升速率明顯要快，下降幅度明顯變緩；而到浸出的第12 天后，浸出液中Al2O3質量濃度又開始輕度上升，表現(xiàn)出與搖瓶浸出相反的動力學特征。

圖3 連續(xù)浸出實驗結果Fig.3 Results of continuous bioleaching

已有生物浸礦及礦物微生物風化實驗結果表明[6-9]：礦物的風化分解速率與微生物的生長代謝活性密切相關，處于對數(shù)生長期的微生物對礦物的溶蝕能力明顯要高于處于延遲期或穩(wěn)定期與衰亡期的微生物對礦物的溶蝕能力。對細菌的生物生長與代謝活潑性研究表明：在浸出或發(fā)酵培養(yǎng)過程開始時，細菌的活潑性最弱；在浸出過程的中期，由于形成了培養(yǎng)物發(fā)展的最佳條件，此時細菌的活潑性最高；而在浸出的后期，由于聚集了一些有毒物質與浸出液中營養(yǎng)物質的大量減少而使細菌活性降低。在搖瓶浸出體系中，細菌生長均存在明顯的延遲期與較短的對數(shù)生長期，并隨著發(fā)酵時間的延長，細菌的活性逐漸降低并有大量自溶死亡。很顯然，延遲期是導致細菌浸礦周期延長的原因之一，而浸出液中活性細菌數(shù)量降低是導致K，Si 和Al 浸出率較低的主要因素。而在連續(xù)浸出體系中是循環(huán)利用過濾后的細菌溶液，細菌與礦物顆粒之間接觸比搖瓶浸出體系更加充分，過濾可以消除部分浸出液中聚集的對細菌有抑制作用的有毒物質，同時用新鮮培養(yǎng)基補充浸礦或過濾中損失的浸出液，因此，細菌的活性會在浸出過程中迅速恢復。從圖4(a)可以看出：在15 d 的浸出時間內(nèi)，單一菌BMN 與混合菌CMR 沒有明顯的延遲期，基本處于對數(shù)生長期，表明菌種在浸礦周期內(nèi)具有較高的活性，且浸出結束時浸出液中的pH 保持在5.3 左右，產(chǎn)酸能力略高于搖瓶浸出體系時的產(chǎn)酸能力，這可能是細菌在連續(xù)浸出體系中浸出能力要高于搖瓶浸出體系中的主要原因。

圖4 連續(xù)浸出體系中細菌生長曲線及可溶性與不溶性金屬氧化物的質量分數(shù)Fig.4 Growth curves of CMR and BMN and percentages of soluble and insoluble metallic oxides

浸出結束后，分析浸出液中可溶性與不溶性金屬氧化物的質量分數(shù)(圖4(b))。結果表明：浸出液中可溶性 K2O 的質量分數(shù)(62.42%)明顯要高于不溶性K2O 的質量分數(shù)(27.58%)，而可溶性與不溶性的 SiO2和Al2O3的質量分數(shù)基本相近。這一結果進一步表明：K 的溶出主要受細菌及代謝產(chǎn)物的生物化學作用(間接溶出機制)的影響，而Si 和Al 的溶出除受生物化學作用的影響外，代謝產(chǎn)物的生物物理浮選作用也是十分重要的因素之一。當?shù)V物顆粒越細，浸出液中不溶性的K，Si 和Al 含量越高，導致這一結果的原因是：1) 在較細粒度下，一部分硅酸鹽礦物單體(高嶺石、伊利石、石英、鉀長石)從組成復雜的礦物中解離出來，而這些礦物的微細顆粒(粒度≤45 μm)在細菌多糖溶液中具有良好的分散性能；2) 這些礦物在細菌的溶蝕作用下分解成了水鋁石與石英，石英在此多糖溶液中具有比上述礦物更好的分散性能，而水鋁石則絮凝沉淀形成精礦。

2.4 浸渣的SEM 與XRD 及浸出液的IR 分析

富鉀火成巖原礦及被CMR 搖瓶浸出與連續(xù)浸出15 d 后的浸渣樣品的SEM 與XRD 分析結果見圖5 與圖6；不同浸出方式的浸出液的紅外光譜分析結果見圖7。

從圖5(a)可以看出：未經(jīng)細菌作用的富鉀火成巖原礦礦物顆粒表面光滑，棱角分明，凹凸不平狀明顯，晶體結構完整；而經(jīng)細菌作用后的富鉀火成巖顆粒表面發(fā)生了明顯的變化，礦樣被搖瓶浸出15 d 后，礦物顆粒大的棱角與凸起部分被分裂成更多細小棱角，邊緣變得模糊不清，礦樣表面出現(xiàn)了大量的溶蝕坑(圖5(b))；而圖5(c)表明：連續(xù)浸出方式比搖瓶浸出方式對富鉀火成巖的溶蝕作用更為明顯，凸起的棱角完全被溶蝕，細小顆粒及非晶態(tài)物質顯著增多，礦物晶體結構基本被破壞，且在細菌分泌的胞外大分子物質的交聯(lián)作用下，顆粒相互粘連在一起而成絮狀。

圖6(a)表明：未經(jīng)細菌作用的富鉀火成巖原礦中主要礦物為鉀長石，傍生礦物主要有霞石、綠泥石、白榴石、絹云母與輝石等不同結構的硅酸鹽礦物，其XRD 圖譜中反映它們的晶體結構的特征峰明顯；而經(jīng)混合菌CMR 浸出作用15 d 后，在搖瓶浸出體系中的浸渣樣品XRD 圖譜中(圖6(b))，白榴石、綠泥石、輝石與霞石的特征銳鋒均有明顯下降；而在連續(xù)浸出體系中的浸渣樣品XRD 圖譜中(圖6(c))，其反映白榴石、綠泥石、絹云母與輝石的特征峰基本消失，反映霞石與鉀長石的各特征峰下降更為顯著并有部分消失，且出現(xiàn)了反映水鋁石的新特征銳鋒。這表明：被細菌分解的硅酸鹽礦物轉化成了水鋁石；混合菌CMR 在連續(xù)浸出體系中對富鉀火成巖的溶蝕效果要比在搖瓶浸出體系中的好。這與作者前期研究[6-9]及莫彬彬等[7]的結果一致。他們認為，試驗條件下，硅酸鹽細菌對不同晶體結構的硅酸鹽礦物存在明確的風化序列，具層狀結構的云母、綠泥石較架狀結構的霞石與鉀長石容易被首先風化，并在風化過程中有可能轉化成水鋁石、石英等其他晶體結構的鋁硅酸鹽礦物，硅酸鹽細菌對不同結構礦物的分解作用有一定的選擇性。富鉀火成巖是由多種礦物組成的，在多種礦物共存的條件下，細菌對富鉀火成巖的分解作用會因礦物晶體結構的不同而在作用強弱或快慢上表現(xiàn)出明顯差異，從而對不同類型的礦物行使不同程度的破壞作用，微生物對礦物的破壞作用不僅表現(xiàn)在不同礦物之間，也表現(xiàn)在同種礦物的不同部位之間。

圖5 富鉀火成巖原礦及被混合菌搖瓶浸出與連續(xù)浸出15 d后的浸渣樣品的SEM 圖Fig.5 SEMs of rich potassium igneous rock raw ore and leaching dregs of flask leaching and continuous leaching by mixed culture

作者前期研究結果[8-9]表明：不同來源的硅酸鹽細菌在發(fā)酵培養(yǎng)與浸礦過程中可以代謝產(chǎn)生草酸、蘋果酸、酒石酸與檸檬酸及大分子胞外多糖物質，且鋁硅酸鹽礦物可以顯著促進細菌產(chǎn)代謝產(chǎn)物的能力；而代謝產(chǎn)物可以通過酸解、絡解的方式風化分解鋁硅酸鹽礦物，將不溶性的Si，Al，K 和Fe 等元素轉變成可溶性的離子或有機絡合物。從混合菌各發(fā)酵液與浸出液的紅外光譜圖(圖7)可以看出：3 組不同浸出液均具有碳水化合物的典型吸收峰。在官能團區(qū)3 400 cm-1附近歸屬為O—H 伸縮振動，峰強且寬，說明3 組浸出液中均有大量的OH-，但強度有明顯差別，由強到弱分別為富鉀火成巖連續(xù)浸出液(A)，富鉀火成巖搖瓶浸出液(B)，無礦物的發(fā)酵液(C)，說明富鉀火成巖礦粉可以誘導細菌產(chǎn)生更多的胞外多糖與有機酸等代謝產(chǎn)物，且浸出方式對細菌代謝能力也有明顯的影響；從峰形區(qū)別，浸出液A 與B 的峰形比浸出液C 的寬，推測浸出液A 和B 中還可能存在螯合的羥基，這很可能是由細菌代謝產(chǎn)生多糖等的羥基與礦粉中陽離子螯合而成。在3 組浸出液的IR 圖中，均有C=O(1 627 cm-1附近)、—CH3(1 371 cm-1附近)、C—O(1 030 cm-1附近)伸縮振動，但強度也存在明顯差別，表現(xiàn)出與O—H 伸縮振動相同的規(guī)律，進一步說明礦物可以刺激與促進細菌的代謝能力；在指紋區(qū)，浸出液A 與浸出液B 在2 923 cm-1和2 270 cm-1附近出現(xiàn)了2 個明顯的新吸收峰，特別是浸出液A 在900～500 cm-1區(qū)間的吸收峰明顯增多，含有白榴石、綠泥石與鉀長石等的Si—O 與Al—O 特征峰，說明加了富鉀火成巖礦粉的2 個實驗組除了有多糖等代謝產(chǎn)物的特征官能團的伸縮振動外，還含有Si—O 和Al—O 等鋁硅酸鹽礦物的特征峰，這很可能是由于有機酸和多糖等代謝產(chǎn)物的螯合作用使得火成巖中的Si 和Al 易于與其復合在一起，明顯區(qū)別于不含火成巖的細菌發(fā)酵液的紅外光譜結構。

圖6 富鉀火成巖原礦及被混合菌搖瓶與連續(xù)浸出后的XRD 圖Fig.6 XRD patterns of raw ore and dregs of batch leaching and continuous leaching by CMR

圖7 浸出液紅外光譜圖Fig.7 IR patterns of supernatants

2.5 浸礦過程中“鉀”細菌群落的動態(tài)演替

在搖瓶浸出與連續(xù)浸出2 種浸出體系中，選取富鉀火成巖浸出效果較好的連續(xù)浸出體系作為研究對象，分析浸礦過程中混合菌種群落結構變化規(guī)律。分別在浸出的第3，6，9，12 和15 天從浸出液中取樣，進行稀釋涂布平板培養(yǎng)，通過對菌株的分離純化，隨機挑選200 個菌落進行生理生化與表型特征鑒別，各樣品中3 種“鉀”細菌的比例結果見圖8。從圖8 可以看出：在第3 天和第6 天的樣品中，各菌種質量分數(shù)差異不大，Bacillus mucilaginosus BMN 所占比例最高，分別為40% 和46.7%，而Bacillus circulans BCM和Rhizobium spp.RHJ07 分別各占32.7%，30%和27.3%，21.7%；在第9 天樣品中，BCM 與BMN 菌明顯為優(yōu)勢菌種，質量分數(shù)分別為41.4%與45%。而當浸出到第12 天及后階段，浸礦微生物的群落組成發(fā)生了更加明顯的變化。隨著浸出時間的延長，RHJ07 菌種所占比例大幅降低，在第15 天的樣品中只占5.7%；BCM 所占比例也有較大幅度降低，在第12 和15 天分別為18.8%和18%；而BMN 所占比例迅速增加，在第12 和15 天樣品中各占73.3%和76.3%。

通過各樣品分析結果的對比可以看出，在富鉀火成巖的浸出前期(0～6 d)，浸礦體系中3 種硅酸鹽細菌所占比例差異較小，沒有明顯的優(yōu)勢菌種；浸礦中期，BCM 與BMN 同為優(yōu)勢菌種；而到了浸礦的后期，BMN 的比例明顯上升，并最后取代BCM 和RHJ07成為優(yōu)勢菌種。因此，可以推測，在浸出過程中浸出環(huán)境的生物及物理化學性質的改變對“鉀”細菌的群落組成產(chǎn)生了影響，這些因素可能是浸出體系中各離子濃度、pH、作為微生物生長能源的有機營養(yǎng)物質(如蔗糖)濃度等。

圖8 各菌種在5 個樣品中所占質量分數(shù)Fig.8 Mass fractions of each tested bacterial strains

3 結論

1) 搖瓶浸出實驗結果表明：混合“鉀”細菌 CMR具有較高的浸出效率，到第15 天浸出結束，K2O，SiO2和Al2O3的浸出率分別為30.67%，21.49%和9.91%；而3 株單一“鉀”細菌中，BMN 的浸礦效果最好，但K2O，SiO2和Al2O3的浸出率也明顯比混合菌CMR 的低，分別為18.44%，19.92%和7.25%。

2) 與搖瓶浸出實驗結果相比，連續(xù)浸出方式可以顯著提高單一與混合“鉀”細菌的浸礦效率。連續(xù)浸出15 d 后，BMN 可以分別浸出富鉀火成巖中30.50%，25.44%和28.39%的K2O，SiO2和Al2O3，而CMR 的浸出效果明顯較BMN 的浸出效果要好，K2O，SiO2和 Al2O3的浸出率分別到達 52.36%，33.62%和40.55%。進一步說明3 株實驗用“鉀”細菌在對富鉀火成巖的浸出過程中具有協(xié)同作用。

3) “鉀”細菌對富鉀火成巖的分解作用是通過其代謝產(chǎn)物的酸解、絡解等化學作用及胞外大分子物質(如多糖)對礦物的生物浮選作用等各種因素協(xié)同作用的結果。

4) 在富鉀火成巖混合菌浸出前期，3 株菌種的比例相差不大，沒有明顯的優(yōu)勢菌種；浸礦中期，BCM與BMN 同為優(yōu)勢菌種；而到浸礦后期，Bacillus mucilaginosus BMN 在群落中的比例會上升，并最后取代Bacillus circulans BCM 和Rhizobium spp. RHJ07成為優(yōu)勢菌種。

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