劉慧敏，杜守穎，陸 洋，李鵬躍，馮健男

（北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102）

大孔樹脂純化葛根的使用次數(shù)和再生方法*

劉慧敏，杜守穎，陸 洋，李鵬躍，馮健男

（北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100102）

[目的]研究HPD-200A型大孔樹脂在純化葛根素及葛根總黃酮時的使用壽命和再生方法。[方法]以葛根總黃酮和葛根素的吸附容量和精致后的純度為指標，考察大孔樹脂在多次吸附洗脫和再生后的吸附洗脫能力的變化。[結(jié)果]樹脂初次使用時，葛根素吸附容量約為17.29 g/L，總黃酮的吸附容量約為46.00 g/L，兩者的純度為32.40%和75.52%，連續(xù)使用11次后葛根素吸附容量為原來的82.26%，總黃酮的吸附容量為原來的80.99%，兩者純度為27.23%和67.99%，純度略有降低。用95%乙醇再生處理后，HPD-200A大孔樹脂對葛根素和總黃酮的吸附容量分別可達到新樹脂的94.35%和91.87%，兩者的純度也均可達到新樹脂的97%以上。[結(jié)論]使用HPD-200A型大孔樹脂精制葛根時，新樹脂可連續(xù)使用11次，用95%乙醇再生后，至少可連續(xù)使用3次，即一批HPD-200A型樹脂至少可使用14次,本研究為葛根純化工藝的產(chǎn)業(yè)化確定提供了實驗基礎(chǔ)和參考。

大孔樹脂；葛根；總黃酮；再生

大孔樹脂是一種不溶于酸堿及各種有機溶劑，對氧、熱、化學試劑穩(wěn)定且機械強度高的有機高分子聚合物，還具有良好的吸附性能[1]，現(xiàn)已被廣泛應用于環(huán)境保護、化學工業(yè)、臨床鑒定、抗菌藥物及生化藥物的分離純化等領(lǐng)域[2]，尤其在中國的中藥現(xiàn)代化研究中，應用大孔樹脂分離富集中藥有效成分及中藥復方有效部位已越來越受到重視[3-5]。

葛根始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）Ohwi的干燥根,具有解肌退熱、透發(fā)麻疹等功效，臨床上主要用于外感發(fā)熱頭痛、高血壓、頸項強痛、口渴等癥[6]。目前，對葛根的分離純化研究越來越多，其中以大孔樹脂純化效果最佳[7]，因此大孔樹脂分離純化葛根素的研究越來越多[7-11]，且非極性樹脂對葛根素和總黃酮顯示較好的吸附性能[7]，但涉及樹脂使用壽命和再生的研究卻較少。HPD-200A型大孔樹脂是以苯乙烯為骨架的非極性樹脂[12]，實驗室前期已考察了HPD-200A大孔樹脂純化葛根的工藝，但每批樹脂的預處理花費時間很長，每批處理量小、耗時長而且耗費大量有機溶劑，污染環(huán)境，成本高?？紤]大生產(chǎn)應省時并節(jié)約成本，本實驗在已有的葛根純化工藝基礎(chǔ)上，進一步考察了HPD-200A型大孔樹脂的使用次數(shù)及再生方法，以期為該工藝的大生產(chǎn)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-20AT液相色譜儀，LC-20AT色譜泵,SPD-20A紫外檢測器，LC Solution色譜工作站（日本島津公司），SP-756（PC）型紫外可見分光光度計（Spectrum shanghai），15 mm×500 mm的玻璃柱，Sartorius BS 110S型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司），CX-100型超聲波清洗器（北京醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試藥 葛根飲片（北京華邈中藥工程技術(shù)開發(fā)中心，批號：204261），葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究所，批號：110752-00912，供含量測定用），HPD-200A型大孔樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司），冰醋酸（北京化工廠，批號20080708），甲醇為色譜級，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

2.1.1 總黃酮的測定 通過全波長掃描可知，葛根提取物和葛根素溶液均在250 nm波長有最大吸收，故在250 nm波長測吸光度，計算其總黃酮含量。

精密稱取葛根素對照品10.40 mg于10 mL容量瓶中，無水乙醇定容。精密量取該溶液2 mL于25 mL容量瓶中，無水乙醇定容。精密量取上述溶液0.1、0.2、0.25、0.5、1、1.5、2 mL于10 mL容量瓶中，無水乙醇定容。以無水乙醇為參比溶液，在250 nm處測定吸光度，以吸光度A與對照品溶液濃度C進行線性回歸，得回歸方程為A=0.804C+0.020 3，r2= 0.998 8，線形范圍為0.832～16.64 μg/mL。

精密度、12 h穩(wěn)定性、重復性、加樣回收率實驗RSD值分別為0.43%、0.53%、2.27%、1.99%，符合要求。

2.1.2 葛根素的測定

2.1.2.1 色譜條件 TIANHE Kormasil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相甲醇:1%醋酸溶液（22∶78），流速1.0 mL/min，檢測波長250 nm。

梯度洗脫程序：0～20 min，甲醇-1%醋酸溶液（22∶78）；20～25 min，甲醇-1%醋酸溶液（90∶10）；25～40 min，甲醇-1%醋酸溶液（22∶78）。

2.1.2.2 方法學考察 精密稱取葛根素對照品適量，用流動相溶解并稀釋為 5.32、10.63、21.26、63.78、85.04、106.30 μg/mL的對照品溶液，準確量取各溶液10 μL進樣。以樣品的峰面積（A）和對照品溶液質(zhì)量濃度（C），應用最小二乘法線性回歸處理后得方程為A=47 259C+2 524.2，r=0.999 9，在質(zhì)量濃度5.32～106.30 μg/mL，方程的線性良好，符合實驗要求。

葛根素乙醇溶液低、中、高濃度（21.26，53.15，85.04 μg/mL）精密度實驗的RSD分別為0.11%、0.18%、0.27%，符合要求。

2.2 藥液制備 對照品溶液的制備：精密稱取葛根素對照品10.40 mg于10 mL容量瓶中，無水乙醇定容。精密量取該溶液2 mL于25 mL容量瓶中，無水乙醇定容，得83.2 μg/mL的葛根素對照品溶液。

自制葛根粗提物:粗提物干燥成干膏，干膏中葛根素和總黃酮含量分別為12.08%和31.42%，取其干膏配成6.75%的水溶液，作為上樣液。

2.3 大孔樹脂吸附葛根素及總黃酮使用壽命的考察 HPD-200A型大孔樹脂用95%乙醇加熱回流，至回流液在250 nm處無紫外吸收，再用蒸餾水洗至無醇味。取3份已處理過的樹脂13 mL（干質(zhì)量約2.87 g），分別裝入3根內(nèi)徑1.5 cm的樹脂柱中，取自制葛根粗提液，上樣2 BV（1BV即1倍樹脂柱體積），水洗2 BV，30%乙醇洗4 BV。收集每次的上樣滴出液、水洗液和醇洗液，分別定容于50、50、100 mL的容量瓶中。最后用適量蒸餾水沖洗樹脂至滴出液無醇味，完成1次使用[13]。重復以上操作，計算出每次的吸附容量，共進行13次吸附。

收集的上樣滴出液定容后，按含量測定方法測定滴出液中葛根素和總黃酮含量，計算吸附容量。

公式：D=1 000（C1V1-C2V2）/V

D：吸附容量（g/L），C1：上樣液中葛根素或總黃酮濃度（μg/mL），V1：上樣液中葛根素或總黃酮體積（mL），C2：上樣滴出液中葛根素或總黃酮濃度（μg/mL），V2：上樣滴出液中葛根素或總黃酮體積（mL），V：樹脂體積（mL）。

以吸附次數(shù)為橫坐標，吸附容量為縱坐標，作圖，見圖1。

圖1 HPD-200A大孔樹脂使用次數(shù)增加，葛根素和總黃酮的吸附容量變化趨勢圖(±s,n=3)Fig.1 Adsorption capacity of HPD-200A macroporous resin varies with times to purify puerarin and total flavonoids(±s,n=3)

圖1表明：樹脂初次使用時，葛根素吸附容量約為17.29 g/L，總黃酮的吸附容量約為46.00 g/L，使用次數(shù)增加，樹脂吸附能力有所下降，連續(xù)使用13次后葛根素吸附容量為原來的80.10%，總黃酮的吸附容量為原來的79.76%。

HPD-200A型大孔樹脂由偶極矩很小的單體聚合制得的，不帶任何功能基[14]，其作用源于樹脂表面的不均勻性和孔填充機制[15]。樹脂使用時，吸附質(zhì)優(yōu)先占據(jù)能量有利的位置。使用次數(shù)增加，樹脂表面及內(nèi)部都會殘留許多非吸附性成分或雜質(zhì)，導致樹脂表面被覆蓋或孔道被部分填充，待測物再次填充難度增大，吸附量下降，考察樹脂柱連續(xù)使用次數(shù)時，當樹脂柱吸附容量下降30%以上，則認為該樹脂需要再生或停止使用[16-17]，因此HPD-200A樹脂用于吸附葛根提取液至少可以使用13次。

收集每次的醇洗滴出液定容于100 mL容量瓶，再取0.25 mL定容于25 mL容量瓶進行含量測定，計算解吸率。以吸附次數(shù)為橫坐標，解吸率為縱坐標，作圖，見圖2。同時取出10 mL放入已知質(zhì)量的蒸發(fā)皿中水浴揮干，計算干膏質(zhì)量及葛根素與總黃酮的純度，結(jié)果見圖3。

圖2 HPD-200A大孔樹脂使用次數(shù)增加，葛根素和總黃酮的解吸率變化趨勢圖(±s,n=3)Fig.2 Desorption capacity of HPD-200A macroporous resin varies with times to purify puerarin and total flavonoids(±s,n=3)

圖3 HPD-200A大孔樹脂使用次數(shù)增加，葛根素和總黃酮的純度變化趨勢圖(±s,n=3)Fig.3 The purity of puerarin and total flavonoids varies with the used frequency of HPD-200A macroporous resin (±s,n=3)

圖2和圖3表明：使用次數(shù)增加，葛根素和總黃酮的解吸率都呈緩慢下降而后增加的趨勢；而兩者的純度先逐漸降低，使用11次后有明顯下降趨勢。

隨著使用次數(shù)的增加，樹脂中殘留的雜質(zhì)增加，雜質(zhì)的表面基團和靜電可能吸附待分離物，導致溶劑對其洗脫能力下降，解吸率減小，純度也相應減小。當雜質(zhì)積累至一定程度，部分被沖洗出，同時被洗出的待測物也增加，解吸率升高，純度反而降低。

2.4 大孔樹脂再生方法考察 用HPD-200A型大孔樹脂純化葛根，當樹脂使用13次后，吸附容量下降了20%左右，葛根素和總黃酮純度僅為初次使用時的66.01%和69.10%。說明樹脂經(jīng)多次吸附和洗脫后，有一些強吸附性雜質(zhì)成分保留于樹脂床中，降低了樹脂對欲分離成分的吸附能力。因此，必須對樹脂進行再生處理，除去強吸附成分。

再生情況可視具體情況而定，通常用95%的乙醇洗脫至無色，樹脂柱即已再生，然后以大量水洗脫至滴出液無醇味，即可再用。但若樹脂受污染嚴重，顏色變深，吸附能力降低，應酸堿強化再生處理[16]。

95%乙醇洗脫再生工藝考察：對已使用過13次的大孔樹脂，先用95%醇浸泡1.5 h，再用95%的乙醇洗脫至滴出液無色，最后用大量水洗脫至無醇味，再重新上樣，考察95%乙醇再生后大孔樹脂柱的吸附容量、解吸率和對葛根素、總黃酮精制效果，實驗結(jié)果見表1。

結(jié)果表明：用95%乙醇再生后，樹脂對葛根素和總黃酮的吸附容量分別可達到新樹脂的94.35%和91.87%，純度也均可達到新樹脂的97%以上。且再生后再連續(xù)使用3次，對兩種指標的吸附容量仍在新樹脂的91.70%以上，純度也都在新樹脂的88.90%以上。

3 討論

大孔吸附樹脂能解決其他常用吸附劑難以解決的問題[18]。但使用前對其預處理相對較難，消耗有機溶劑量大，耗時較長，因此考察其使用次數(shù)和再生工藝顯得尤為重要。

表1 95%乙醇洗脫再生工藝考察(±s,n=3)Tab.1 Regeneration technology of macroporous resins when treated with 95%ethanol(±s,n=3)

表1 95%乙醇洗脫再生工藝考察(±s,n=3)Tab.1 Regeneration technology of macroporous resins when treated with 95%ethanol(±s,n=3)

實驗項目 葛根素比吸率（g/L） 總黃酮比吸率（g/L） 葛根素解吸率（%）總黃酮解吸率（%）葛根素純度（%）總黃酮純度（%）樹脂初次使用 17.29±0.060 46.00±0.21 97.09±0.29 84.81±1.20 32.40±0.08 75.52±0.72連續(xù)使用13次 13.85±0.008 36.69±0.03 93.99±1.21 92.00±0.17 21.15±0.12 52.18±0.19再生后初次使用 16.31±0.0005 42.26±0.02 90.69±1.77 83.20±1.41 31.13±0.35 74.00±0.63再生后第2次使用 16.31±0.0004 42.18±0.03 93.91±0.98 88.20±0.36 29.09±0.27 70.61±0.33再生后第3次使用 16.31±0.0002 42.19±0.03 92.39±1.89 88.08±0.72 28.49±0.76 70.27±1.20

本實驗通過考察HPD-200A型大孔樹脂精制葛根時的使用次數(shù)和再生工藝，表明新樹脂可連續(xù)使用11次，但為控制精制物的純度，可根據(jù)實際需要酌情考慮樹脂使用次數(shù)并及時再生處理。大多數(shù)樹脂的再生需要進行酸堿處理[19-21]，此方法需要大量的溶劑，且酸堿的使用存在一定的危險性。本研究采用乙醇常溫常壓浸泡洗脫法，此法操作簡便，再生后樹脂的吸附能力和精制效果都基本恢復至新樹脂水平，且再生后連續(xù)使用3次，樹脂的吸附容量和精致效果均無明顯變化。因此，HPD-200A型大孔樹脂用于精制葛根，新樹脂可連續(xù)使用11次，再生后至少可連續(xù)使用3次，即一批樹脂至少可使用14次，既環(huán)保又能充分節(jié)約成本，本研究可為葛根純化的工業(yè)化生產(chǎn)提供實驗基礎(chǔ)和參考。

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Life and intensified regeneration technology of macroporous resins in extracting and purifying puerarin and total flavonoids from pueraria lobata

LIU Hui-min,DU Shou-ying,LU Yang,LI Peng-yue,FENG Jian-nan
（School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Traditional Chinese Medicine,Beijing 100102,China）

[Objective]To study the life and intensified regeneration technology of HPD-200A macroporous resins in purifying puerarin and puerarin flavonoids.[Methods]With the adsorption capacity and purity of puerarin and total flavonoids as indexes,the absorption capacity of HPD-200A macroporous resins which were multiple absorbed and intensified regenerated was studied.[Results]First,the adsorption capacity of puerarin and total flavonoids was about 17.29 g/L and 46.00 g/L,respectively.Their adsorption capacity became 82.26%and 80.99%of the original and the purity was 27.23%and 67.99%after HPD-200A macroporous resin was used continuously for 11 times.With 95%glycol regeneration,the adsorption capacity of HPD-200A macroporous resins for puerarin and total flavonoids could reach above 94.35%and 91.87%,the purity was more than 97%of the new resin.[Conclusion]With HPD-200A macroporous resin refining puerarin,new resin can be used for 11 times continuously.When regenerated with 95%ethanol,it can be used at least three times again,that is,the HPD-200A resin can be used at least for 14 times.

macroporous resin;puerarin;total flavonoids;regeneration

R285.5

：A

：1672-1519（2014）03-0177-04

2013-10-21）

（本文編輯：高 杉，馬曉輝）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.03.16

國家自然科學基金面上項目（81073057）；北京中醫(yī)藥大學復方中藥制劑研究創(chuàng)新團隊發(fā)展計劃資助（2011-CXTD-13）。

劉慧敏（1987－），女，在讀碩士，主要從事中藥新制劑與新技術(shù)研究。

杜守穎，E-mail：dushouying@263.net；陸 洋，E-mail：373940890@qq.com。