雷永華 李紅 徐蓉娟 范崇信

（1.鄭州市第一人民醫(yī)院，河南鄭州 450000；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

疏肝健脾方對慢性應(yīng)激糖尿病大鼠甲狀腺功能及組織形態(tài)的影響

雷永華1李紅2徐蓉娟2范崇信1

（1.鄭州市第一人民醫(yī)院，河南鄭州 450000；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032）

目的：觀察疏肝健脾方對糖尿病大鼠慢性應(yīng)激狀態(tài)下甲狀腺功能及組織形態(tài)的影響。方法：將75只SD大鼠隨機分為正常組15只和造模組60只，造模組60只大鼠誘發(fā)糖尿病后再次隨機分為模型組、中藥組、西藥組和中西藥結(jié)合組，除正常組以外其余各組大鼠在施以慢性不可預(yù)知溫和刺激以誘發(fā)應(yīng)激狀態(tài)（4周）同時分別給予蒸餾水、疏肝健脾方、左洛復(fù)混懸液、疏肝健脾方＋左洛復(fù)混懸液灌胃，正常組亦給予蒸餾水灌胃。治療12周后測定各組大鼠三碘甲狀腺原氨酸（T3）、四碘甲狀腺原氨酸（T4）、游離甲狀腺素T3（FT3）、游離甲狀腺素T4（FT4）、促甲狀腺激素（TSH）水平，并觀察甲狀腺組織改變。結(jié)果：與正常組比較，其余各組大鼠的T3、T4、FT3、FT4均明顯降低；中西藥結(jié)合組大鼠的T3、中藥組和中西藥結(jié)合組的T4均明顯高于模型組和西藥組。模型組大鼠甲狀腺組織有不同程度損傷，各用藥組損傷情況介于正常組與模型組之間。結(jié)論：疏肝健脾方能對抗鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠應(yīng)激狀態(tài)下并發(fā)的甲狀腺功能減退，可能對糖尿病大鼠應(yīng)激狀態(tài)及下丘腦-垂體-甲狀腺軸（HPT）有一定的調(diào)節(jié)作用。

糖尿病 甲狀腺 疏肝健脾 中藥復(fù)方 實驗研究

“疏肝健脾方”由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院徐蓉娟教授及其博士生李紅主任醫(yī)師經(jīng)多年臨床實踐研制而成，廣泛用于臨床。該方具疏肝解郁、健脾安神之功效，拓展了應(yīng)用疏肝健脾法治療糖尿病及其合并癥的臨床思路。前期研究表明，疏肝健脾方具有改善糖尿病大鼠甲狀腺功能減退的治療作用[1]，本實驗通過觀察疏肝健脾方對應(yīng)激狀態(tài)下糖尿病大鼠甲狀腺功能及病理改變的影響，進一步探討疏肝健脾方對應(yīng)激狀態(tài)下糖尿病大鼠合并甲狀腺功能減退的干預(yù)作用，并進而探索其相關(guān)機制。

1 實驗材料

1.1 動物SPF級SD雄性大鼠75只，體重（180±10）g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 造模用藥福氏佐劑、鏈脲佐菌素（STZ）均為美國sigma公司產(chǎn)品。

1.3 治療用藥疏肝健脾方，藥物組成：柴胡12g、黃芪30g、茯苓15g、淮小麥30g、石菖蒲15g、丹參15g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院制劑室按既定工藝完成并提供。左洛復(fù)：由輝瑞制藥有限公司提供，50mg/片。

1.4 主要試劑盒及儀器三碘甲狀腺原氨酸（T3）、四碘甲狀腺原氨酸（T4）、游離甲狀腺素T3（FT3）、游離甲狀腺素T4（FT4）、促甲狀腺激素（TSH）放射免疫分析藥盒等，由北京普爾偉業(yè)生物有限公司解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所提供。GC-911r放射免疫計數(shù)器，由科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司生產(chǎn)。

2 實驗方法

2.1 糖尿病造模大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始造模。先腹腔注射0.5mL福氏佐劑，次日再按30mg/kg體重腹腔注射STZ溶液（用PH4.2 0.1mL/L無菌枸櫞酸鈉緩沖液配制）。每周1次，連續(xù)3周重復(fù)上述步驟。每次注射后均測定血糖和體重。血糖＞16mmol/L為糖尿病模型造模成功。

2.2 糖尿病應(yīng)激狀態(tài)模型誘發(fā)糖尿病造模成功的大鼠第3天開始給予慢性不可預(yù)知溫和應(yīng)激刺激，刺激方式包括制動3h、潮濕籠子17h、傾斜籠子17h、通宵照明、禁食24h、禁水16h加1h空瓶刺激、成組飼養(yǎng)17h，以上刺激安排于1周內(nèi)，每日1種，連續(xù)4周，同種刺激不連續(xù)出現(xiàn)。4周后觀察大鼠體重、攝食量變化，并行曠場行為測定觀察大鼠運動能力、探索行為、侵犯攻擊能力、清潔動作次數(shù)等情況的變化。

2.3 分組與用藥75只SD大鼠先用隨機數(shù)字表法選取15只作為正常組，剩余60只大鼠誘發(fā)糖尿病，造模成功44只，再次隨機分為模型組、中藥組、西藥組、中西藥結(jié)合組，每組11只。除正常組外其余各組大鼠均施以慢性不可預(yù)知溫和刺激，同時中藥組、西藥組、中西藥結(jié)合組分別給予疏肝健脾方、左洛復(fù)混懸液、疏肝健脾方＋左洛復(fù)混懸液灌胃，正常組與模型組給予蒸餾水灌胃。疏肝健脾方參照標準動物的等效劑量折算系數(shù)法[2]，每只大鼠給予0.1053g/（kg·d）的生藥量，相當于成人每日中藥用量。左洛復(fù)片混懸于CMC溶液中，相當于成人50mg/d用量。各組大鼠均按體重灌胃，每日1次，連續(xù)給藥12周。整個實驗過程中，大鼠有一定的死亡率，且因試劑有限，最終隨機選取了部分大鼠進行本研究相關(guān)指標的測定。

2.4 甲狀腺激素指標測定實驗結(jié)束后所有大鼠施行麻醉后腹主動脈采血，放入不添加任何抗凝劑的試管中，4℃3000r/min離心15min，分離1mL血清放置-20℃冰箱保存，用于測定T3、T4、FT3、FT4和TSH。測定嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.5 甲狀腺組織標本測定所有大鼠腹主動脈取血后處死，迅速取出大鼠甲狀腺，肉眼觀察大體情況，在冰板上去除其周圍其他組織，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈血液，濾紙拭干，置福爾馬林中性固定液（15%）浸泡固定，常規(guī)病理組織切片，梯度酒精常規(guī)脫水、蠟塊包埋后HE（蘇木素-伊紅）染色，光鏡觀察組織大體形態(tài)，上皮細胞及濾泡病理變化。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料符合正態(tài)分布的采用t檢驗和單因素方差分析，不符合正態(tài)分布的采用秩和檢驗。采用95%CI對統(tǒng)計量的參數(shù)進行估計，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 藥物對糖尿病應(yīng)激大鼠甲狀腺功能的影響見表1。

表1 各組大鼠藥物干預(yù)后T3、T4、FT3、FT4、TSH含量比較[±s（平均秩次）]

表1 各組大鼠藥物干預(yù)后T3、T4、FT3、FT4、TSH含量比較[±s（平均秩次）]

注：與正常組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與西藥組比較，△P＜0.05。

組別動物數(shù)（只）T3（ng/mL）正常組T4（ng/mL）61.51±0.11（30.50）FT3（ng/dL）FT4（ng/dL）66.74±28.17（28.67）TSH（uIU/mL）3.70±0.75（30.50）9.06±1.43（30.50）10.87±1.45（20.50）模型組7.95±8.03（7.33）**60.33±0.29（6.50）**中藥組60.63±0.90（13.33）**1.05±0.55（17.25）**1.63±0.60（10.50）**17.54±13.67（26.00）**8.65±5.05（14.33）中西藥結(jié)合組90.83±0.12（21.06）**##8.17±0.81（8.67）**##西藥組60.48±0.29（11.58）**25.45±2.99（22.50）**#△1.01±0.42（15.67）**2.53±0.90（17.00）**5.78±4.32（6.33）**0.69±0.49（9.83）**2.05±1.29（12.33）**23.45±8.55（19.11）**#△0.92±0.41（13.50）**2.49±1.37（15.44）**10.08±2.75（17.50）

3.2 藥物對糖尿病應(yīng)激大鼠甲狀腺組織結(jié)構(gòu)的影響光鏡下觀察各組大鼠甲狀腺組織，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠甲狀腺濾泡上皮細胞厚度較正常組大鼠明顯變薄，濾泡內(nèi)膠體面積增大。各用藥大鼠甲狀腺組織結(jié)構(gòu)改變情況介于正常組與模型組之間，以中西藥結(jié)合組大鼠甲狀腺組織結(jié)構(gòu)最接近正常組，其次為中藥組。西藥組與正常組大鼠甲狀腺組織結(jié)構(gòu)差異較大，比較接近模型組大鼠甲狀腺組織結(jié)構(gòu)特點。見圖1。

4 討論

糖尿?。―M）患者常出現(xiàn)HPT軸功能異常，國外流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)DM人群中甲狀腺功能異常的發(fā)生率明顯增高，是非DM患者的2～3倍[3]。2型DM患者合并亞臨床甲減會增加DM并發(fā)腎病及心血管病變的危險性[4]。Mohn A等[5]發(fā)現(xiàn)亞臨床甲減會增加青少年Ⅰ型DM患者臨床癥狀性低血糖的危險性，甚至嚴重者會誘發(fā)DM酮癥酸中毒。

糖尿病屬中醫(yī)“消渴病”范疇，歷代醫(yī)家早有從肝論治消渴之說，清代醫(yī)家黃坤載明確提出：“消渴者，足厥陰之病也”，開創(chuàng)了“從肝論治糖尿病”的先河。甲減與消渴中醫(yī)證型關(guān)系密切，結(jié)合甲減的臨床征象，DM所致甲減與肝脾關(guān)系密切，肝郁日久，肝木亢盛，肝旺犯脾，進而致脾失健運，痰濕內(nèi)生，出現(xiàn)一系列低代謝癥候群，治療應(yīng)以疏肝健脾為主。根據(jù)經(jīng)絡(luò)理論，肝經(jīng)“循喉嚨之后”，甲狀腺位于足厥陰肝經(jīng)循行路線上。從神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)來看，肝失疏泄常表現(xiàn)為抑郁或煩躁等精神狀態(tài)的改變，而在這種情緒刺激的應(yīng)激過程中，甲狀腺激素起著重要調(diào)節(jié)作用。臨床觀察，肝失疏泄之抑郁與甲狀腺功能減低的臨床表現(xiàn)相似。近年來從疏肝健脾論治糖尿病合并甲減逐漸引起中醫(yī)界的關(guān)注，但是從肝脾論治糖尿病合并甲減的相關(guān)實驗為數(shù)甚少。本實驗所用疏肝健脾方中柴胡舒肝解郁，黃芪補氣升陽、益衛(wèi)固表、斂瘡生肌、利水消腫，二者共為君藥?；葱←滒B(yǎng)心除煩、益腎、除熱、止渴，治臟躁、煩熱、消渴；石菖蒲辛、溫，歸心、胃經(jīng)，開竅、豁痰、理氣、活血、散風(fēng)、去濕，二者共為臣藥。丹參活血寧心，茯苓滲濕利水、益脾和胃、寧心安神，共為佐藥。全方配伍，共奏疏肝解郁、寧心安神之效，諸藥相得益彰。

圖1 各組大鼠甲狀腺組織病理改變（HE染色，×400）

近年研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)激刺激會影響機體甲狀腺激素水平，總體而言，傷害性應(yīng)激短期使甲狀腺激素水平升高，而長期使之下降。甲狀腺激素水平下降的機制可能與神經(jīng)內(nèi)分泌軸如HPA軸的興奮有關(guān)。有研究顯示其機制為腦中藍斑核對應(yīng)激做出最初反應(yīng)后作用于下丘腦室旁核（PVN），刺激其促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRH），CRH使腺垂體分泌ACTH，從而作用于腎上腺皮質(zhì)，釋放糖皮質(zhì)激素（GC）。GC可抑制TRH和TSH的分泌，阻礙T4向T3轉(zhuǎn)化，這與長期應(yīng)激常導(dǎo)致的甲狀腺激素，尤其是T3的降低密切相關(guān)[6]。高氏等[7]觀察到，應(yīng)激組大鼠血清中TT3、TT4、FT3、FT4和TSH的含量均顯著低于對照組，說明慢性社會應(yīng)激（CSS）抑制了HPT軸活動。TH水平對下丘腦、垂體存在反饋調(diào)節(jié)，形成HPT軸調(diào)節(jié)通路，CSS有可能影響這一負反饋調(diào)節(jié)機制。

本實驗結(jié)果顯示，糖尿病大鼠應(yīng)激狀態(tài)下存在甲狀腺功能減退，中藥及中西藥合用可升高糖尿病應(yīng)激大鼠T3、T4水平，降低TSH水平，在一定程度上改善甲狀腺功能減退，提示疏肝健脾方對于糖尿病大鼠應(yīng)激狀態(tài)下甲狀腺激素水平起到一定的調(diào)節(jié)作用。從TSH水平看，可能有負反饋機制參與其中，但因?qū)嶒灅颖玖科?，尚需進一步驗證。

綜上，糖尿病大鼠在慢性不可預(yù)知溫和刺激下出現(xiàn)甲狀腺功能減退，其原因可能因高血糖狀態(tài)合并應(yīng)激狀態(tài)下HPA軸被激活，體內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌激素分泌失調(diào)，HPT軸也受影響，激素之間相互拮抗，CRH抑制TSH，進而引起甲狀腺功能低下。因本實驗缺少對HPT軸上游調(diào)節(jié)指標，如CRH、TRH等的檢測，故糖尿病出現(xiàn)甲減的發(fā)病機制，尚需進一步實驗闡明。本實驗表明，疏肝健脾方能在一定程度上調(diào)節(jié)應(yīng)激狀態(tài)下糖尿病大鼠甲狀腺激素水平，對改善糖尿病大鼠機體內(nèi)環(huán)境起到一定作用，至于慢性不可預(yù)知溫和刺激是否加重糖尿病大鼠甲狀腺功能減退，尚需進一步實驗分析驗證。

[1]雷永華，李紅，徐蓉娟.疏肝健脾方對糖尿病大鼠甲狀腺功能減退的影響.實用醫(yī)學(xué)雜志，2012，28（24）：4053

[2]陳奇.中藥藥理研究方法學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，2000，33，1103

[3]VondraK，Vrbikova J，Dvorakova K.Thyroid gland disease in adult patients with diabetes mellitus.Minerva Endocrinol，2005，30：2177

[4]Chen H，Wu T，Jap T，et al.Complications Subclinical hypo - thyroidism is a risk factor for nephropathy and cardiovascular diseases in Type 2 diabetic patients. Diabetic Medicine，2007，24：1336

[5]Mohn A，Michele S，Luzio R.The effect of subclinical hypo - thyroidism on metabolic control in children and adolescents with Type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine，2002：70

[6]李舍予，李佳，岳利民.應(yīng)激對血漿甲狀腺激素水平的影響.四川生理醫(yī)學(xué)雜志，2007，29（4）：176

[7]高雪，劉燕，朱廣瑾，等.慢性社會應(yīng)激對大鼠神經(jīng)內(nèi)分泌及行為的影響.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2003，23（3）：347

R587.105

A

1672-397X（2014）10-0072-03

雷永華（1981-），女，醫(yī)學(xué)博士，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合治療內(nèi)分泌代謝疾病。

徐蓉娟，xrj1118@yahoo.com.cn

2014-05-22

編輯：吳寧

國家自然科學(xué)基金項目（30772800）