復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院放療科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

腦部照射對大鼠情緒和記憶的影響

范興文 貫士闊 吳開良

復旦大學附屬腫瘤醫(yī)院放療科，復旦大學上海醫(yī)學院腫瘤學系，上海 200032

背景與目的：放射治療是腦腫瘤的主要治療方法之一，但會導致一定的神經毒性。為避免臨床混雜因素的干擾，本研究采用大鼠放射性腦損傷模型探討腦部照射對情緒和記憶的影響及其規(guī)律。方法：6～8周SD大鼠，用直線加速器進行腦部照射22 Gy制作放射性腦損傷模型。分別在腦部照射1、10個月后，用曠場實驗和高架十字迷宮評價大鼠的活動度及焦慮情緒；用被動回避實驗檢測大鼠的情緒記憶；用新位置識別檢測大鼠的空間記憶。結果：腦部照射1個月后，大鼠在曠場中的移動距離和進入中央區(qū)域的次數(shù)減少，在高架十字迷宮中的總探索次數(shù)和探索開放臂的探索比例降低，在被動回避實驗中進入暗室的潛伏時間變短，在新位置識別實驗中探索新位置的探索比例降低。腦部照射10個月后，大鼠在曠場和高架十字迷宮中的表現(xiàn)與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，但在被動回避實驗中進入暗室的潛伏時間，及在新位置識別實驗中探索新位置的比例較對照組均降低。結論：腦部照射可導致大鼠活動度降低、恐懼記憶，并可導致空間記憶受損；腦部照射導致的情緒障礙可以恢復，但記憶損傷將長期存在。

放射性腦損傷；情緒；記憶

隨著治療技術的進展，腫瘤患者的存活期不斷延長，腫瘤治療導致的不良反應受到越來越廣泛的關注。放射治療是原發(fā)性和轉移性腦腫瘤的主要治療方法之一。有研究報道，接受全腦照射并存活超過半年的患者出現(xiàn)認知功能障礙的概率高達50%～90%［1］。此外，接受過腦部照射的患者還經常會出現(xiàn)情緒異常，如焦慮、抑郁［2］。腦部照射導致的神經功能異常嚴重影響患者的生活質量，研究其發(fā)病規(guī)律及機制有助于探索出有效的防治措施。但臨床資料常包含大量的混雜因素，如化療藥物和疾病本身對情緒記憶的作用［3］。有資料顯示，大鼠全腦照射22 Gy在1個月后會出現(xiàn)空間記憶損傷，可以較好的模擬臨床照射劑量后的認知功能改變［4］。因此，本研究采用此照射劑量建立放射性腦損傷模型，并用4種行為學方法評價大鼠腦部照射后不同時間點的情緒和記憶能力，研究腦部照射對情緒和記憶的影響及其規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 大鼠腦部照射

從復旦大學動物實驗中心購置6～8周SD(Sprague Dawley，斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?大鼠，實驗方案得到復旦大學動物倫理委員會批準。共入組40只大鼠，每組10只大鼠。氯胺酮(75 mg/kg)/甲苯噻嗪(15 mg/kg)腹腔注射復合麻醉后，將大鼠放入特制的固定盒中，使用6 M直線加速器(Primus Linear Accelerator，德國)進行腦部照射。劑量率為250 Mu/min，源皮距為100 cm，照射劑量為22 Gy(單次照射)。頭皮覆蓋1.0 cm厚的組織補償膠體(Bolx)，使劑量分布更均勻。使用特制擋鉛保護眼睛、耳朵、頸部、身體，僅頭部暴露在射線下。對照組同樣接受麻醉處理，放入固定盒，但不接受腦部照射。

1.2 曠場實驗

將大鼠放入曠場實驗箱(40 cm×40 cm× 35 cm)正中央，關閉曠場實驗箱門，以減少外界對其影響。允許大鼠在曠場實驗箱內自由運動5 min，用視頻追蹤軟件(Video-tracking Interface，美國)記錄大鼠在曠場內的運動情況。將中央1/2區(qū)域定義為中央區(qū)域，用專業(yè)軟件(Activity Monitor，美國)分析大鼠在曠場內的移動距離及進入中央區(qū)域的次數(shù)。每只大鼠間用酒精清洗，消除氣味對其影響。

1.3 高架十字迷宮

將大鼠放入高架十字迷宮的中央區(qū)域，頭朝向開放臂。允許大鼠在高架十字迷宮內自由運動5 min，用視頻追蹤軟件(Video-tracking Interface，美國)記錄大鼠在高架十字迷宮內的運動情況。用專業(yè)軟件(Video Maze，美國)分析大鼠對開放臂和閉合臂的探索行為。探索行為定義為：大鼠身體在一側臂或中央，鼻尖碰到另一側臂邊緣。探索開放臂的探索比例=探索開放臂次數(shù)/(探索開放臂+閉合臂次數(shù))。每只大鼠間用酒精清洗，消除氣味對其影響。

1.4 被動回避

被動回避實驗使用MED-PC Ⅳ軟件(美國)進行控制，分為訓練階段和測試階段［5］。在訓練階段，將大鼠放入明室，30 s后將明暗室間的門打開。大鼠進入暗室后關門，5 s后給予足底電擊。電擊電流為0.8 mA，持續(xù)5 s。電擊后拿出大鼠，放回籠中休息。24 h后，開始測試階段。將大鼠放入明室，30 s后開門，記錄大鼠進入暗室的時間。每只大鼠間用酒精清洗，消除氣味對其影響。

1.5 新位置識別

新位置識別分為3個階段：適應階段、熟悉階段、測試階段［6］。在適應階段，將大鼠放入特制的黑色開頂箱子(70 cm×70 cm×40 cm)正中央，允許其自由運動5 min，連續(xù)進行3 d，以消除大鼠在測試箱內的緊張焦慮情緒。在熟悉階段，將兩個物體(4 cm×5 cm×7 cm)放入測試箱內，大鼠放入測試箱內正中央，允許其對物體自由探索3 min。熟悉階段之后，將大鼠放回飼養(yǎng)籠內，間隔5 min后，將大鼠放入測試盒正中央，開始測試階段。開始測試階段前，將其中1個物體移到新位置。用攝像機記錄大鼠對新舊位置的探索行為。大鼠鼻尖觸碰到物體定義為1次探索。對新位置的探索比例=探索新位置的次數(shù)/(探索新位置+舊位置的次數(shù))。

1.6 統(tǒng)計學處理

用GraphPad Prism 5(美國)軟件進行數(shù)據(jù) 處 理 ， 各 組 數(shù) 據(jù) 以x±s 表 示 。 組 間 的 差 異采用非配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 腦部照射對大鼠情緒的影響

在對照射組大鼠腦部照射1個月之后，在曠場中的移動距離較對照組顯著縮短(P=0.015 1，圖1A)，進入中央區(qū)域的次數(shù)顯著減少(P=0.000 3，圖1C)；在高架十字迷宮中，照射組大鼠探索開放臂和閉合臂的總次數(shù)較對照組大鼠顯著減少(P=0.005 9，圖2A)，探索開放臂與總探索次數(shù)間的探索比例亦顯著減少(P=0.011 1，圖2C)。

在對照射組大鼠腦部照射10個月之后，在曠場中的移動距離與對照組差異無統(tǒng)計學意義(P=0.940 7，圖1B)，進入中央區(qū)域的次數(shù)亦無顯著區(qū)別(P=0.787 2，圖1D)；在高架十字迷宮中，照射組大鼠探索開放臂和閉合臂的總探索次數(shù)與對照組大鼠差異無統(tǒng)計學意義(P=0.133 2，圖2B)，探索開放臂與總探索次數(shù)間的探索比例差異亦無統(tǒng)計學意義(P=0.623 0，圖2D)。

2.2 腦部照射對大鼠記憶的影響

在對照射組大鼠腦部照射1個月之后，在被動回避實驗的測試階段，大鼠進入暗室的潛伏時間較對照組顯著縮短(P=0.031 1，圖3A)；在新位置識別實驗的測試階段，照射組大鼠探索新位置與總探索次數(shù)間的探索比例較對照組亦顯著降低(P＜0.000 1，圖4A)。

在對照射組大鼠腦部照射10個月之后，在被動回避實驗的測試階段，大鼠進入暗室的潛伏時間較對照組顯著變短(P=0.037 1，圖3B)；在新位置識別實驗的測試階段，照射組大鼠探索新位置與總探索次數(shù)間的探索比例較對照組亦顯著降低(P=0.002 8，圖4B)。

圖 1 曠場實驗檢測腦部照射對大鼠情緒的影響Fig. 1 Brain irradiation affects the mood of rats detected by open- fi eld test

圖 2 高架十字迷宮檢測腦部照射對大鼠情緒的影響Fig. 2 Brain irradiation affects the mood of rats detected by elevated plus maze

圖 3 被動回避實驗檢測腦部照射對大鼠情緒記憶的影響Fig. 3 Brain irradiation affects the mood memory of rats detected by passive avoiding test

3 討 論

圖 4 新位置識別實驗檢測腦部照射對大鼠空間記憶的影響Fig. 4 Brain irradiation affects the spatial memory of rats detected by novel place recognition test

曠場實驗和高架十字迷宮是評價焦慮情緒的常用方法［7］。曠場實驗中，中心區(qū)域對動物來說是潛在的威脅情境，而外周區(qū)則相對安全。如果大鼠的焦慮水平高則傾向于停留在外周區(qū)，進入中央區(qū)的次數(shù)減少。在高架十字迷宮中，由于開臂和外界相通，對大鼠來說具有一定的新奇性和威脅性，大鼠在產生探索好奇心的同時也會產生焦慮反應。如果焦慮程度高，則大鼠會退縮到閉臂中，對開臂的探索次數(shù)也減少。在曠場中的移動距離和在高架十字中的總探索次數(shù)可反應大鼠的活動度。

在對大鼠腦部照射1個月后，在曠場中的移動距離變短，表明大鼠的活動度降低。由于活動度和焦慮水平都會影響大鼠進入曠場中央區(qū)域的次數(shù)。因此，腦部接受照射1個月后，大鼠進入曠場中央區(qū)域次數(shù)減少的原因，無法確定是焦慮水平增加還是活動度降低。在高架十字迷宮中，大鼠對開放臂和閉合臂的總探索次數(shù)減少，也表明大鼠的活動度降低；開放臂探索次數(shù)與總探索次數(shù)間的比例可排除總探索次數(shù)的干擾，在對大鼠腦部進行照射后大鼠對開放臂的探索比例降低，表明大鼠的焦慮程度增高。腦部接受照射10個月后，在曠場實驗和高架十字迷宮中照射組大鼠的各項指標均與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義，表明大鼠的焦慮情緒和活動度恢復正常。

在大鼠腦部接受照射1個月后活動度減少，可能與嗜睡綜合征相關。腦部照射誘導的嗜睡綜合征機制尚不清楚，有研究顯示，可能與神經炎性反應有關［8］。嗜睡綜合征具有自限性，不管是否使用類固醇都會在1～3個月內自行好轉。本研究也觀察到，在對腦部進行照射10個月后，大鼠的活動度恢復正常。臨床實踐中應注意不要將嗜睡綜合征誤認為病情惡化。

被動回避和新位置識別是評價大鼠記憶能力的常用方法［9］。大鼠喜歡黑暗，明室與暗室之間的門打開后，大鼠會迅速進入暗室。在被動回避訓練階段，當大鼠進入暗室后給予電擊，對其造成驚恐；24 h后，記憶力好的大鼠從明室進入暗室的潛伏時間顯著延長，記憶力差的大鼠仍較快進入明室。大鼠有探索新事物的天性，若大鼠空間記憶良好，對新位置的探索次數(shù)將顯著多于舊位置。在對腦部照射1個月和10個月后，照射組大鼠在被動回避的測試階段進入暗室的潛伏時間較對照組顯著縮短，探索新位置的比例顯著降低，表明大鼠的恐懼記憶和空間記憶長期受損。有文獻報道，小鼠全腦接受6 Gy照射劑量后，對新物體的記憶完好，空間記憶損傷，但可在7周后恢復［10］；但照射劑量增大到10 Gy后，空間記憶和對新物體的記憶都會出現(xiàn)損傷并長期存在［11］，提示各種類型的記憶對射線的敏感性不同，并且較低劑量的照射誘導的記憶損傷可以部分恢復。

與情緒異常關系最密切的腦組織結構是邊緣系統(tǒng)以及與其存在廣泛聯(lián)系的周圍結構，如伏隔核、中腦腹測被蓋區(qū)、丘腦、杏仁核、前額區(qū)及扣帶回。大腦含兩套記憶系統(tǒng)：前顳葉系統(tǒng)和后內側系統(tǒng)，分別負責不同類型的記憶，其中海馬在協(xié)調兩套記憶系統(tǒng)中起重要作用［12］。海馬在學習記憶和情緒調節(jié)中都起重要作用，基礎研究也發(fā)現(xiàn)海馬對射線較為敏感［13］。因此，部分放射生物學家認為海馬是在對腦部照射后導致行為學改變的關鍵區(qū)域，并且產生在對腦部照射時降低海馬照射劑量以保護記憶功能的設想［14-15］。但必須注意的是，腦功能環(huán)路上任何部位出現(xiàn)損傷均會導致神經功能障礙。劑量學研究發(fā)現(xiàn)，胼胝體、左側額葉白質、右側顳葉、雙側海馬、腦室下區(qū)和小腦與放療后的認知功能損傷有關［16］。海馬神經發(fā)生減少［17］、突觸密度降低［18］、脫髓鞘［19］、血腦屏障破壞［20］、毛細血管密度減低［21］可能與腦部照射后的功能改變有關。谷氨酸過度釋放導致的神經興奮性毒性［22］、神經炎性反應［11］及其導致的慢性氧應激［23］，可能是機體受到傷害因素(射線照射)后損傷加重的重要機制。從組織、細胞、分子不同層次研究腦部照射導致情緒記憶障礙的機制，將有助于探索出放射性腦損傷的防治方法。

本研究發(fā)現(xiàn)，腦部照射可導致大鼠活動度降低、焦慮水平增加和恐懼記憶，并出現(xiàn)空間記憶受損；同時發(fā)現(xiàn)對腦部照射導致的情緒障礙可以恢復，但記憶損傷將長期存在。本研究將結果為深入探索腦部照射誘導情緒記憶異常的機制提供理論依據(jù)。

［參 考 文 獻］

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The effect of brain irradiation on mood and memory for rats

FAN Xing-wen, GUAN Shi-kuo, WU Kai-liang (Deptment of Radiation Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center; Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China)

WU Kai-liang E-mail: wukailiang@aliyun.com

Background and purpose: Radiotherapy is one of the main treatment methods for brain tumor patients, but neurotoxicity was observed frequently. Because of the confounding factors in clinical data, it’s hard to summarize the characteristic of neurological changes after brain irradiation. This study used the brain irradiation injury model of rats to test whether brain irradiation change the mood and memory. Methods: Whole brain of SD rats (6-8 weeks old) was exposed to 22 Gy radiation. Open fi eld and elevated plus maze was used to assess the anxiety of rats, passive avoidance was used to assess the mood memory, and novel place recognition was used to assess the spatial memory at 1 month or 10 months after brain irradiation. Results: At 1 month post irradiation, rats moved with less distance and entrance to the central zone of open fi eld with less time, explored the open and closed arms with less time and the exploration of open arms also decreased, entered the darkroom more rapidly during the test phase of passive avoidance, and lose the interest to explore the novel place during novel place recognition. At 10 months post irradiation, rats exhibited similarly with control group during open fi eld and elevated plus maze test, but still entered the darkroom more rapidly during the test phase of passive avoidance, and lose the interest to explore the novel place during novel place recognition. Conclusion: Brain irradiation could decrease the locomotor activity, increase the anxiety mood, reduce the mood and spatial memory; mood dysfunction induced by brain irradiation could restore, but memory impairments would be long-standing.

Brain irradiation injury; Mood; Memory

10.3969/j.issn.1007-3969.2014.11.003

R739.41

A

1007-3639(2014)11-0814-06

2014-04-25

2014-06-05）

國家自然科學基金(No：81372431)。

吳開良 E-mail:wukailiang@aliyun.com