黃 洋，靳 輝，曹 霞，李鵬飛，姜曉龍，陳建偉，姚曉磊，趙妙妙，呂麗華

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷030801)

睪丸間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cell) 分布于睪丸曲精細(xì)管之間的間隙內(nèi)，是一類含量很少的細(xì)胞，約占睪丸內(nèi)總細(xì)胞數(shù)的2% ～4%［1］。睪丸間質(zhì)細(xì)胞最重要的功能是分泌睪酮，其睪酮分泌受下丘腦-垂體-睪丸性腺軸的調(diào)節(jié)，睪丸間質(zhì)細(xì)胞分泌的睪酮占動(dòng)物體內(nèi)總量的95%左右［2］。因?yàn)椴G酮與靶器官受體結(jié)合后會(huì)發(fā)揮重要生理功能［3］，所以睪丸間質(zhì)細(xì)胞作為分泌睪酮最主要的細(xì)胞，其分離培養(yǎng)受到人們的重視。

根據(jù)國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離主要用酶消化法。此法先用胰酶與膠原酶消化睪丸組織后，再用Percoll 進(jìn)行連續(xù)密度梯度離心或用尼龍網(wǎng)過濾分離［4～8］。但是此方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，整個(gè)操作流程費(fèi)時(shí)近2 h，造成間質(zhì)細(xì)胞死亡率上升。因此，本文將探討一種更為省時(shí)的方法來分離綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及睪丸樣品

睪丸樣品取自于當(dāng)?shù)赝涝讏鐾涝椎某赡晷坌跃d羊。

1.2 主要試劑

脫氫表雄酮(DHEA) 、尼克酰胺、DMSO、臺盼藍(lán)等購于Sigma 公司; 硝基藍(lán)四氮唑(NBT) 購于Amresco 公司; 煙堿腺苷二核苷酸(NAD) 購于Roche 公司; DMEM、FBS、雙抗購于Gibco 公司。

1.3 綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離

將采集到的綿羊睪丸放入4 ℃PBS 緩沖液內(nèi)，2 h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。先用無菌PBS 將睪丸表面沖洗干凈，然后將睪丸放入75%酒精內(nèi)30 s 進(jìn)行消毒。將睪丸被膜用剪刀剪開，用鑷子將睪丸被膜撕去。用手術(shù)刀將睪丸切成2 cm3左右的小塊，將睪丸小塊放入預(yù)先裝有無菌PBS 的50 mL 離心管內(nèi)，放在搖床上震蕩20 min，使得睪丸內(nèi)曲精細(xì)管組織松散開，間質(zhì)細(xì)胞脫落。震蕩完成后，將離心管靜置5 min。此時(shí)容器內(nèi)物質(zhì)分層，上層為富含間質(zhì)細(xì)胞的懸液，下層為睪丸曲精細(xì)管組織。取出上清液，1000 r/min 離心5 min。離心后去除上清，用含1% 雙抗、10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。將重懸的細(xì)胞接種入培養(yǎng)瓶內(nèi)，32 ℃培養(yǎng)3 h。3 h后將未貼壁的細(xì)胞倒掉，剩余細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以供間質(zhì)細(xì)胞純度鑒定。

1.4 綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞的活率及純度鑒定

細(xì)胞活率鑒定采用臺盼藍(lán)染色法。將上一步分離的細(xì)胞懸液與0.4%臺盼藍(lán)溶液體積比1∶1 混合，常溫孵育約2 min 后，將細(xì)胞懸液涂抹于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上進(jìn)行鏡檢?；罴?xì)胞不著色，死細(xì)胞呈藍(lán)色。

間質(zhì)細(xì)胞純度鑒定采用3β-羥類固醇脫氫酶(3β-HSD) 染色法。染色液的配制方法為: 將DHEA 與NBT 共同溶于DMSO 中，兩者終濃度皆為10 mg/mL，記為A 液; 將NAD 溶于 PBS 緩沖液中，終濃度為10 mg/mL，記為B 液; 將尼克酰胺溶于PBS中，終濃度為1 mg/mL，記為C 液。使用時(shí)將10 μL A 液、100 μL B 液、100 μL C 液與790 μL PBS 緩沖液配制為1 mL 新鮮的染色液。

在96 孔板內(nèi)培養(yǎng)48 h 后的細(xì)胞，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL 的新鮮染色液，32 ℃繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后鏡檢。呈藍(lán)黑色的細(xì)胞為間質(zhì)細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 綿羊間質(zhì)細(xì)胞的活率

經(jīng)臺盼藍(lán)染色后鏡檢觀察，約40 %的細(xì)胞死亡，顯示為藍(lán)色。細(xì)胞活率約為60%。如圖1 所示。

2.2 綿羊間質(zhì)細(xì)胞的純度

圖1 臺盼藍(lán)染色鑒定細(xì)胞活率100 ×

經(jīng)3β- HSD 染色劑對細(xì)胞染色后，視野下幾乎所有細(xì)胞都呈藍(lán)黑色，純度高達(dá)90%以上。如圖2 所示。

圖2 間質(zhì)細(xì)胞純度鑒定(100 ×)

3 討論

綿羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞的分離純化在雄性綿羊生殖研究中非常重要，一種簡便快捷且純度高的分離方法將大大提高科研人員的工作效率。傳統(tǒng)上分離間質(zhì)細(xì)胞較為復(fù)雜，需要酶消化和密度梯度離心。酶消化與密度梯度離心都是較為耗時(shí)的工作，使得間質(zhì)細(xì)胞的死亡率大幅上升。但是我們覺得間質(zhì)細(xì)胞在睪丸中較為松散，不需要酶消化。

另外，間質(zhì)細(xì)胞主要存在于曲精細(xì)管之間的間隙內(nèi)，在保證曲精細(xì)管大致完整的情況下，曲精細(xì)管內(nèi)的細(xì)胞是不會(huì)與間質(zhì)細(xì)胞混合的。因此本試驗(yàn)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)省去了酶消化與密度梯度離心的步驟。結(jié)果正如我們所預(yù)料的那樣，睪丸間質(zhì)細(xì)胞的純度很高，能達(dá)到90%以上。但是本試驗(yàn)分離的細(xì)胞活率只有60%左右，這應(yīng)該是由于采樣地點(diǎn)離實(shí)驗(yàn)室太遠(yuǎn)所致。從采集睪丸到運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室花費(fèi)了近2 h。如果能把運(yùn)輸時(shí)間降下來，也許活率會(huì)大幅提升。這一點(diǎn)在將來還需要繼續(xù)研究。

［1］劉建中，郭海彬，鄧春華，等.大鼠睪丸Leydig 細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定［J］.中華男科學(xué)雜志，2006，12(1) : 14-18.

［2］Syed G H.Cell Biology of Leydig Cells in the Testis ［J］.International Review of Cytology，2004，4: 181-241.

［3］Yang J Y，Zhang Y F，Wang Y Q，et al.Toxic effects of zearalenone and alpha-zearalenol on the regulation of steroidogenesis and testosterone production in mouse leydig cells ［J］.Toxicol Vitro，2007，21(4): 558-565.

［4］應(yīng)鋒，龔昳，孫佳音，等.大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)、鑒定與功能監(jiān)測［J］.中華男科學(xué)雜志，2008，1(14) : 7-10.

［5］吳婷，張煒，睦元庚.體外培養(yǎng)的人睪丸間質(zhì)細(xì)胞對絨毛膜促性腺激素刺激的反應(yīng)［J］.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，2: 132-133.

［6］West A P，Rose M P，Cook B A.Induction of lutropin receptors by lutropin and cyclic AMP in cultured mouse tumour(MA10) leydig cells ［J］.Biochem J，1990，2: 499-503.

［7］柳海燕，王大勇，時(shí)姍姍，等.GnRH 類似物對大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞MAPK 的影響［J］.2010，16(3) :212-216.

［8］高慧艷，李春陽，蘇曉東，等.氯化錳對大鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞睪酮合成及去勢大鼠生殖內(nèi)分泌的影響［J］.2010，45(3) : 419-422.