腸炎沙門菌I型菌毛主要亞單位FimA原核表達(dá)及純化

王勇祥，孟 霞，段進(jìn)坤，周明旭，陶 潔，楊 溢，朱國強(qiáng)

（1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州225009；2.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009）

沙門菌屬是寄生于人和動(dòng)物腸道內(nèi)的革蘭陰性桿菌，同時(shí)也是重要的人畜共患病病原菌之一。腸炎沙門菌（Salmonella enteritidis）是沙門菌的一種常見血清型，具有廣泛的宿主譜，不僅能引起家禽、豬和牛等不同動(dòng)物致病造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而且被污染的家禽產(chǎn)品作為腸炎沙門菌的攜帶者，通過食物鏈嚴(yán)重危害人類健康[1,2]。隨著養(yǎng)禽業(yè)的迅速發(fā)展和抗生素的不合理利用，導(dǎo)致沙門菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，耐藥菌株不斷增加，耐藥譜也逐漸變寬。在預(yù)防和治療沙門菌感染的過程中，尋找新的防御措施刻不容緩[3-5]。近年來，越來越多的研究證明非編碼sRNAs (non-coding small RNAs)在細(xì)菌感應(yīng)外界環(huán)境變化，調(diào)控基因表達(dá)中發(fā)揮十分重要的作用。目前已在大腸桿菌、沙門菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)單核細(xì)胞李氏桿菌和銅綠假單胞菌等多種病原菌中發(fā)現(xiàn)與致病調(diào)控相關(guān)的sRNA，這些sRNA通過調(diào)節(jié)毒力相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控病原菌對宿主細(xì)胞的黏附、侵襲，以及在巨噬細(xì)胞中的存活和毒力蛋白的分泌[6-13]。

腸炎沙門菌sRNA IsrE由毒力島基因編碼，并且與大腸桿菌sRNA RyhB具有較高的同源性[10,14,15]。當(dāng)菌體處于穩(wěn)定生長期、鐵缺乏、氧應(yīng)激以及沙門菌在侵染巨噬細(xì)胞時(shí)，sRNA IsrE的表達(dá)量上升，推測沙門菌sRNA IsrE參與對細(xì)菌毒力基因的表達(dá)調(diào)控[16]，但I(xiàn)srE調(diào)控哪些基因的表達(dá)從而影響沙門菌的毒力目前還不清楚。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，sRNA IsrE在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié) fimA的表達(dá)并影響對表皮細(xì)胞的黏附（數(shù)據(jù)未發(fā)表），因此本研究致力于腸炎沙門菌sRNA IsrE對fimA的調(diào)控機(jī)理進(jìn)行深入研究，構(gòu)建以pET-28a（+）為原核表達(dá)載體、fimA為目的基因的重組蛋白，在大腸桿菌BL21(DE3)中進(jìn)行表達(dá)，并利用Ni-NTA親和層析分離純化FimA重組蛋白，為進(jìn)一步研究和驗(yàn)證腸炎沙門菌非編碼sRNA IsrE在轉(zhuǎn)錄后水平參與對fimA的調(diào)控奠定了基礎(chǔ)，為防控沙門菌的感染提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 菌株與載體 腸炎沙門菌國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株CMCC(B)50336由揚(yáng)州大學(xué)焦新安教授惠贈(zèng)；大腸桿菌BL21（DE3）、DH5a，原核表達(dá)載體pET-28a（+）均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 pEASY-T1 Simple Cloning Kit、1kb DNA Ladder Marker、DL2000 DNA Marker均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶NcoI和XhoI、ExTaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶均購自大連（日本）TaKaRa公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）購自大連寶生物工程有限公司；胰蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物 (Yeast extract)購自O(shè)xoid公司；鼠抗6×His-Tag單克隆抗體購自南京生興生物技術(shù)有限公司；羊抗鼠IgG-HRP（Horseradish peroxidase, 辣根過氧化物酶）購于武漢博士德生物工程有限公司；DNA凝膠回收試劑盒（離心柱型）購自天根生化科技有限公司；PageRulerTMPrestained Protein Ladder 購自Thermo公司；Protino?Ni-TED 2000 packed columns 購自德國Macherey-Nagel 公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的fimA基因序列（NC_011294.1），設(shè)計(jì)兩端含有限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I酶切位點(diǎn)的引物。fimA UP：5'-CATGCCATGGCCTCTACTATTGCGAGT-3'（下劃線堿基序列為Nco I識(shí)別序列）；fimA LO：5'-CCGCTCGAGTTCGTATTTCATGATAA-3'（下劃線堿基序列為Xho I識(shí)別序列）。上述引物序列由上?；瞪锛夹g(shù)有限公司合成。引物以超純水溶解并稀釋至10 pmol/mL，置于－20℃凍存。

1.4 PCR模板的制備 采用煮沸裂解法制備模板[17]，－20℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 目的基因f i mA PCR擴(kuò)增體系與程序 PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：10×Ex PCR Buffer 5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、10 pmol/mL 引物fimA UP 2μL、引物fimA LO 2μL、DNA模板5μL、Ex Taq酶1 μL 、滅菌ddH20補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃ 預(yù)變性 5 min，94℃ 變性30 s ，54℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴(kuò)增25個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。

1.6 目的基因fimA的克隆與鑒定 fimA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化后，連接pEASY-T1 Simple Cloning Kit 載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布AXI（Amp、X-gal、IPTG）平板，置37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12 h；隨機(jī)挑選白色單菌落，接種于3 mL Amp+LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)12 h，堿裂解法提取質(zhì)粒。分別以提取的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)以及限制性核酸內(nèi)切酶鑒定篩選陽性重組子。對于鑒定正確的重組子送華大基因進(jìn)行測序，測序結(jié)果利用DNAStar軟件進(jìn)行序列分析。

1.7 pET-28a(+)-fimA重組表達(dá)載體的構(gòu)建 分別用限制性核酸內(nèi)切酶Nco I和Xho I對表達(dá)載體pET-28a(+)和測序正確的T-A陽性克隆進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離雙酶切產(chǎn)物，切膠回收酶切后的pET-28a(+)和fimA片段。T4 DNA連接酶于16℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布Kan+LB平板于37℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)12 h，挑取單克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并經(jīng)PCR和雙酶切鑒定。選取陽性克隆質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，并經(jīng)PCR和雙酶切鑒定。鑒定正確的陽性克隆送華大基因進(jìn)行測序。

1.8 FimA重組蛋白的表達(dá)和純化

1.8.1 FimA重組蛋白的表達(dá)

1.8.1.1 FimA重組蛋白表達(dá)的優(yōu)化 將鑒定正確的pET-28a(+)- fimA→BL21（DE3）單菌落接種于3 mL Kan+LB（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)過夜，次日以1:100比例轉(zhuǎn)接于5mL Kan+LB（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，至菌體濃度OD600為0.4～0.6。分別對IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行優(yōu)化。IPTG終濃度分別：0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L；誘導(dǎo)溫度：30℃和37℃；誘導(dǎo)時(shí)間分別：1、2、3、4 h，然后進(jìn)行SDS-PAGE分析，觀察重組蛋白的表達(dá)量。1.8.1.2 FimA重組蛋白的表達(dá)形式分析 將鑒定正確的pET-28a(+)-fimA→BL21（DE3）單菌落接種于3 mL Kan+LB（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)過夜，次日以1:100比例轉(zhuǎn)接于5 mL Kan+LB（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)至菌體濃度OD600為0.4～0.6，加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，37℃培養(yǎng)4 h，收集菌液并進(jìn)行超聲裂解，等量選取菌體的沉淀和上清分別進(jìn)行SDS-PAGE，根據(jù)SDS-PAGE結(jié)果確定重組蛋白的表達(dá)形式。

1.8.2 FimA重組蛋白的純化 將鑒定正確的pET-28a(+)- fimA→BL21（DE3）單菌落接種于3 mL Kan+LB（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)過夜，次日于1:100比例轉(zhuǎn)接于500 mL Kan+LB（50 μg/mL）液體培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)至菌體濃度OD600為0.4～0.6，加入IPTG至終濃度為0.6 mmol/L，37℃培養(yǎng)4 h，收集菌液并進(jìn)行超聲裂解。用Ni-NTA金屬螯合層析柱純化目的蛋白，純化方法按照德國MACHEREY-NAGEL公司的操作手冊進(jìn)行。

1.9 Western blot鑒定重組蛋白FimA 將純化產(chǎn)物經(jīng)12%SDS-PAGE電泳后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印至NC膜上，用含10%脫脂奶粉的PBST溶液4℃封閉過夜，PBST漂洗3次，每次5 min；一抗為1:4000稀釋的鼠抗6×His-Tag單克隆抗體，室溫結(jié)合1.5 h，PBST漂洗3次，每次5 min；二抗為1:4000稀釋的羊抗鼠IgGHRP，室溫結(jié)合1.5 h，PBST漂洗3次，每次5 min。用DAB顯色試劑盒對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行顯色鑒定。

2 結(jié)果

2.1 fimA基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定 以腸炎沙門菌CMCC（B）50336為模板，fimA UP、fimA LO為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析，條帶大小與預(yù)期相符（圖1）。將擴(kuò)增的基因片段克隆到pEASY-T1 Simple Cloning Kit載體中，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Nco I和Xho I雙酶切鑒定正確后測序。與GenBank上已發(fā)表的fimA基因序列（NC_011294.1）進(jìn)行同源比對，比對結(jié)果分析表明，二者基因序列完全相同，同源性為100%，擴(kuò)增目的基因片段大小為543 bp且閱讀框正確。

圖1 fimA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR result of fimA gene

2.2 pET-28a(+)-fimA重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定 選取測序正確的陽性克隆提取質(zhì)粒，質(zhì)粒和表達(dá)載體分別經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切，回收目的片段與載體片段進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a菌株，獲得表達(dá)載體pET-28a(+)-fimA。經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切后，電泳可見約5200 bp的載體片段和約543 bp的目的片段（圖2），表明目的基因fimA已插入pET-28a(+)表達(dá)載體中。將鑒定正確的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株，挑取陽性克隆，獲得表達(dá)菌株。

圖2 重組質(zhì)粒pET-28a(+)- fimA酶切鑒定Fig.2 Identi fication of recombinant expression vectors pET-28a(+)- fimA by double enzyme digestion

2.3 pET-28a(+)-FimA重組蛋白表達(dá)優(yōu)化 SDS-PAGE電泳顯示不同的IPTG濃度誘導(dǎo)的FimA重組蛋白在約19 kDa處有一條明顯的蛋白條帶，其中0.6 mmol/L IPTG濃度下，蛋白條帶顏色最深（圖3）。從誘導(dǎo)溫度來看，與37℃培養(yǎng)條件相比，30℃時(shí)蛋白表達(dá)量較低（圖略）。從誘導(dǎo)時(shí)間來看，誘導(dǎo)時(shí)間從1 h至4 h均有重組蛋白產(chǎn)生，但培養(yǎng)時(shí)間為4 h時(shí)，所誘導(dǎo)的蛋白量濃度最高（圖略）。所以最終確定的FimA重組蛋白的誘導(dǎo)條件為：IPTG終濃度為0.6 mmol/L，37℃培養(yǎng)4 h。

圖3 不同IPTG濃度下重組蛋白的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis for the recombinant protein under different IPTG concentration

2.4 FimA重組蛋白的表達(dá)形式分析和純化 對重組表達(dá)載體pET-28a (+)-fimA進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，將菌體超聲破碎離心，上清與沉淀分別進(jìn)行SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要以包涵體的形式存在（圖4）。將沉淀用Ni2+金屬螯合柱進(jìn)行親和層析純化，純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，約19 kDa處可見一條特異性條帶，且純度較高（圖5）。

圖4 重組蛋白的可溶性分析Fig.4 Identi fication of the recombinant protein by SDSPAGE

2.5 重組蛋白FimA Western blot鑒定 Western blot結(jié)果顯示，純化后的重組蛋白可被His-Tag單克隆抗體識(shí)別，說明表達(dá)的重組蛋白帶有His-Tag， pET-28a（+）空載體對照并無此免疫原性（圖6），結(jié)果表明pET-28a（+）-fimA→BL21（DE3）成功表達(dá)了FimA重組蛋白。

3 討論

圖5 重組蛋白的純化Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant protein

圖6 重組蛋白的Western blot分析Fig.6 Western blot analysis of the recombinant protein

細(xì)菌非編碼小RNA是一類長度在50～500個(gè)核苷酸之間，通常位于細(xì)菌染色體基因間區(qū)，轉(zhuǎn)錄但不編碼蛋白質(zhì)的一類RNA分子[18,19]。近年來，sRNAs作為一類新型的基因表達(dá)調(diào)控子，通過與靶標(biāo)mRNAs堿基互補(bǔ)或模擬核酸結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性等機(jī)制，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)菌物質(zhì)代謝、生物被膜和外膜蛋白的合成以及毒力基因表達(dá)等多種生理功能[20-25]。腸炎沙門菌sRNA IsrE由毒力島基因編碼，并且在侵染巨噬細(xì)胞時(shí)，sRNA IsrE的表達(dá)量上升，推測沙門菌sRNA IsrE參與對細(xì)菌毒力基因的表達(dá)調(diào)控[16]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，sRNA IsrE在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)fimA的表達(dá)并影響對表皮細(xì)胞的黏附（數(shù)據(jù)未發(fā)表），因此本試驗(yàn)克隆了腸炎沙門菌CMCC（B）50336 I型菌毛主要亞單位fimA基因，并構(gòu)建fimA的原核表達(dá)載體pET-28a（+）- fimA，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3），構(gòu)建了fimA的原核表達(dá)菌株。經(jīng)SDSPAGE分析重組目的蛋白主要以包涵體的形式存在于細(xì)菌裂解液的沉淀中，經(jīng)Ni-NTA螯合柱親和層析純化，得到純度較高的分子質(zhì)量約為19 kDa的FimA目的蛋白。

純化FimA蛋白對于研究沙門菌sRNA IsrE參與對細(xì)菌毒力基因的表達(dá)調(diào)控，揭示沙門菌的致病機(jī)制具有重要作用；同時(shí)也為后續(xù)試驗(yàn)的相關(guān)檢測提供依據(jù)，并為深入研究沙門菌sRNA IsrE在轉(zhuǎn)錄后水平參與對 fimA調(diào)控的可能性奠定了基礎(chǔ)。

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