吳曉燕，王 卉，張錦明，田嘉禾

解放軍總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100853

PET凋亡細胞顯像探針的研究進展

吳曉燕，王 卉，張錦明，田嘉禾

解放軍總醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，北京 100853

細胞凋亡是生命體的一種基本生理機制?；铙w檢測腫瘤組織的凋亡細胞將來可能應(yīng)用于臨床實踐，尤其是對腫瘤治療和預(yù)后的預(yù)測，對指導(dǎo)腫瘤個體化治療具有重要的意義。PET作為分子影像顯像手段，在凋亡顯像研究中具有很大優(yōu)勢?；诘蛲鲲@像的重要性，許多有潛力的PET探針被開發(fā)出來，包括正電子核素標記的膜聯(lián)蛋白Annexin-V，靛紅衍生物類Caspase-3抑制劑、疏水性陽離子和Apo-sense化合物，上述探針針對凋亡過程中的不同靶點，能夠不同程度地反映出活體組織細胞凋亡狀態(tài)。

PET；分子探針；凋亡；活體顯像

活體凋亡分子影像將來有可能為臨床實踐提供重要信息，比如協(xié)助疾病的早期診斷、監(jiān)測疾病的進程、評估疾病的治療效果和協(xié)助開展新的療法[1]。正電子發(fā)射體層成像(positron emission tomography，PET)檢查作為臨床上判斷癌癥分期、評估治療方案和監(jiān)測治療效果的重要手段，其成像質(zhì)量高于其他核醫(yī)學(xué)顯像儀器，是首選的活體凋亡細胞顯像方法，所以開發(fā)出能夠適用于臨床實踐的PET凋亡顯像探針應(yīng)用前景較好。目前開發(fā)的凋亡分子探針主要應(yīng)用于光學(xué)顯像和核醫(yī)學(xué)顯像，但目前還沒有正電子標記的PET顯像劑適用于臨床[1]。細胞凋亡程序啟動后，細胞發(fā)生一系列改變，諸如質(zhì)膜變化、酶原被激活等，這些改變可以成為顯像探針的追蹤靶點，根據(jù)這些“靶點”的不同，目前應(yīng)用研究的大部分凋亡探針可大致分成4類： 針對細胞膜上的磷脂酰絲氨酸外翻和磷脂不對稱分布的探針，顯示Caspase酶活性的探針，顯示線粒體膜勢能改變的探針和反應(yīng)膜改變印跡的探針。本文對應(yīng)用于凋亡細胞顯像的PET探針予以綜述。

1 針對細胞膜上的磷脂酰絲氨酸外翻的探針

在正常細胞的質(zhì)膜上磷脂類是不對稱分布的，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)帶負電荷的磷脂端朝向細胞膜內(nèi)側(cè)胞質(zhì)，在凋亡發(fā)生時PS向外翻轉(zhuǎn)顯著[2]。這是凋亡過程中普遍存在的現(xiàn)象。細胞受到凋亡誘導(dǎo)后，細胞膜上可迅速出現(xiàn)大量的外翻PS結(jié)合位點[3]。分子探針直接結(jié)合膜上外翻的PS，可用于凋亡顯像。但是因為其他形式的細胞死亡(壞死、自噬)也存在磷脂酰絲氨酸翻轉(zhuǎn)的改變，所以PS外翻是細胞凋亡的非特異性改變。

Annexin V是人類磷脂酰絲氨酸結(jié)合蛋白，是目前應(yīng)用最廣的PS直接結(jié)合劑，其優(yōu)點是對凋亡細胞的親和力非常高，蛋白質(zhì)序列中通過重組DNA技術(shù)引入一段短的帶有氨基末端的肽，該處能夠連接多個熒光基團或者形成金屬螯合劑，直接螯合锝Tc99m，并可在特異位點連接順丁烯二酰亞胺(18F- maleimide compound)形成衍生物，制備成正電子示蹤劑[4-5]。

PET使用最多的同位素為氟18(18F)，其半衰期是110 min，這要求快速而有效的標記。因Annexin-V含有大量需要保護的功能基團，標記時需經(jīng)過復(fù)雜的脫保護步驟。直接標記18F的過程耗時長、不實用，可采用先標記某一基團，如N-succinimidyl 4-18F-fluorobenzoate harbors numerous functional，形成Annexin-V衍生物，再于該衍生物上標記18F的方法[6]。盡管能獲得良好的標記率，但這種探針的標記和純化步驟十分復(fù)雜，尤其不適合用于常規(guī)臨床檢測[7]。Annexin-V在體內(nèi)的清除率緩慢，而且其標記過程耗時較長，除18F以外，長半衰期同位素64Cu或124I(半衰期分別為12.7 h和4.2 d)的標記也有報道研究，但是這些并不適合常規(guī)的臨床應(yīng)用[8-9]。

2 顯示Caspase-3活性的的探針

細胞凋亡是由蛋白水解級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)的。Caspase是一組半胱天冬氨酸酶，在凋亡發(fā)生時，該酶參與凋亡起始、調(diào)節(jié)和執(zhí)行下游一系列酶聯(lián)反應(yīng)事件[10]。Caspase-3是細胞凋亡的主要執(zhí)行者之一，該酶的前體存在于胞液中，經(jīng)由細胞內(nèi)、外兩種途徑激活。凋亡過程中發(fā)生的大量蛋白質(zhì)裂解、染色質(zhì)邊集、DNA片段化、細胞核瓦解等事件，Caspase-3的作用是必不可少的[11-12]。所以，檢測Caspase-3的活性可用于鑒別組織切片中的凋亡細胞，這類方法是特異的，甚至能在凋亡形態(tài)學(xué)特征出現(xiàn)之前檢測到凋亡。這類探針根據(jù)與Caspase-3的反應(yīng)類型的不同，分為Caspase-3直接拮抗劑類(小分子類)和Caspase-3的底物衍生物類。

2.1 Caspase-3直接拮抗劑類 盡管最初的研究傾向于開發(fā)肽結(jié)構(gòu)的拮抗劑，但是取得較大進展的是新型小分子Caspase-3抑制劑。靛紅類化合物(5-pyrrolidinylsulfonyl isatin)是一類非肽類的Caspase-3抑制劑，檢測Caspase-3的探針是從該類小分子抑制劑衍生而來[13]。細胞內(nèi)Caspase-3活化后，該靛紅類分子的二羰基能共價結(jié)合位于Caspase-3活性中心的半胱氨酸殘基，起到拮抗Caspase-3的作用[14]。靛紅類衍生物反應(yīng)靈敏，體外Caspase-3的活性半抑制濃度IC50在nMol/L數(shù)量級。18F標記的靛紅氨苯磺胺類探針研究較多，比如18F-ICMT-11，PET顯像實驗已經(jīng)證實該探針的攝取與細胞凋亡正相關(guān)[15-16]。此類探針的缺點是腹部器官的非特異性攝取較高，顯像質(zhì)量有待提高[17]。除此之外，還有11C標記的結(jié)合Caspase-3的配體，如11C-WC-98和18FWC-IV-3在實驗中表現(xiàn)出對凋亡細胞的高親和力，可在體外抑制分離純化Caspase-3酶活性。有文獻報道在放線菌酮和死亡配體抗體體外誘導(dǎo)的肝凋亡細胞中，有該類探針的累積性攝取，后經(jīng)組織學(xué)評估證實有明確的凋亡發(fā)生[13,18]。

限制該靛紅抑制劑類探針應(yīng)用的一大問題是，抑制劑在從體外分離的Caspase-3酶系統(tǒng)到整個細胞再到活體的不同條件下，其對Caspase-3的親和力有明顯下降，而到活體顯像時，所需探針的濃度需顯著提高才能達到抑制Caspase-3酶的效果[19]。這一現(xiàn)象可能與細胞內(nèi)或活體的非特異性化學(xué)反應(yīng)有關(guān)，靛紅類分子的二羰基也能共價結(jié)合其他半胱氨酸蛋白水解酶類，如組織蛋白酶類。

2.2 Caspase-3的底物衍生物類 該類分子結(jié)構(gòu)中含有4個氨基酸殘基D-E-V-D(Asp-Glu-Val-Asp)的序列，使得該類探針能夠被Caspase-3酶特異性識別，顯示Caspase-3的活性。這類探針有18F標記的CP-18。初步體內(nèi)外實驗顯示18F-CP-18直接反映Caspase-3活性，檢測凋亡發(fā)生的靈敏度較高，但是動物顯像發(fā)現(xiàn)腹部本底信號很高[20]。盡管這類探針理論上應(yīng)用前景較好，但是之前的一些顯像實驗發(fā)現(xiàn)圖像有相對較低的信噪比值[21-22]。這可能是因為D-EV-D并不只是Caspase-3的特異識別位點，活體內(nèi)還存在其他的酶能夠識別該類探針，或者在正常生理條件下胃腸道也存在大量的凋亡細胞。

3 顯示線粒體膜勢能改變的探針

正常細胞的線粒體跨膜負電位水平高，允許陽離子內(nèi)向移動到線粒體基質(zhì)，導(dǎo)致親脂陽離子(疏水性陽離子)聚集于線粒體膜內(nèi)。該跨線粒體內(nèi)膜的質(zhì)子電化學(xué)梯度的喪失是細胞凋亡的特征之一[23]。線粒體膜勢能的變化可被親脂陽離子的復(fù)位電位水平反映出來。因為細胞內(nèi)含有大量數(shù)目的線粒體，可作為潛在的凋亡有效靶點。實驗發(fā)現(xiàn)用于凋亡顯像的18F標記的器官組織陽離子(18F-fluorobenzyltriphenylphosphonium cation，18F-FBnTP)在星狀孢子素誘導(dǎo)的肺腺癌細胞和紫杉醇誘導(dǎo)的乳腺癌細胞中攝取逐漸減少，這是因為體外線粒體數(shù)目有限，而且逐漸被破壞，有效靶點逐漸減少，但是在活體的心臟和腎有較高的攝取[24-25]。

該類探針在活體顯像不同于其他類探針信號在一段時間內(nèi)積累增加，而是隨著越來越多的線粒體跨膜的質(zhì)子電化學(xué)梯度喪失，攝取速率較快減少，信號也隨之很快減少，這造成了應(yīng)用該類探針顯像的困難。所以該類探針應(yīng)用于心臟和腎這類線粒體高密度分布的器官效果較好，而在低代謝的器官顯像效果可能不佳。

4 顯示膜改變印跡的探針

凋亡細胞的膜改變印跡是與凋亡相關(guān)的復(fù)雜細胞變化，包括不可逆的質(zhì)膜潛能喪失、持久的外部質(zhì)膜和胞液酸化、維護細胞膜完整性的脂質(zhì)移行酶系統(tǒng)的激活等，這些協(xié)同發(fā)生的細胞復(fù)合特征可將其與壞死區(qū)分開[26-27]。依據(jù)此設(shè)計的一組新型小分子探針，商品名為Apo-Sense的探針(N，N'-didansylcystine)。該種化合物在凋亡細胞中濃聚量均高于正常細胞兩倍左右。顯像劑濃聚的可能原因為，早期凋亡細胞的質(zhì)膜不完整，這類化合物能夠進入凋亡細胞而不能進入質(zhì)膜完整的正常細胞，產(chǎn)生凋亡細胞顯像。報道了幾種Apo-sense化合物，例如DDC、ML-10、ML-9、NST-732和NST-729，這些化合物在臨床前期實驗的許多疾病模型中能夠較好地顯示凋亡細胞，如抗癌藥誘導(dǎo)的腫瘤凋亡、腎衰竭模型、局部缺血引起的腦卒中的神經(jīng)血管凋亡、神經(jīng)退行性疾病模型等。

PET探針18F-ML-10是Apo-sense家族中的一種小型的化合物，分子量為206[26]。它表現(xiàn)出凋亡細胞的選擇性攝取，可能與線粒體跨膜電位破壞、Caspase激活或DNA片段化相關(guān)，其攝取機制目前還不清楚。18F-ML-10是第一個應(yīng)用于臨床的PET凋亡細胞探針，臨床試驗獲得了良好的結(jié)果[28]。健康志愿者的臨床一期試驗顯示，其在體內(nèi)有高穩(wěn)定性、良好的生物分布和安全的劑量范圍。臨床二期試驗中，急性缺血性腦卒中病人神經(jīng)血管細胞的PET凋亡顯像與CT檢查所見匹配良好[29-31]。關(guān)于該示蹤劑的更多臨床試驗有待開展。

5 結(jié)語

近年來，細胞凋亡的生物學(xué)研究越來越深入，進一步闡明了凋亡的發(fā)生過程，這為凋亡細胞的活體顯像研究提供了更多思路，其檢測手段也有很大提高。上述總結(jié)的4類PET探針各有優(yōu)勢，能夠不同程度地反映出活體組織細胞凋亡狀態(tài)，將來或許能夠發(fā)展成為應(yīng)用于臨床的凋亡細胞顯像探針。

1 Neves AA， Brindle KM. Imaging cell death［J］. J Nucl Med， 2014，55（1）： 1-4.

2 Demchenko AP. Beyond annexin V： fluorescence response of cellular membranes to apoptosis［J］. Cytotechnology， 2013， 65（2）：157-172.

3 Khoda Me， Utsunomiya K， Ha-Kawa S， et al. An investigation of the early detection of radiation induced apoptosis by 99mTc-Annexin V and 201thallium-chloride in a lung cancer cell line［J］. J Radiat Res， 2012， 53（3）： 361-367.

4 Li X， Link JM， Stekhova S， et al. Site-specific labeling of annexin V with F-18 for apoptosis imaging［J］. Bioconjug Chem， 2008， 19（8）：1684-1688.

5 Jeppesen B， Smith C， Gibson DF， et al. Entropic and enthalpic contributions to annexin V-membrane binding： a comprehensive quantitative model［J］. J Biol Chem， 2008， 283（10）： 6126-6135.

6 Lin KJ， Wu CC， Pan YH， et al. In vivo imaging of radiation-induced tissue apoptosis by （99m）Tc（I）-his （6）-annexin A5［J］. Ann Nucl Med， 2012， 26（3）： 272-280.

7 Wang MW， Wang F， Zheng YJ， et al. An in vivo molecular imaging probe （18）F-Annexin B1 for apoptosis detection by PET/CT：preparation and preliminary evaluation［J］. Apoptosis， 2013， 18（2）：238-247.

8 Huang J， Cui L， Wang F， et al. PET tracers based on （86）Y［J］. Curr Radiopharm， 2011， 4（2）： 122-130.

9 Tochon-Danguy H， Poniger S， Panopoulos HA， et al. Automated production of 124I and 64Cu using IBA Terimo and Pinctada metal electroplating and processing modules［J］. Intern Med J， 2013， 43（1，SI）： 37.

10 Falschlehner C， Boutros M. Innate immunity： regulation of caspases by IAP-dependent ubiquitylation［J］. EMBO J， 2012， 31（12）：2750-2752.

11 Xiao Z， Shan J， Li C， et al. Mechanisms of cyclosporine-induced renal cell apoptosis： a systematic review［J］. Am J Nephrol， 2013，37（1）： 30-40.

12 Boland K， Flanagan L， Prehn JH. Paracrine control of tissue regeneration and cell proliferation by Caspase-3［J］. Cell Death Dis， 2013， 4：e725.

13 Chen DL， Zhou D， Chu W， et al. Comparison of radiolabeled isatin analogs for imaging apoptosis with positron emission tomography［J］. Nucl Med Biol， 2009， 36（6）： 651-658.

14 Krause-Heuer AM， Howell NR， Matesic LA， et al. A new class of fluorinated 5-pyrrolidinylsulfonyl isatin caspase inhibitors for PET imaging of apoptosis［J］. Medchemcomm， 2013， 4（2）： 347-352.

15 Challapalli A， Kenny LM， Hallett WA， et al. 18F-ICMT-11， a caspase-3-specific PET tracer for apoptosis： biodistribution and radiation dosimetry［J］. J Nucl Med， 2013， 54（9）： 1551-1556.

16 Witney TH， Fortt RR， Aboagye EO. Preclinical assessment of carboplatin treatment efficacy in lung cancer by 18F-ICMT-11-positron emission tomography［J］. PLoS One， 2014， 9（3）：e91694.

17 G. Haufe， et al. Fluo 7-fluorinated isatin derivatives： Potential agents for apoptosis imaging by positron emission tomography ［J/ OL］. http：//oasys2.confex.com/acs/236nm/techprogram/P1180846. HTM.

18 Zhou D， Chu W， Chen DL， et al. 18F］- and ［11C］-labeled N-benzyl-isatin sulfonamide analogues as PET tracers for apoptosis：synthesis， radiolabeling mechanism， and in vivo imaging study of apoptosis in Fas-treated mice using ［11C］WC-98［J］. Org Biomol Chem， 2009， 7（7）： 1337-1348.

19 Jiang H， Zhao PJ， Su D， et al. Paris saponin I induces apoptosis via increasing the Bax/Bcl-2 ratio and caspase-3 expression in gefitinib-resistant non-small cell lung cancer in vitro and in vivo［J］. Mol Med Rep， 2014， 9（6）： 2265-2272.

20 Xia CF， Chen G， Gangadharmath U， et al. In vitro and in vivo evaluation of the caspase-3 substrate-based radiotracer ［（18）F］-CP18 for PET imaging of apoptosis in tumors［J］. Mol Imaging Biol，2013， 15（6）： 748-757.

21 Haberkorn U， Kinscherf R， Krammer PH， et al. Investigation of a potential scintigraphic marker of apoptosis： radioiodinated Z-Val-Ala-DL-Asp（O-methyl）-fluoromethyl ketone［J］. Nucl Med Biol， 2001， 28（7）： 793-798.

22 Hight MR， Cheung YY， Nickels ML， et al. A peptide-based positron emission tomography probe for in vivo detection of caspase activity in apoptotic cells［J］. Clin Cancer Res， 2014， 20（8）： 2126-2135.

23 Smith MA， Schnellmann RG. Calpains， mitochondria， and apoptosis［J］. Cardiovasc Res， 2012， 96（1）： 32-37.

24 Madar I， Ravert H， Nelkin B， et al. Characterization of membrane potential-dependent uptake of the novel PET tracer 18F-fluorobenzyl triphenylphosphonium cation［J］. Eur J Nucl Med Mol Imaging，2007， 34（12）： 2057-2065.

25 Madar I， Huang Y， Ravert H， et al. Detection and quantification of the evolution dynamics of apoptosis using the PET voltage sensor 18F-fluorobenzyl triphenyl phosphonium［J］. J Nucl Med， 2009，50（5）： 774-780.

26 Cohen A， Shirvan A， Levin G， et al. From the Gla domain to a novel small-molecule detector of apoptosis［J］. Cell Res， 2009， 19（5）：625-637.

27 Chen J， Jin X， Chen J， et al. Glycyrrhiza polysaccharide induces apoptosis and inhibits proliferation of human hepatocellular carcinoma cells by blocking PI3K/AKT signal pathway［J］. Tumour Biol，2013， 34（3）： 1381-1389.

28 H?glund J， Shirvan A， Antoni G， et al. 18F-ML-10， a PET tracer for apoptosis： first human study［J］. J Nucl Med， 2011， 52（5）：720-725.

29 Reshef A， Shirvan A， Waterhouse RN， et al. Molecular imaging of neurovascular cell death in experimental cerebral stroke by PET［J］. J Nucl Med， 2008， 49（9）： 1520-1528.

30 Oborski MJ， Laymon CM， Lieberman FS， et al. First use of （18）F-labeled ML-10 PET to assess apoptosis change in a newly diagnosed glioblastoma multiforme patient before and early after therapy［J］. Brain Behav， 2014， 4（2）： 312-315.

31 Kadirvel M， Fairclough M， Cawthorne C， et al. Detection of apoptosis by PET/CT with the diethyl ester of ［18F］ML-10 and fluorescence imaging with a dansyl analogue［J］. Bioorg Med Chem， 2014， 22（1）：341-349.

Advances in radiotracer for PET imaging of apoptosis

WU Xiao-yan, WANG Hui, ZHANG Jin-ming, TIAN Jia-he
Nuclear Medicine Department, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

TIAN Jia-he. Email: tianjh@sina.vip.com

Apoptosis is a fundamental biologic process. Molecular imaging of apoptosis in vivo may have important implications for clinical practice, especially for treatment and prognosis of malignancies. PET, as a radionuclide imaging method, has an advantage in functional molecular imaging, which plays an important role in apoptosis imaging studies of tumor. In recent years, many PET probes based on the importance of apoptosis imaging are being developed, including positron radionuclide labeled Annexin-V, Caspase-3 inhibitor, Hydrophobic positive ion and the structures targeting various steps of the apoptotic cascade mentioned above can reflect the apoptotic status of living tissue cells.

PET; molecular probes; apoptosis; in vivo imaging

R 455.9

A

2095-5227(2014)10-1075-03

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.10.027

時間：2014-06-06 17:17

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140606.1717.004.html

2014-04-18

科技部重大儀器專項(2011YQ030114)

Supported by the National Major Scientific Equipment Special (2011YQ030114)

吳曉燕，女，在讀碩士。研究方向：腫瘤核醫(yī)學(xué)。Email: wxymailbox@sina.com

田嘉禾，教授，博士生導(dǎo)師。Email: tianjh@sina.vip.com