趙登云，許 瑞，林矯矯,2，陸 珂，洪 煬，李 浩，童來保，趙家喜，朱傳剛

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；3.安徽省望江縣畜牧獸醫(yī)局，望江 246000）

一種快速提取血吸蟲蟲卵方法的建立

趙登云1，許 瑞1，林矯矯1,2，陸 珂1，洪 煬1，李 浩1，童來保3，趙家喜3，朱傳剛1

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；3.安徽省望江縣畜牧獸醫(yī)局，望江 246000）

為探索一種快速提取血吸蟲蟲卵并保持蟲卵抗原性的方法，本研究用血吸蟲尾蚴感染兔并收集其肝臟，分別用不同濃度的NaOH、不同溫度和時間消蝕含有蟲卵的肝臟勻漿液，以確定最佳提取蟲卵條件。通過方陣法確定所提取蟲卵的可溶性抗原最佳包被濃度，并對蟲卵抗原靈敏度進(jìn)行了檢測。另外，通過測定75份陽性血吸蟲水牛血清和60份陰性水牛血清，進(jìn)一步檢測了此法提取并制備抗原的靈敏性。結(jié)果表明，本研究所建立的方法在不同NaOH濃度、作用溫度和作用時間下，對提取的蟲卵均產(chǎn)生影響。NaOH濃度越高，作用時間越久，消蝕溫度越高，對蟲卵的破壞越顯著，表現(xiàn)在蟲卵內(nèi)容物的凝聚和消融，蟲卵的空殼化增多。3種不同濃度NaOH 提取蟲卵的抗原檢測下限分別為1/800、1/1600、1/3200，較過篩法的抗原檢測下限1/400有顯著提高。對水牛的血清檢測結(jié)果表明，用NaOH消蝕法提取的蟲卵抗原檢測血吸蟲靈敏性是93%，比常規(guī)過篩法高5%，特異性是100%，比常規(guī)過篩法高3%。本研究結(jié)果表明NaOH消蝕法可快速提取高潔凈度的蟲卵并保持蟲卵的抗原性不被破壞，該法提取蟲卵的最佳NaOH濃度是5%～10%，作用溫度是45℃左右，作用時間是5～10 min。在最佳條件下制備的蟲卵較常規(guī)過篩法的純凈度高，蟲卵得率也是常規(guī)過篩法的3倍以上。

日本血吸蟲；蟲卵；氫氧化鈉；抗原

血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人類健康，影響社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的人畜共患寄生蟲病。全球共76個國家和地區(qū)流行血吸蟲病，感染者超過2億，近8億人口面臨感染威脅[1]。血吸蟲病免疫診斷技術(shù)的發(fā)展為血吸蟲病控制做了重要貢獻(xiàn)。目前常用的免疫學(xué)診斷方法主要是利用抗原抗體反應(yīng)原理，用制備好的抗原檢測抗體或者是用已知抗體檢測抗原[2]。常用的方法為間接血凝實(shí)驗(yàn)以及環(huán)卵沉淀實(shí)驗(yàn)，用到的血吸蟲蟲卵抗原主要是蟲卵可溶性抗原，因此快速提取蟲卵并獲得蟲卵可溶性抗原是血吸蟲病診斷的先決條件。傳統(tǒng)的過篩法提取蟲卵存在耗時長，蟲卵損失大的缺點(diǎn)，且純化后仍有不少肝組織碎片，影響了蟲卵的純度。為解決這一問題，我們通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，對以往報道的檢測蟲卵方法加以改進(jìn)，探索出一種用NaOH消蝕法從動物組織快速提取高純度蟲卵的方法，且對所提取蟲卵制備的抗原靈敏性進(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物健康新西蘭大白兔4只，2.5～3.5kg，雄性，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司；日本血吸蟲陽性釘螺購自江蘇省寄生蟲病研究所。

1.2 血清標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清，本實(shí)驗(yàn)室保存，陰性血清為非感染血吸蟲的新西蘭大白兔血清，陽性血清為兔人工感染血吸蟲尾蚴42d后收集的血清。待檢測水牛血清為60份健康水牛血清，75份人工感染日本血吸蟲病牛血清。

1.3 主要試劑NaOH、Na2HPO4、NaH2PO4、NaHCO3、Na2CO3等試劑均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；pH6.8的PBS緩沖液、ELISA包被液、PBST均由本實(shí)驗(yàn)室配制；山羊抗兔酶標(biāo)二抗購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.4 兔的感染將兔固定在木板上，剃除腹部兔毛，解剖鏡下計數(shù)日本血吸蟲尾蚴，每只兔定量感染1000條尾蚴。

1.5 蟲卵計數(shù)感染42d后剖殺兔，分別取肝臟，去除膽囊和其他結(jié)締組織，剪成碎塊，加適量生理鹽水，置組織勻漿儀用8228×g連續(xù)絞碎3次，每次1min，間隔1～3min，制成勻漿液。取4只兔肝混合的勻漿液2mL做蟲卵計數(shù)，其余勻漿液4℃保存?zhèn)溆?。蟲卵計數(shù)方法如下：勻漿液加相同體積10%NaOH置于45℃消蝕2h，然后取100μL光學(xué)顯微鏡下計數(shù)蟲卵，計數(shù)3次。

1.6 蟲卵提取勻漿液按下列方案分別提取蟲卵，每種方案分別設(shè)定3個重復(fù)實(shí)驗(yàn)，以統(tǒng)計每種方案提取蟲卵的效果。

1.6.1 過篩法 定量吸取勻漿液，先后過50目、100目、200目分樣篩，收集最后濾液經(jīng)260目尼龍紗絹集卵，集卵液以514×g 離心3 min，吸出沉淀物上層和中層肝渣部分，留取管底金黃色蟲卵部分，加生理鹽水洗滌沉淀，經(jīng)3～5次反復(fù)離心分層并除去肝渣，直至呈現(xiàn)金黃色純凈蟲卵。加定量PBS后吸取部分蟲卵，鏡檢蟲卵純度及數(shù)量。

1.6.2 NaOH消蝕法 分別檢測在不同濃度的NaOH、在不同溫度及消蝕時間下的提取蟲卵效果，各方案如下。

1.6.2.1 不同濃度的NaOH消蝕勻漿液 勻漿液分為3份，分別用5%、10%、20%NaOH同勻漿液按1:1混合后，37℃消蝕1 h，將消蝕勻漿液1157×g 離心5 min，4℃操作，棄上清，加PBS洗滌后離心去上清，重復(fù)洗滌3次。鏡檢蟲卵純度及含量。

1.6.2.2 不同消蝕溫度消蝕勻漿液 同上將勻漿液分為3份，用10%NaOH按1:1與勻漿液混合，分別置于37℃、45℃、56℃消蝕1 h，消蝕后洗滌，檢測同上。

1.6.2.3 不同消蝕時間消蝕勻漿液 另取勻漿液分為3份，用10%NaOH按1:1同勻漿液混合，56℃消蝕，分別在消蝕5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、1 h收集消蝕勻漿液，1157×g 離心5 min，反復(fù)洗滌后鏡檢，操作同前。

1.7 蟲卵可溶性抗原提取將提取的蟲卵置研磨器內(nèi)加適量生理鹽水研磨，收集研磨液反復(fù)凍融3次，冰上超聲：超聲1s間隔9s，共1h。15557×g離心5min，取可溶性上清，測OD260和OD280確定抗原濃度，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 抗原包被濃度確定蟲卵可溶性抗原與包被液分別配成5、10、20、40μg/mL四種濃度的工作液，酶標(biāo)板每孔加入50μL上述工作液，4℃過夜包被；PBST洗2次，用含5%脫脂奶粉的PBST37℃封閉2h；PBST洗2次后每孔分別加入PBST（含5%脫脂奶粉）按1:100稀釋的血吸蟲標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清，37℃孵育2h；PBST洗滌后加酶標(biāo)二抗，37℃孵育2h；PBST洗滌后用可溶性單組份TMB底物溶液顯色；2mol/LH2SO4終止顯色后測OD450值。

1.9 檢測靈敏度按照1.8 方法，抗原包被量為1.8 測定的最佳抗原包被濃度，血吸蟲標(biāo)準(zhǔn)陽性血清用PBS進(jìn)行倍比稀釋成1:25、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:64009個滴度的待測血清，陰性對照血清1:100稀釋；其余均和1.5 方法一致。

1.10 蟲卵抗原敏感性和檢出率檢測以最佳的ELISA條件分別檢測了60份健康水牛血清和75份感染日本血吸蟲病水牛血清，每份血清做3個重復(fù)，比較兩種抗原獲得的敏感性、特異性。

1.11 統(tǒng)計分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，檢驗(yàn)兩種診斷方法是否具有顯著性差異，P＜0.05為具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，并計算兩種方法的正確診斷指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 NaOH消蝕法不同參數(shù)條件下的提取效果用不同濃度的NaOH同含血吸蟲蟲卵的肝臟勻漿液混合，置在不同的溫度下消蝕不同的時間，分別純化蟲卵進(jìn)行檢測，以純化蟲卵是否有肝臟組織碎片、純化蟲卵的固縮、空殼化以及蟲卵 pH值等為比較參數(shù)（“-”表示未出現(xiàn)肝雜質(zhì)、蟲卵未出現(xiàn)成串現(xiàn)象、純化蟲卵未固縮或卵未出現(xiàn)空殼化；“+”表示有少許肝雜質(zhì)、個別蟲卵呈現(xiàn)成串、固縮或空殼化；“++”表示肝雜質(zhì)較多、蟲卵成串、固縮或空殼化明顯），比較不同條件提取蟲卵的效果，結(jié)果如表1。

表1 不同濃度NaOH、不同溫度、不同時間下蟲卵提取效果Table 1 The results of digestion with different concentrations of NaOH at different temperature and different time

綜合以上結(jié)果，提取蟲卵的最佳條件為：NaOH濃度為5%～10%、消蝕溫度為45℃左右、消蝕時間為5～10 min。

2.2 消蝕法同過篩法提取蟲卵的比較

2.2.1 蟲卵得率 提取蟲卵前對樣品蟲卵進(jìn)行計數(shù)，每毫升蟲卵數(shù)（x±s）為78 497±17 951。過篩法和不同濃度NaOH消蝕法提取的蟲卵分別在解剖鏡下計數(shù)，換算成原有體積下的每毫升蟲卵數(shù)（表2），過篩法提取蟲卵的得率約為NaOH消蝕法提取蟲卵得率的1/4，差異具有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；3種濃度NaOH消蝕法提取蟲卵得率相當(dāng)。

2.2.2 鏡檢 鏡下可見收集的高純度、無損傷的蟲卵，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組無宿主細(xì)胞和組織殘留。

表2 不同處理組每毫升蟲卵計數(shù)統(tǒng)計Table 2 Eggs per milliliter in different treatment group

圖1 鏡檢觀察蟲卵Fig.1 Microscopic observation of schistosome eggs

2.3 消蝕法提取蟲卵用于檢測血吸蟲病

2.3.1 包被濃度確定 按照檢測血清OD450值與陰性對照OD值的比值（P/N）≥2.1標(biāo)準(zhǔn)，判斷為陽性，P/N比值最大者確定為最佳抗原包被濃度[3]。用5%NaOH、10%NaOH、20%NaOH處理的蟲卵提取的可溶性抗原，其最佳抗原包被濃度為20 μg/mL；過篩法提取的作為對照的蟲卵，其可溶性抗原最佳抗原包被濃度為10 μg/mL（圖2）。

2.3.2 消蝕法提取蟲卵可溶性抗原的檢測靈敏度 用3種濃度（5%、10%和20%）的NaOH消蝕肝組織提取的蟲卵制備蟲卵可溶性抗原，按照檢測血清OD450值與陰性對照OD值的比值（P/N）≥2.1標(biāo)準(zhǔn)，以符合P/N≥2.1的最大血清稀釋比作為血清稀釋下限。檢測的陽性血清稀釋下限分別是1:800、1:1600和1:3200；而過篩法提取蟲卵做的對照實(shí)驗(yàn)，檢測陽性血清的稀釋下限為1:400（圖3）。

圖2 包被濃度的確定Fig.2 Determination of coating concentration of antigen

圖3 5%、10%、20%NaOH消蝕蟲卵提取抗原與過篩法提取蟲卵抗原的檢測靈敏度Fig.3 Detection sensitivity of the antigen extracted from eggs by NaOH digestion at different temperature or by screening method

3.3 蟲卵抗原敏感性和檢出率按照P/N≥2.1的標(biāo)準(zhǔn)，用NaOH消蝕法在最適合條件下純化蟲卵，提取蟲卵可溶性抗原，用最佳抗原包被濃度20 μg/mL包被酶標(biāo)板，用ELISA法檢測現(xiàn)場的牛血清，同過篩法提取的蟲卵制備的SEA對比，檢測作為ELISA抗原檢測家畜血吸蟲病的敏感性和檢出率，并計算兩種診斷方法的正確診斷指數(shù)（判斷公式：正確診斷指數(shù)=1-（假陽性率+假陰性率）），如表3所示。

表3 敏感性和檢出率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Sensitivity and detection rate of soluble egg antigen from NaOH digestion and screening method

3 討論

血吸蟲病診斷主要有病原學(xué)診斷、血清免疫學(xué)診斷兩種方法。病原學(xué)檢查糞便檢測的靈敏性低，造成的漏檢率高，尤其是對于當(dāng)今血吸蟲感染度下降，病原學(xué)檢測的漏檢率可達(dá)到50%以上。病原學(xué)檢查的另一方法是直腸活組織檢查，該檢查方法需要一定的設(shè)備和較高的技術(shù)，并且可能引起出血或腸壁穿孔的危險，應(yīng)用較少。血清免疫學(xué)方法是血吸蟲病診斷的常用方法，目前常用的檢測血吸蟲病免疫方法為環(huán)卵沉淀法、間接血凝法和ELISA法[4]。其中環(huán)卵沉淀法是抗原-抗體反應(yīng)的一種類型，屬沉淀反應(yīng)，直接將蟲卵加入受檢血清，利用蟲卵內(nèi)毛蚴的分泌、排出的抗原物質(zhì)與血清中的相應(yīng)抗體形成特異的環(huán)卵沉淀進(jìn)行判斷；間接血凝法和ELISA法則提取血吸蟲蟲卵可溶性抗原作為診斷抗原。因此，在血吸蟲病的免疫學(xué)診斷中，蟲卵或蟲卵可溶性抗原依然是檢測血吸蟲病最常用、最靈敏和特異的抗原。

傳統(tǒng)血吸蟲蟲卵提取方法是通過過篩提取，最基本的提取方案：將搗碎的含蟲卵肝組織，經(jīng)50～200目分樣篩生理鹽水洗過篩，再經(jīng)260或300目集卵，以除去大部分的肝渣。由于蟲卵在肝臟引起蟲卵肉芽腫并在蟲卵周圍形成肝組織纖維化形成結(jié)節(jié)，過篩法每層分樣篩都會造成大量蟲卵的丟失。過篩法最后通過反復(fù)離心分層，除去上層和中層肝渣，最終獲得純凈蟲卵。過篩法耗時長，得率低，且純化后仍有不少肝組織碎片。為了快速獲得純蟲卵，一些報道對該法進(jìn)行了改進(jìn)，如Coker等[5]等將感染動物處死后至于冰箱中冷藏1～2 d再處理肝臟，增加肝臟的細(xì)胞破損，能有效減少后續(xù)分離過程中的肝臟組織碎片，有利于提高蟲卵純度，但延長了蟲卵分離的時間，難以保持蟲卵內(nèi)活性物質(zhì)。徐克繼等[6]采用分層過濾合并離心分離的方法獲得相對純凈的蟲卵，但依然耗時長，且純化后仍有不少肝組織碎片。劉蘭英等[7]采用勻漿—分級過濾—中速低溫離心沉淀—反復(fù)洗滌法的提純方法，獲得的蟲卵相對純凈，但純化過程較繁瑣，而且每個高倍鏡視野下仍可見肝細(xì)胞。周松華等[8]采用反復(fù)過篩、加胰酶消蝕并結(jié)合離心去上清的純化法，雖然蟲卵分離的較好，肝細(xì)胞得到充分粉碎，但該法增加了提取蟲卵的時間，且未對提取蟲卵的價值進(jìn)行檢測。所以現(xiàn)行報道的各種蟲卵收集方法難以達(dá)到純度高、活力高等要求。

強(qiáng)堿如NaOH或KOH溶液具腐蝕性，能迅速吸收組織水分，溶解組織蛋白，皂化脂肪，損壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，常被用來作為消蝕劑。肝臟主要由肝細(xì)胞組成，強(qiáng)堿對其的消蝕作用強(qiáng)烈而快速；在肝臟中沉積的蟲卵多數(shù)在蟲卵周圍有結(jié)節(jié)環(huán)繞，蟲卵結(jié)節(jié)主要為組織增生形成的結(jié)締組織，不僅具有一定的韌性，而且通過隔絕蟲卵與環(huán)境的接觸，在強(qiáng)堿消蝕下也對蟲卵具有一定的保護(hù)作用。此外，血吸蟲蟲卵的卵殼主要由交聯(lián)的蛋白質(zhì)組成，這些交聯(lián)蛋白非常堅固而且只能通過水解作用被溶解[9]，這些蛋白在酚氧化酶作用下，形成各種交聯(lián)對蟲卵內(nèi)部卵胚細(xì)胞起到保護(hù)作用，對外部環(huán)境有一定的抗性作用，因此蟲卵較肝臟細(xì)胞等組織有更強(qiáng)的抗強(qiáng)堿消蝕作用[10-13]。本文嘗試采用NaOH消蝕的方法提取蟲卵，將含蟲卵的肝組織勻漿液直接加入強(qiáng)堿消蝕，省去了過篩步驟，節(jié)約了時間；由于肝組織消蝕徹底，離心時上清為肝組織的細(xì)胞碎片，不易混入蟲卵沉淀，獲得的蟲卵更加潔凈（圖1）。從消蝕法提取蟲卵的流程及實(shí)驗(yàn)最終結(jié)果看，消蝕法避免了過篩法由于過篩和離心分層除去肝組織而大量丟失蟲卵的可能，蟲卵得率較過篩提取法提高近4倍（表2）。

應(yīng)用消蝕法提取蟲卵的條件很重要。在強(qiáng)堿NaOH作用下，作用溫度越高，作用所需的時間越短；NaOH濃度越高，消蝕需要的時間也越短。因此控制肝臟勻漿液與NaOH的濃度、作用的溫度和作用的時間非常重要。不同濃度的肝臟勻漿液需要加入的NaOH濃度不同，勻漿液越濃稠，需要加入的NaOH濃度越高，因此要控制勻漿液里肝組織的濃度，避免濃度過高，一般情況下，20%的肝臟勻漿液加入10%的NaOH在45℃作用5～10min是最適合的。消蝕后應(yīng)當(dāng)快速離心除去NaOH并通過加入pH6.8的PBS反復(fù)洗滌的方式減少體系內(nèi)殘余的強(qiáng)堿對蟲卵和抗原的破壞。在此條件下，肝雜質(zhì)、蟲卵成串、固縮、空卵殼現(xiàn)象均最少（表1）。

消蝕法提取蟲卵制備可溶性蟲卵抗原檢測血吸蟲陽性血清，最適抗原包被濃度下檢測抗體的下限（1:3200）較過篩法（1:400）的更低，顯示該法提取蟲卵作為診斷抗原的靈敏性更高。推測可能是由于消蝕法提取的蟲卵純度更高，提取的蟲卵可溶性抗原純度也相應(yīng)增高的原因。強(qiáng)堿作用下一些蟲卵非可溶性抗原也有可能轉(zhuǎn)化為可溶性抗原，增加可溶性抗原組分提高了檢測的靈敏性。應(yīng)用消蝕法提取蟲卵可溶性抗原在檢測牛血吸蟲病顯示了更好的敏感性（93.33%＞88.00%），用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，顯示兩種方法做診斷差異沒有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義，且消蝕法的正確診斷指數(shù)(93.33%)要高于過篩法(84.67%)。

NaOH消蝕法提取蟲卵具有操作簡便，分離快速，蟲卵得率高、純度好的優(yōu)點(diǎn)，而且獲得的蟲卵具有良好的抗原活性，可用于血吸蟲病診斷。

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A RAPID METHOD FOR SOLATING SCHISTOSOMA JAPONICUM EGGS

ZHAO Deng-yun1, XU Rui1, LIN Jiao-jiao1,2, LU Ke1, HONG Yang1, LI Hao1, TONG Lai-bao3, ZHAO Jia-xi3, ZHU Chuan-gang1
((1. Key Laboratory of Animal Parasitology of the Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China; 2. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses,
Yangzhou 225009, China; 3. Animal Husbandry and Veterinary Bureau of Wangjiang, Wangjiang 246000, China)

A simple and rapid method for isolating schistosome eggs was developed in the present study. Rabbits were infected with cercariaes and their livers were collected afterwards. The livers were homogenized and treated with NaOH at different concentrations, temperatures and times. The optimal concentration of soluble egg antigen (SEA) for ELISA use was determined by reacting with positive sera of schistosomiasis. Total 75 positive and 60 negative buffalo serum samples were tested to determine the reactivity of SEA extracts. Treatment of liver homogenates with high concentration of NaOH for a long time at the high temperature significantly reduced thereactivity of SEA by causing aggression and ablation of egg contents and increased rate of empty egg shells. The SEA products obtained from liver homogenates treated with 5%, 10% and 20% NaOH reacted in ELISA with positive serum samples diluted at 1:800, 1:1600 and 1:3200, which were lower than the SEA extracted from eggs by mesh method and diluted at 1:400. The results of ELISA showed that the sensitivity and specif city were 93% and 100%, which were 5% and 3% higher than the SEA obtained by mesh method. The optimal conditions to isolate eggs from livers were 5%-10% NaOH at 45℃ for 5-10min. The yield of eggs was almost three times more than conventional mesh method. These results indicated that a large amount of pure eggs could be isolated without loss of antigenicity by using simple and rapid NaOH-maceration method.

Schistosoma japonicum;egg; NaOH; antigenicity

S852.735

A

1674-6422（2014）06-0058-08

2014-07-31

國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)基金（200903036)；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（2014JB01）

趙登云，女，碩士研究生，獸醫(yī)學(xué)專業(yè)

朱傳剛， E-mail：zcg@shvri.ac.cn