王蓉蓉，孫衛(wèi)東，蔣 蔚，劉迎春，陳永軍，薛俊欣，張 夢(mèng)，王 權(quán)

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095）

豬鏈球菌2型主要毒力因子三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法的建立

王蓉蓉1,2，孫衛(wèi)東2，蔣 蔚1，劉迎春1，陳永軍1，薛俊欣1,2，張 夢(mèng)1，王 權(quán)1

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095）

根據(jù)GenBank中豬鏈球菌2型三種毒力因子CP2SJ、MRP、EF基因序列，利用Primer Express 3.0軟件分別設(shè)計(jì)3對(duì)特異性的引物及相應(yīng)的Taqman探針。CP2SJ、MRP、EF探針5′端分別標(biāo)記FAM、HEX、CY5熒光發(fā)射基團(tuán)，3′端標(biāo)記BHQ1淬滅熒光基團(tuán)。通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系和程序，建立了一種基于Taqman探針?lè)ǖ娜責(zé)晒舛縋CR，可同時(shí)檢測(cè)上述三種毒力基因。該方法靈敏度高，CP2SJ、MRP、EF的最低檢測(cè)限分別為90、40、60拷貝數(shù)/μL的質(zhì)粒；特異性強(qiáng)，與其他病原菌無(wú)交叉反應(yīng)；重復(fù)性好，變異系數(shù)均小于3%。整個(gè)檢測(cè)擴(kuò)增在60 min內(nèi)完成。以上結(jié)果表明本試驗(yàn)所建立的三重?zé)晒舛縋CR方法的敏感性、重復(fù)性及特異性均較好，可用于同時(shí)快速檢測(cè)豬鏈球菌2型三種毒力因子。

豬鏈球菌2型；三重?zé)晒舛縋CR；毒力因子

豬鏈球菌是豬的一種常見(jiàn)病原體，由豬鏈球菌2型引起的疾病是一種重要的人畜共患病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）將豬鏈球菌病列為B類疫病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病[1]。依據(jù)莢膜多糖的差異，將豬鏈球菌劃分35個(gè)血清型，又以豬鏈球菌2型（Streptococcus suisserotype 2，S.Suis2）流行區(qū)域最為廣泛，毒性也最強(qiáng)，是全球范圍內(nèi)發(fā)生的豬鏈球菌病的主要病原。感染豬鏈球菌后可導(dǎo)致豬產(chǎn)生很多疾病如敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎等，嚴(yán)重者還會(huì)導(dǎo)致突然死亡等，部分從業(yè)人群接觸感染后會(huì)產(chǎn)會(huì)中毒性休克、敗血癥、腦膜炎及死亡等惡劣后果[2-4]。

豬鏈球菌的致病力與毒力因子密切相關(guān)。莢膜多糖（capsulalr polysaccharide, CPS）是目前已確定公認(rèn)的豬鏈球菌2型細(xì)菌毒力因子。此外，大部分豬源性強(qiáng)毒力豬鏈球菌2型菌株同時(shí)具有溶菌酶釋放蛋白（muramidase-released protein，MRP）和胞外因子（extracellular protein factor，EF）。Vecht等[5]研究認(rèn)為根據(jù)MRP和EF的有無(wú)，豬鏈球菌2型存在著3種表型：MRP+EF+、MRP+EF-和MRP-EF-。人工感染小鼠和豬的實(shí)驗(yàn)表明MRP+EF+菌株可致豬產(chǎn)生典型腦膜炎、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性漿液炎等疾??；MRP+EF-菌株僅引起較為溫和的疾??；而MRP-EF-菌株則無(wú)致病性。隨著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，豬鏈球菌2型廣泛分布在各大小豬場(chǎng)及農(nóng)村散養(yǎng)的豬群中，并且其發(fā)病率一直呈上升趨勢(shì)。目前針對(duì)該病原的方法多為傳統(tǒng)的細(xì)菌分離鑒定，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)且結(jié)果不準(zhǔn)確，亦不能明確其所帶毒力因子。

本研究針對(duì)豬鏈球菌2型三個(gè)公認(rèn)的毒力因子CPS2J、MRP、EF分別設(shè)計(jì)相應(yīng)引物及Taqman探針，建立了一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速的三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法，為豬鏈球菌2型的檢測(cè)以及其毒力因子的研究提供有效的技術(shù)支持，也有助于對(duì)豬鏈球菌的有效防控措施的制定，對(duì)食品及公共衛(wèi)生安全具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器哥倫比亞血瓊脂平板購(gòu)自上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司；DNAMarker（DL2000）購(gòu)自美國(guó)Promega公司；2×PCRTaqMix購(gòu)自廣州東盛生物科技有限公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自大連（TaKaRa）寶生物公司；質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)公司；膠回收試劑盒購(gòu)自杭州愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)公司；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒購(gòu)自北京TIANGEN生化有限公司。

Gel Doc EZ Imager凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；PCR分析儀購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；ABI 7500 Fast Real-Time PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2 種系背景明確的試驗(yàn)對(duì)照菌株ATCC35246株（馬鏈獸疫亞種，Streptococcusequi subsp zooepidemicus，SEZ，分離自中國(guó)四川病豬）、豬鏈球菌2型（Streptococcus suis serotype 2，S.Suis2）Ha9801強(qiáng)毒株、弱毒株T15等由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)組實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；無(wú)乳鏈球菌、化膿鏈球菌、豬沙門(mén)氏菌、豬鏈球菌1型、豬鏈球菌9型等由本研究室保存。

1.3 引物及探針根據(jù)GenBank中S.Suis2的CPS2J、MRP和EF基因序列（登錄號(hào)：AF118389.1、X64450.1和JF813492.1）各自設(shè)計(jì)一對(duì)引物及相應(yīng)探針（表1）。其中探針5′端標(biāo)記熒光報(bào)告基團(tuán)依次為FAM、HEX、CY5，3′端均標(biāo)記BHQ1淬滅熒光基團(tuán)。引物和探針由上海基康生物科技有限公司合成。

1.4 豬鏈球菌2型細(xì)菌基因組DNA的提取取2mL細(xì)菌增菌培養(yǎng)液，10000×g離心1min，盡量吸凈上清，然后加入180μL裂解液（20mmol/LpH8.0Tris、2mmol/LNa2-EDTA、1.2 %Triton、終濃度為20mg/mL的溶菌酶），37℃處理30min以上。然后按細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒步驟進(jìn)行提取。將所得DNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目的片段的PCR擴(kuò)增及純化以Ha9801菌株DNA為模板，分別用CPS2J、MRP、EF基因引物擴(kuò)增各自特異性目的片段。PCR反應(yīng)體系：Premix12.5μL、上下游引物各1μL、模板1μL，用雙蒸水補(bǔ)足至25μL。擴(kuò)增過(guò)程：95℃預(yù)變性5min；95℃變性35s，59℃退火20s，72℃延伸30s，40個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物取6μL用1.5%瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳，用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄結(jié)果。按DNA膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)純化回收PCR產(chǎn)物。

表1 豬鏈球菌2型多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR三重引物與探針Table 1 The primer pairs and Taqman probes in the triple real-time qPCR for S.suis2

1.6 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及濃度測(cè)定將上述獲得的目的片段分別與T載體連接。體系：SolutionⅠ5μL、pMD18-Tvector1μL、膠回收產(chǎn)物4μL，總體積10μL。16℃過(guò)夜連接。取DH5α感受態(tài)細(xì)胞50μL至連接產(chǎn)物中，冰浴30min；42℃熱擊90s，迅速靜置冰上2～3min；向每個(gè)離心管中加入950μL的LB液體培養(yǎng)基，混勻后置于37℃搖床，150×g振蕩培養(yǎng)45min，使菌體復(fù)蘇；取轉(zhuǎn)化后的菌液400μL，涂Amp＋LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)，約12h左右長(zhǎng)出大小適宜菌落；挑取5～8個(gè)單菌落，分別接種于2mLAmp＋LB液體培養(yǎng)基，置搖床，37℃、180×g培養(yǎng)6～8h；取菌液測(cè)得OD值至0.6～0.8時(shí)，分別取1μL菌液作為模板，用各自對(duì)應(yīng)的上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳及凝膠成像觀察，并選取其中3～5個(gè)陽(yáng)性克隆送上海英濰捷基公司測(cè)序驗(yàn)證。取測(cè)序結(jié)果正確的陽(yáng)性克隆菌液2mL，按照質(zhì)粒小量提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，分別命名為pMD18T-CPS2J、pMD18T-MRP、pMD18T-EF，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肂IO-RAD核酸蛋白分析儀分別測(cè)定重組質(zhì)粒的濃度3次，各取其平均值。

1.7 三重?zé)晒舛縋CR方法的建立

1.7.1 反應(yīng)條件的優(yōu)化和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 先建立并優(yōu)化單個(gè)靶基因檢測(cè)體系，在此基礎(chǔ)上，逐步改變引物與探針的濃度（采用矩陣法）以達(dá)到最佳的擴(kuò)增效率，獲得良好的熒光曲線，繼而進(jìn)行三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系組合和條件優(yōu)化。依照已建立的三重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件，將重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)核酸酶污染的雙蒸水稀釋至1010拷貝/μL，然后依次進(jìn)行10倍梯度稀釋，以不同質(zhì)粒濃度標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行三重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增反應(yīng)，建立動(dòng)力擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7.2 敏感性試驗(yàn) 用滅菌ddH2O梯度稀釋含CPS2J、MRP、EF基因的已知濃度質(zhì)粒DNA，進(jìn)行三重?zé)晒舛縋CR擴(kuò)增，運(yùn)用優(yōu)化后的方法來(lái)檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)的閾值來(lái)判斷該方法的敏感性。

1.7.3 特異性試驗(yàn) 對(duì)豬鏈球菌2型Ha9801強(qiáng)毒株、豬鏈球菌2型弱毒株T15、無(wú)乳鏈球菌、化膿鏈球菌、豬沙門(mén)氏菌、豬鏈球菌1型、豬鏈球菌9型、馬獸疫鏈球菌亞種等分別提取DNA，提取的細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行三重?zé)晒饬縋CR擴(kuò)增。

1.7.4 重復(fù)性試驗(yàn)取 108、107、106拷貝數(shù)/μL 3組不同濃度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品DNA，每組做3次重復(fù)檢測(cè)。對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算每個(gè)稀釋度Ct值和拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（s）和變異系數(shù)（CV）。

2 結(jié)果

2.1 目的片段的獲得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳（圖1），條帶大小均與預(yù)期一致，其大小依次為：91、79、99 bp。將測(cè)序所得結(jié)果與豬鏈球菌2型CPS2J、MRP、EF基因序列對(duì)比，同源性為100%。

圖1 豬鏈球菌2型CPS2J、MRP、EF基因的PCR擴(kuò)增Fig.1 The amplif cation of CPS2J、MRP、EF gene from S.suis2 by PCR

2.2 重組質(zhì)粒的制備和濃度測(cè)定選取其中3～5個(gè)陽(yáng)性克隆直接送上海英濰捷基公司測(cè)序，經(jīng)測(cè)序并與GenBank上公布的同種細(xì)菌基因序列比對(duì)，同源性均為100%。重組質(zhì)粒的濃度計(jì)算公式為：（6.02×1023）×（ng/μL×10-9）/（DNA length）=拷貝數(shù)/μL。計(jì)算結(jié)果：pMD18T-CPS2J濃度為3.58×1010拷貝數(shù)/μL，pMD18T-MRP濃度為2.87×1010拷貝數(shù)/μL，pMD18T-EF濃度為6.68×1010拷貝數(shù)/μL。

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 對(duì)三重?zé)晒舛縋CR各條件進(jìn)行優(yōu)化后，最終確定反應(yīng)體系為：Premix ExTaq(2X) 12.5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，CPS2J上下游引物分別為0.2、0.4μL，MRP上下游引物分別為0.3、0.2 μL，EF上下游引物均為0.4 μL，探針用量均為0.2μL，模板1 μL，用滅菌ddH2O補(bǔ)足至25 μL。體系中所用引物和探針的濃度均配成20 pmol/mL。反應(yīng)條件，95℃預(yù)變性1 min；95℃變性15 s，60℃退火并延伸34 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)；在60℃結(jié)束開(kāi)始收集熒光信號(hào)；全部擴(kuò)增檢測(cè)在60 min內(nèi)完成。

重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在濃度103～108拷貝/μL間都能檢測(cè)出熒光信號(hào)，擴(kuò)增曲線圓滑平整（圖2），且標(biāo)準(zhǔn)曲線均具有良好的線形關(guān)系。以起始模板數(shù)的對(duì)數(shù)為X軸，Ct值為Y軸作圖，得到3條標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（圖3）。方程如下：CPS2J：-3.281528X+35.610966，R2=0.997910；MRP：-3.303893X+35.863792，R2=0.997389；EF：-3.228872X+35.863792，R2=0.997897。

圖2 S.suis 2 CPS2J、MRP、EF三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線Fig.2 The dynamic curve of the triple Real-Time qPCR for CPS2J, MRP and EF in S.suis 2

圖3 三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)S.suis2 中CPS2J、MRP、EF基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 The standard curves of the triple Real-Time qPCR for CPS2J, MRP and EF in S.suis2

2.4 敏感性試驗(yàn)

2.4.1 普通PCR檢測(cè)豬鏈球菌2型敏感性試驗(yàn) 用常規(guī)PCR方法通過(guò)對(duì)10倍梯度稀釋的豬鏈球菌2型三種毒力因子基因陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CPS2J、MRP、EF基因均能檢測(cè)最低至104拷貝數(shù)/μL。

2.4.2 三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)豬鏈球菌2型敏感性試驗(yàn) 經(jīng)過(guò)檢測(cè)，在重組質(zhì)粒CPS2J模板為90拷貝數(shù)/ μL時(shí)仍能檢測(cè)出熒光信號(hào)值。在重組質(zhì)粒MRP模板為40拷貝數(shù)/μL時(shí)仍能檢測(cè)出熒光信號(hào)值；在重組質(zhì)粒EF模板為60拷貝數(shù)/μL時(shí)仍能檢測(cè)出熒光信號(hào)值，與一般常規(guī)PCR檢測(cè)靈敏度104拷貝數(shù)/μL相比，敏感性大大提高，詳見(jiàn)圖4。

圖4 三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)的敏感性試驗(yàn)Fig.4 The sensitivity of of the triple Real-Time qPCR

2.5 三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)豬鏈球菌2型的特異性該方法能夠特異的檢測(cè)出豬鏈球菌2型強(qiáng)毒菌株Ha9801的CPS2J、MRP、EF三毒力因子，弱毒株T15的CPS2J、MRP二毒力因子（圖5）。用重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD18T-CPS2J、pMD18T-MRP、pMD18T-EF作為陽(yáng)性對(duì)照，能分別檢測(cè)出各自的擴(kuò)增曲線，而無(wú)乳鏈球菌、化膿鏈球菌、豬鏈球菌1型、豬鏈球菌9型、馬獸疫鏈球菌亞種在Ct值30以內(nèi)均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（圖6），判定為陰性，說(shuō)明該檢測(cè)方法具有良好的特異性。

圖5 三重?zé)晒舛縋CR區(qū)分豬鏈球菌2型強(qiáng)弱毒株試驗(yàn)的擴(kuò)增曲線Fig.5 The amplif cation curve of the triple Real-Time qPCR to distinguish the virulent, less-virulent and avirulent strains of S.suis2

圖6 三重?zé)晒舛縋CR特異性擴(kuò)增曲線Fig.6 The amplif cation curves of the triple Real-Time qPCR in specif city test

2.6 三重?zé)晒舛縋CR的重復(fù)性試驗(yàn)取108、107、106拷貝數(shù)/μL 3組不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA，每組做3次重復(fù)檢測(cè)。對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算每個(gè)稀釋度Ct值和拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)偏差（s）和變異系數(shù)（CV）。結(jié)果（表3）顯示變異系數(shù)均小于3%，重復(fù)性較好。

表3 三重實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果Table3 The results of repeatability test for triple Real-time qPCR

3 討論

豬鏈球菌是一種危害嚴(yán)重的條件性致病菌，亞臨床的病原攜帶者是豬鏈球菌的主要傳染源[6]。目前還沒(méi)有證據(jù)證明可以人傳人，人感染豬鏈球菌病是直接接觸感染[7]。該病原對(duì)我國(guó)食品安全、畜牧業(yè)生產(chǎn)安全以及相關(guān)從業(yè)人員威脅巨大。加強(qiáng)對(duì)豬鏈球菌尤其是對(duì)豬鏈球菌2型的檢測(cè)力度，對(duì)預(yù)防和控制豬鏈球菌病有重要的意義。實(shí)時(shí)熒光定量PCR不僅有常規(guī)PCR技術(shù)的擴(kuò)增高效率的特點(diǎn)，還具有探針的高度特異性、光譜技術(shù)的高敏感性和精確性等特點(diǎn)[8]，被廣泛運(yùn)用于醫(yī)療、藥物研究、病原菌的檢測(cè)等體外擴(kuò)增技術(shù)[9,10]。整個(gè)反應(yīng)過(guò)程是由儀器自動(dòng)控制并進(jìn)行結(jié)果分析，避免了后續(xù)電泳等步驟，減少了污染[11,12]。

豬鏈球菌菌株根據(jù)毒力因子的差異，可分為強(qiáng)毒力株、弱毒力株和無(wú)毒力株[13]。表現(xiàn)型MRP+EF+菌株強(qiáng)毒菌株能引起嚴(yán)重的臨床癥狀，MRP+EF-弱毒株僅能引起輕微癥狀，MRP-EF-無(wú)毒株感染仔豬后則完全無(wú)毒力表現(xiàn)。本試驗(yàn)建立的Taqman法實(shí)時(shí)熒光定量PCR，通過(guò)對(duì)豬鏈球菌2型三個(gè)主要毒力因子基因CPS2J、MRP、EF的分析，設(shè)計(jì)了特異性的引物及相應(yīng)的探針。優(yōu)化反應(yīng)體系后顯示CPS2J、MRP和EF基因擴(kuò)增效率基本同單重qPCR一致，而且三種熒光信號(hào)的收集均不存在互相干擾，可建立良好動(dòng)力學(xué)擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。該方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠、操作便捷等優(yōu)點(diǎn)，在1 h內(nèi)可完成豬鏈球菌2型CPS2J基因、MRP基因和EF基因的同時(shí)檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)室初步將上述方法應(yīng)用于豬鏈球菌的分離株毒力鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)的鑒定方法結(jié)果一致，為進(jìn)一步將三重?zé)晒舛縋CR檢測(cè)方法應(yīng)用于豬鏈球菌分離株毒力鑒定奠定基礎(chǔ)。

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ESTABLISHMENT OF TRIPLE REAL-TIME QPCR FOR DETECTION OF VIRULENCE FACTORS OF STREPTOCOCCUS SUIS SEROTYPES 2

WANG Rong-rong1,2, SUN Wei-dong2, JIANG Wei1, LIU Ying-chun1, CHEN Yong-jun1, XUE Jun-xin1,2, ZHANG Meng1, WANG Quan1
(1. Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Colledge of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In this study, triple TaqMan real-time PCR assay was developed to simultaneously detect virulence genes CPS2J, MRP and EF ofStreptococcus suisserotype 2. Three pairs of specific primers and fluorogenic-labeled probes were designed and synthesized in accordance with the above target genes using software Primer Express 3.0. The 5′-ends of probes for CPS2J, MRP and EF were individually labeled with FAM, HEX and CY5 and their 3′-ends were all labeled with quencher BHQ1. The reaction system and procedures were optimized. The detection limits for purif ed recombinant plasmids of CPS2J, MRP and EF were 90, 40 and 60 copies/ μL, respectively. There was no cross reaction betweenStreptococcus suisserotype 2 and other pathogens. The variation coeff cient of the established method was less than 3%. The entire detection could be completed within 60 min. In conclusion, the triple TaqMan Real-time PCR assay developed in the present study was fast, sensitive, repeatable and specif c.

Streptococcus suisserotype 2; tripleTaqMan real-time qPCR; virulence factors

S852.616

A

1674-6422（2014）06-0025-07

2014-07-31

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303045）

王蓉蓉，女，碩士研究生，預(yù)防獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

王權(quán)， E-mail：wangquan@shvri.ac.cn