馬鵬 劉淵

（成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都 610075）

炙甘草湯、右歸飲刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌TPO與EPO的比較研究

馬鵬 劉淵

（成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都 610075）

目的：比較研究炙甘草湯、右歸飲對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌TPO與EPO的影響。方法：臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞設(shè)空白對(duì)照組、炙甘草湯組、右歸飲組及混合組，每組分別加入相應(yīng)的中藥液，于培養(yǎng)第3、6、9天收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中TPO與EPO的分泌水平。結(jié)果：（1）TPO分泌方面，第6天，與空白對(duì)照組比較，炙甘草湯明顯刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生TPO；第9天，炙甘草湯單獨(dú)作用以及兩種中藥聯(lián)合使用時(shí)TPO的產(chǎn)生與空白對(duì)照組相比也有明顯差異。（2）EPO分泌方面，第6天與第9天，右歸飲作用時(shí)能夠刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生EPO，但炙甘草湯單獨(dú)作用以及兩種中藥聯(lián)合使用時(shí)卻不能明顯刺激細(xì)胞產(chǎn)生EPO。結(jié)論：在刺激細(xì)胞產(chǎn)生TPO方面，炙甘草湯的效果最明顯，而在刺激細(xì)胞產(chǎn)生EPO方面右歸飲表現(xiàn)出更好的效果，兩個(gè)方劑作用機(jī)制存在差異，且兩個(gè)方劑的刺激作用均存在持續(xù)性。

炙甘草湯 右歸飲 臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 TPO EPO 體外實(shí)驗(yàn)

炙甘草湯作為治療“脈結(jié)代，心動(dòng)悸”的主方，已沿用近兩千年，療效顯著，為廣大醫(yī)家所稱贊。本方為滋陰補(bǔ)血、通陽復(fù)脈之劑，是治療氣血陰陽虛損之常用方劑，臨床廣泛運(yùn)用于冠心病、心律失常等心血管疾病，并在血液系統(tǒng)、腫瘤等方面有大量研究[1-2]。中醫(yī)認(rèn)為“心主血脈”，心通過“化赤”等作用參與血的生成，清代名醫(yī)唐宗海把炙甘草湯作為心參與生血的代表方，臨床上也不乏通過中藥改善骨髓微循環(huán)加強(qiáng)血生成的報(bào)道[3]。右歸飲為張景岳所制，屬于陰陽互濟(jì)法的代表方劑，為“陰中之陽藥”。右歸飲在臨床有廣泛應(yīng)用，如血證、火證、痰病等病證[4]。兩個(gè)方劑均屬陰陽互濟(jì)之方，但兩方又有所側(cè)重，雖均能參與生血，但其生血機(jī)制有無差異一直是研究者關(guān)心的問題。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為對(duì)象，選取造血因子TPO與EPO，在體外環(huán)境下比較兩方對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926購于中科院上海細(xì)胞庫。

1.2 主要藥物炙甘草湯由炙甘草、桂枝、人參、生地黃、麥門冬、麻仁、大棗、生姜、阿膠組成，方中各成分比例為12:9:6: 50∶10∶10∶10∶10∶5；右歸飲由熟地、山藥、山茱萸、枸杞、甘草、杜仲、肉桂、制附子組成，方中各成分比例為20∶10∶10∶10∶5∶10∶4∶5。

所有中藥均購自北京同仁堂。中藥煎煮后進(jìn)行過濾除渣、高溫滅菌，每毫升藥液含生藥0.2g。

1.3 試劑DMEM培養(yǎng)基（GIBCO），F(xiàn)BS（GIBCO），谷氨酰胺（GIBCO），六孔培養(yǎng)板（Corning），0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO），TPO ELISA試劑盒（CUSABIO），EPO ELISA試劑盒（CUSABIO）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組細(xì)胞分為空白對(duì)照組（只加基本培養(yǎng)基，不加中藥液）、右歸飲組、炙甘草湯組及混合組（添加炙甘草湯與右歸飲），每組樣本數(shù)為10。培養(yǎng)第3、6、9天收取細(xì)胞培養(yǎng)上清，1000g離心15min，分裝后-20℃保存。

2.2 TPO檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前將各試劑放至室溫平衡30min，計(jì)算樣品孔及標(biāo)準(zhǔn)品孔數(shù)，100μL/孔在相應(yīng)孔中加入待測(cè)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品，搖勻，封膜后于37℃孵育2h，吸棄孔內(nèi)液體，每孔加入生物素標(biāo)記抗體工作液100μL，37℃孵育1h，棄去孔內(nèi)液體，洗板3次，每孔加入辣根過氧化物酶親和素標(biāo)記工作液100μL，37℃孵育1h，洗板，加入顯色液，顯色終止后酶標(biāo)儀讀取450nm處OD值。

2.3 EPO檢測(cè)實(shí)驗(yàn)前將各試劑放至室溫平衡30min，計(jì)算樣品孔及標(biāo)準(zhǔn)品孔數(shù)，在相應(yīng)孔中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品50μL、檢測(cè)樣本50μL，每孔加入酶結(jié)合物50μL，封板，37℃溫育1h，棄去孔內(nèi)液體，去離子水洗板3次，每孔加入顯色劑A液50μL、顯色劑B液50μL，振蕩混勻，37℃避光顯色15min，每孔加入終止液50μL，酶標(biāo)儀讀取各孔450nm OD值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 炙甘草湯、右歸飲刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌TPO實(shí)驗(yàn)初期（第3天），所有實(shí)驗(yàn)組上清中均未檢測(cè)到TPO的分泌；從第6天開始在所有實(shí)驗(yàn)組中開始檢測(cè)到TPO的分泌，并且隨著時(shí)間的增加TPO分泌量增加，第9天培養(yǎng)上清中TPO檢測(cè)值為最高。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在第6天，炙甘草湯組與空白對(duì)照組相比，TPO上升明顯，右歸飲組以及混合組與空白對(duì)照組相比無明顯差異；第9天，炙甘草湯組與空白對(duì)照組相比TPO含量差異明顯，同時(shí)混合組與空白對(duì)照組相比TPO表達(dá)也有明顯差異，但右歸飲組與空白對(duì)照組相比卻表現(xiàn)出降低趨勢(shì)。見表1。

表1 中藥對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TPO表達(dá)水平的影響（±s）pg/mL

表1 中藥對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TPO表達(dá)水平的影響（±s）pg/mL

注：“-”表示未檢測(cè)到。與空白對(duì)照組相比，**P＜0.005，***P＜0.0005。

組別樣本數(shù)第3天第6天第9天空白對(duì)照組10-28.7±1.597.9±0.8混合組10-34.5±2.1118.0±3.4**▲右歸飲組10-25.8±1.579.9±2.2**炙甘草湯組10-68.5±1.9***129.3±2.3***

3.2 炙甘草湯、右歸飲刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌EPO實(shí)驗(yàn)開始后第3天，所有實(shí)驗(yàn)組均未檢測(cè)到EPO的分泌；第6天開始在右歸飲組檢測(cè)到EPO的分泌，但在空白對(duì)照組及另外兩個(gè)加藥組均未檢測(cè)到EPO分泌；第9天與第6天結(jié)果類似，僅在右歸飲組檢測(cè)到EPO分泌。見表2。

表2 中藥對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EPO表達(dá)水平的影響±s）mIU/mL

表2 中藥對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞EPO表達(dá)水平的影響±s）mIU/mL

注：“-”表示未檢測(cè)到。

組別樣本數(shù)第3天第6天第9天空白對(duì)照組10---混合組10---右歸飲組10-1.476±0.0505.730±0.228炙甘草湯組10---

4 討論

促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）是由332個(gè)氨基酸組成的多肽糖蛋白，是一種造血生長因子，目前認(rèn)為它在體內(nèi)的主要生理作用是刺激造血干細(xì)胞向巨核系祖細(xì)胞分化，并特異性地促進(jìn)巨核系祖細(xì)胞增殖、分化，以及巨核細(xì)胞的成熟與釋放血小板。研究顯示，TPO單獨(dú)或與早期作用的造血生長因子協(xié)同可有效維持原始造血細(xì)胞的存活并保留其再植活性，同時(shí)促進(jìn)早期祖細(xì)胞的擴(kuò)增[5-6]。DeBruyn等[7]研究也發(fā)現(xiàn)TPO單獨(dú)使用可誘導(dǎo)CD34+細(xì)胞向CD41+細(xì)胞分化。這些研究均表明TPO在造血系統(tǒng)發(fā)育分化中具有重要作用。

促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin，EPO）是一種唾液酸糖蛋白，其分子含196個(gè)氨基酸殘基，成熟的EPO分子含166個(gè)氨基酸殘基。紅細(xì)胞的發(fā)育要經(jīng)過干細(xì)胞、祖細(xì)胞、前體細(xì)胞、網(wǎng)織細(xì)胞等過程，其間必須要有相應(yīng)的細(xì)胞因子作用細(xì)胞才能增殖、分化。促紅細(xì)胞生成素是紅細(xì)胞最重要的必不可少的細(xì)胞因子。它不僅可以刺激骨髓紅系祖細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)化、成熟，使骨髓中網(wǎng)織紅細(xì)胞生成并釋放入血，而且可刺激血紅蛋白的合成最終導(dǎo)致外周血紅細(xì)胞數(shù)量的增加。EPO作為一種集落刺激因子已被人們廣泛接受和認(rèn)識(shí)，自1985年EPO的cDNA被成功克隆后已成功應(yīng)用于臨床治療血液系統(tǒng)疾病，可促進(jìn)紅系祖細(xì)胞增生、分化和成熟。近年來發(fā)現(xiàn)EPO蛋白在胚胎、新生兒和成人腦脊液中均能檢測(cè)到，并隨年齡的增加而降低[8]。

本實(shí)驗(yàn)通過炙甘草湯與右歸飲體外刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的方法，探討其造血因子的分泌情況，分析兩種中藥在造血相關(guān)發(fā)育分化中的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種中藥在體外刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生不同效應(yīng)，炙甘草湯能夠明顯刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生TPO，右歸飲對(duì)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞刺激產(chǎn)生TPO的效果卻不明顯，相反TPO的分泌反而下降，表現(xiàn)出一定的抑制效應(yīng)。在混合組中當(dāng)兩種中藥同時(shí)作用時(shí)，炙甘草湯的刺激作用與右歸飲的抑制作用同時(shí)存在，炙甘草湯的刺激作用明顯強(qiáng)于右歸飲的抑制作用，最終刺激形成明顯高于對(duì)照組的TPO分泌。由此可見，炙甘草湯能夠明顯刺激臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌TPO。在刺激細(xì)胞產(chǎn)生EPO方面表現(xiàn)出相反的情況，炙甘草湯單獨(dú)作用以及兩種中藥聯(lián)合作用時(shí)效果均與空白對(duì)照相同，不能刺激細(xì)胞產(chǎn)生EPO，但右歸飲單獨(dú)作用時(shí)卻能刺激細(xì)胞產(chǎn)生EPO。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)中藥方劑因所含成分不同，作用機(jī)制存在差異，刺激產(chǎn)生細(xì)胞因子的效果表現(xiàn)不同，另外兩個(gè)方劑的治療作用均表現(xiàn)出一定的持續(xù)性，隨著時(shí)間增加刺激細(xì)胞因子的分泌也增多。

[1]李曉璇，郭偉星.炙甘草湯治療心血管疾病研究進(jìn)展.山東中醫(yī)雜志，2013，32（2）：141

[2]鄧中甲.方劑學(xué).北京：中國中醫(yī)藥出版社，2003：31

[3]白藍(lán)酈，劉莉，劉淵.炙甘草湯對(duì)心血管系統(tǒng)作用的研究進(jìn)展.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2013（1）：126

[4]李克松.右歸飲抑制腦缺血糖皮質(zhì)激素?fù)p傷海馬神經(jīng)元的研究.廣東：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2008

[5]Kuter DJ，Beg1ey CG.Recombinant human thrombopoietin：basic bio1ogy and eva1uation of c1inica1 studies.B1ood，2002，100（10）：3457

[6]Luens KM，Travis MA，Chen BP，et a1.Thrombopoietin，kit 1igand，andf1k2/f1t3 1igand together induced increased numbers of primitive hematopoietic progenitors from human CD34+Thy-1+Lince11s with preserved abi1ity to engraft SCID-hu bone.B1ood，1998，91：1206

[7]DeBruyn C，De1f orge A，Martiat P，et a1.Ex vivo expansion of megakaryocyte progenitor ce11s：cord b1ood versus mobi1ized periphera1 b1ood.Stem Ce11s Dev，2005，14（4）：415

[8]Juu1 S E，Harcum J，Li Y，et a1.Erythropoietin is present in the cerebrospina1 f1uid of neonates.J Pediatr，1997，130：428

R285.5

A

1672-397X（2014）05-0073-02

馬鵬（1980-），男，碩士研究生，研究方向：歷代名醫(yī)治療難治性血液病的臨床思維及經(jīng)驗(yàn)研究。

劉淵，1iuy60s@sina.com

2014-01-28

編輯：吳寧

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81072728）