滋腎清心湯對圍絕經(jīng)期大鼠卵巢bcl-2和bax表達影響的實驗研究

雷雯 繆婷玉 陳赟 盧蘇

（1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京 210029）

滋腎清心湯對圍絕經(jīng)期大鼠卵巢bcl-2和bax表達影響的實驗研究

雷雯1繆婷玉1陳赟2盧蘇2

（1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)院，江蘇南京 210029）

目的：研究中藥滋腎清心湯對圍絕經(jīng)期大鼠卵巢bcl-2和bax蛋白表達的影響，探討滋腎清心湯治療圍絕經(jīng)期綜合征可能的作用機制。方法：選用自然衰老的圍絕經(jīng)期雌性大鼠，隨機分為4組（每組10只）：更年期大鼠模型組（模型組）和滋腎清心湯高、中、低劑量組，另選10只青年雌性大鼠作為青年對照組。連續(xù)灌胃處理4周后，采用蛋白印跡（Western blot）及RT-PCR檢測大鼠卵巢中Bcl-2和Bax蛋白及基因的表達。結果：與模型組相比，滋腎清心湯高劑量能顯著降低卵巢組織中Bax蛋白的表達，顯著上調(diào)Bcl-2/Bax的比值；滋腎清心湯各劑量均能明顯降低卵巢組織中Bax基因表達，明顯升高Bcl-2基因表達，從而顯著上調(diào)Bcl-2/Bax比值，延緩卵巢顆粒細胞的凋亡。結論：滋腎清心湯通過調(diào)節(jié)圍絕經(jīng)期大鼠卵巢中凋亡相關基因bcl-2和bax蛋白及基因的表達，上調(diào)Bcl-2/Bax蛋白及基因的比值，從而延緩卵巢衰老，這可能是其治療圍絕經(jīng)期綜合征的分子機制之一。

圍絕經(jīng)期綜合征 滋腎清心湯 卵巢 細胞凋亡 bcl-2 bax 實驗研究

圍絕經(jīng)期綜合征是指婦女在絕經(jīng)前后因為卵巢功能衰退，性激素水平波動而引起的一系列身體及精神心理癥狀。目前西醫(yī)主要采用激素替代療法（HRT）治療[1]，該方法具有嚴格的適應證及禁忌證，大量臨床研究表明激素替代療法存在潛在的致癌危險及其他不良反應，多數(shù)患者難以接受。滋腎清心湯是在中醫(yī)藥理論的指導下，結合臨床工作經(jīng)驗化裁而來，全方清心安神、滋腎養(yǎng)陰，臨床治療本病獲得較好的療效。本研究以卵巢細胞凋亡作為切入點，觀察滋腎清心湯對初老大鼠卵巢細胞凋亡相關基因Bcl-2、Bax表達的影響，探索滋腎清心湯在卵巢中可能的作用位點。

1 實驗材料

1.1 實驗動物SD大鼠，12～14月齡，40只，體重（350±20）g，經(jīng)陰道脫落細胞涂片檢查，呈現(xiàn)出動情周期紊亂、動情間期延長，確定為圍絕經(jīng)期鼠。4月齡大鼠10只，體重（200±20）g。大鼠均由浙江省動物實驗中心提供。飼養(yǎng)條件：二級實驗室，普通全價飼料喂養(yǎng)，自由攝水，室溫（24±2）℃，濕度45%～ 65%。大鼠適應性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 主要試劑滋腎清心湯，組方：蓮子心5g，黃連3g，鉤藤15g，炒酸棗仁15g，浮小麥30g，丹參10g，干地黃10g，山茱萸9g。中藥由江蘇省中醫(yī)院提供，水煎并濃縮，相當于生藥3.2g/mL，4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。中藥劑量按人體重60kg，5倍系數(shù)計算。內(nèi)參一抗（β-Actin）由Immunoway公司提供，二抗（羊抗小鼠IgG-HRP），二抗（羊抗兔IgG-HRP）由Jackson公司提供。cDNA第一鏈合成試劑盒和Taq DNA Polymerase由Thermo Fisher公司提供。Regular Agarose G10由Biowest公司提供。50×TAE電泳緩沖液由KeyGen公司提供。

2 實驗方法

2.1 分組與給藥將更年期大鼠隨機分為4組：更年期大鼠模型組（模型組）和清心滋腎方高、中、低劑量組。另取10 只4月齡大鼠作為青年對照組。清心滋腎方高、中、低劑量組分別灌服滋腎清心湯32g/（kg·d）、16g/（kg·d）、8g/（kg·d）。每日給大鼠灌胃1次，連續(xù)4周。模型組和青年對照組給予生理鹽水10mL/（kg·d）。每日給大鼠灌胃1次，連續(xù)4周。大鼠末次給藥24h后斷頭處死，快速取出雙側卵巢，經(jīng)液氮速凍后于-70℃冰箱凍存，用于組織蛋白的檢測。

2.2 Western blot法檢測卵巢中Bcl-2及Bax蛋白的表達提取大鼠卵巢總蛋白，進行SDS-PAGE轉膜，用質(zhì)量濃度為30g/L（0.03g/mL）的牛血清白蛋白（BSA）37℃封閉1h，再分別用Bcl-2、Bax和β-actin兔抗鼠多克隆抗體（1∶400）37℃孵育1h。TBST洗膜10min×3次，TBS洗膜10min。最后用ALP標記的山羊抗兔IgG（1∶500）37℃孵育1h。TBST洗膜10min×3次，TBS洗膜10min。NBT/BCIP顯色。以β-actin作為內(nèi)參照。

2.3 RT-PCR方法檢測卵巢中Bcl-2、Bax的基因取卵巢組織進行RNA提取，提取后進行RNA濃度和純度的鑒定，經(jīng)鑒定符合實驗要求后，進行cDNA第一鏈合成（20μL體系），然后進行PCR實驗。取滅過菌且無核酸酶的0.2mL離心管，在冰上依次加入如下組分：10×Taq Buffer 5μL；MgCl2（25mmol/L）4μL；dNTPs（10mmol/L）1μL；引物Ⅰ（10μmol/L）1μL；引物Ⅱ（10μmol/L）1μL；cDNA1μL；TaqDNA Polymerase 0.5μL；滅菌雙蒸水至總體積50μL。第一階段：95℃、5min預變性；第二階段：95℃、40s，56℃、40s，72℃、45s，32個循環(huán)，退火、變性、延伸；第三階段：72℃、10min最終延伸。引物序列及PCR產(chǎn)物大小見表1。

表1 引物序列及PCR產(chǎn)物大小

3 實驗結果

3.1 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2、Bax蛋白的表達治療后滋腎清心方各組均可升高圍絕經(jīng)期大鼠卵巢中的Bcl-2蛋白，與青年對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；降低Bax蛋白，與青年對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；升高Bcl-2/Bax蛋白的比值，與青年對照組比較中、低劑量組具有顯著性差異（P＜0.01），高劑量組未見差異性（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax蛋白表達比較（±s）

表2 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax蛋白表達比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與青年對照組比較，▲▲P＜0.01。

組別動物數(shù)（只）Bax Bcl-2Bcl-2/Bax青年對照組100.4033±0.0581**1.0100±0.35232.3504±0.9792**模型組101.0333±0.1812▲▲0.5167±0.19060.4629±0.1980▲▲滋腎清心湯低劑量組100.9133±0.13170.5933±0.22820.6105±0.2620▲▲滋腎清心湯中劑量組100.7433±0.17850.7267±0.31870.9057±0.3589▲▲滋腎清心湯高劑量組100.5633±0.2255*0.8867±0.34971.5153±0.4794*

3.2 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax基因的表達見表3。

表3 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax基因表達比較（±s）

表3 各組大鼠卵巢組織中Bcl-2及Bax基因表達比較（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與青年對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別動物數(shù)（只）bax bcl-2Bcl-2/Bax青年對照組100.9990±0.1590**0.9994±0.0031*1.0005±0.0170**模型組108.8051±0.78870.1526±0.02970.01712±0.0020滋腎清心湯低劑量組106.4810±0.6566**▲▲0.2803±0.0216*▲0.0436±0.0063*▲▲滋腎清心湯中劑量組104.7383±0.5839**▲▲0.4732±0.0164*▲0.1009±0.0131**▲▲滋腎清心湯高劑量組102.5693±0.3544**▲▲0.6444±0.0045*▲0.2543±0.0384**▲▲

4 討論

圍絕經(jīng)期綜合征是婦女絕經(jīng)前后出現(xiàn)性激素波動或減少所致的一系列身體及精神心理癥狀?，F(xiàn)代醫(yī)學認為婦女進入圍絕經(jīng)期后，卵巢功能衰退，分泌的雌激素減少，卵泡期延長，卵泡逐漸停止發(fā)育。由于雌激素分泌減少，對垂體的負反饋減弱，破壞了下丘腦—垂體—卵巢軸的平衡，產(chǎn)生下丘腦和垂體功能亢進的現(xiàn)象[2]。這些內(nèi)分泌環(huán)境的變化導致腦內(nèi)β-內(nèi)啡肽和5-羥色胺水平異常，一氧化氮、內(nèi)皮素的異常，CD3+、CD4+減少、CD8+增加等，從而出現(xiàn)精神情緒變化失調(diào)，交感神經(jīng)系統(tǒng)、體溫調(diào)節(jié)中樞不穩(wěn)定，血管舒縮平衡失調(diào)，免疫功能降低等一系列臨床癥狀。

目前研究認為是顆粒細胞的凋亡觸發(fā)卵泡閉鎖[3]。更年期婦女卵泡及顆粒細胞的急劇減少，產(chǎn)生的雌激素及促性腺激素受體減少，從而出現(xiàn)卵巢功能的減退。目前已經(jīng)闡明的凋亡信號傳導途徑主要有兩條：一條是細胞表面死亡受體途徑，另一條是線粒體途徑，這兩條途徑最終都匯集為Caspases家族蛋白酶的級反應過程[4]。Bcl-2和Bax在線粒體應激誘導的細胞凋亡中起關鍵作用。Bcl-2及Bax同屬于Bcl-2基因家族，Bcl-2能抑制細胞凋亡，Bax能促進細胞凋亡，Bax與bcl-2形成異二聚體復合物，維持促凋亡基因在細胞內(nèi)的定位分布，使細胞不進入凋亡程序[5]。但當Bax蛋白超表達時，Bax/Bax同源二聚體的數(shù)量明顯升高，細胞對死亡信號的反應性增強，啟動凋亡；當Bcl-2表達增高時，Bax/Bax二聚體解離，生成穩(wěn)定的Bcl-2Bax異源二聚體，對抗Bax的誘導凋亡作用[6]。已有研究表明，一切促進或抑制細胞凋亡的作用，都可歸結成Bcl-2/Bax比值的變化[7]。

為更確切地了解滋腎清心湯治療圍絕經(jīng)期綜合征的作用位點，我們對Bcl-2、Bax同時進行了基因和蛋白的檢測。結果表明，滋腎清心湯能夠促進圍絕經(jīng)期大鼠卵巢組織中Bcl-2的表達，抑制卵巢顆粒細胞凋亡，并能抑制Bax誘導卵巢顆粒細胞凋亡的作用，從而延緩卵巢衰老，這可能是其治療圍絕經(jīng)期綜合征的作用機制之一。

本實驗中采用RT-PCR與Westren blot檢測，對基因的調(diào)節(jié)作用較蛋白質(zhì)顯著。其原因可能是，在細胞內(nèi)，蛋白質(zhì)是決定細胞基因表型及對外信息發(fā)生的反應性，蛋白質(zhì)水平的表達不僅取決于基因轉錄的速率，也與mRNA的出核過程、細胞漿定位、轉錄物的穩(wěn)定性、mRNA翻譯調(diào)節(jié)及蛋白質(zhì)的降解密切相關，蛋白質(zhì)的生物活性及功能主要通過翻譯后加工、磷酸化及蛋白酶的水解而發(fā)生[8]，基因轉錄的mRNA水平并不能完全可靠地代替其相應蛋白質(zhì)的水平。

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編輯：吳寧

R289.53文獻識別碼A

1672-397X（2014）09-0071-02

雷雯（1987-），女，碩士研究生，中醫(yī)婦科學專業(yè)。

盧蘇，lusu0926@sina.com

2014-03-20