程琪，溫權，胡小林，徐真昊，廖智宇，趙一雷，

（1. 上海交通大學生命科學技術學院，微生物代謝國家重點實驗室，上海，200240；2. 上海中學，上海，200231）

近年來，β-內酰胺類抗生素（beta-lactam antibiotics）在臨床及農業(yè)上的廣泛應用，是細菌的耐藥性不斷增強的原因之一，其中產生β-內酰胺酶（beta-lactamase）水解該類抗生素是細菌耐藥的重要機制之一[1]。根據Ambler分類法，β-內酰胺酶分為A/B/C/D四類，其中，A/C/D三類通過活性位點的絲氨酸殘基來催化水解；而B類β-內酰胺酶為金屬β-內酰胺酶(MBL, metallo-beta-lactamase)，其活性位點需要一個或兩個金屬離子協(xié)助催化水解[2]。MBL可以催化水解除單環(huán)外的所有β-內酰胺酶，且對常規(guī)的β-內酰胺酶抑制劑有抵制作用。金屬酶編碼的耐藥基因位于細菌染色體、質?；蛘咿D座子上，并以基因盒的形式存在于整合子中。整合子屬于可移動基因元件，可借助整合子的移動、基因盒的插入、切除而導致細菌間耐藥性呈水平傳播，同時，基因盒與整合子隨著基因環(huán)境的改變也將不斷進化，產生新的耐藥方式，給臨床抗菌治療帶來嚴峻的挑戰(zhàn)[3]。

新德里金屬β-內酰胺酶-1(NDM-1, New Delhi metallo-betalactamase)最早于2009年從肺炎克雷伯菌的瑞典患者中分離得到[4]，其催化活性需要一個或兩個鋅離子的協(xié)助，屬于Bush分類中B1類MBL[5,6]。通過對其三維結構的研究發(fā)現(xiàn)，其骨架具有α/β/β/α折疊特征[7]。除替加環(huán)素和多粘菌素，NDM-1能夠水解幾乎所有抗生素，藥物動力學實驗表明，NDM-1相比其他大部分NDM-1具有更強的水解活性。NDM-1編碼基因主要攜帶在不同質粒上，能夠在敏感菌株中自由轉移[8]。

本文先利用生物信息學的方法，從NDM-1與其它金屬β-內酰胺酶同源性較低入手，對NDM-1序列進行分析，為NDM-1的低同源性和廣譜耐藥性由于基因水平轉移過程中造成基因特性改變的猜想提供佐證。然后利用計算機分子模擬手段，對NDM-1與替加環(huán)素進行對接，分析替加環(huán)素抑制NDM-1的分子機制，為NDM-1抑制劑的合理設計奠定基礎。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

金屬-β-內酰胺酶氨基酸和編碼基因序列信息來自于生物信息數(shù)據庫NCBI。首先將NDM-1的氨基酸序列進行BLAST比對，結合文獻[9]中MBL的種類和來源，在BLAST打分較高的序列中篩選氨基酸序列進行后續(xù)研究。在NCBI數(shù)據庫中，下載所有待研究MBL的編碼基因序列，用于基因序列分子進化樹的構件分析。

NDM-1 [Klebsiella pneumoniae]和YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594] 編碼基因及其上下游1000bp基因信息均來自生物信息數(shù)據庫NCBI。分別下載Klebsiella pneumoniae strain 601 plasmid pNDM-OM（NCBI編號：NC_019889.1）和Erythrobacter litoralis HTCC2594 chromosome（NCBI編號：NC_007722.1）的基因序列，找到NDM-1和bl2編碼基因的位置，選取其上下游1000bp的基因序列，進行GC含量分析。

用于與藥物分子替加環(huán)素對接的蛋白Apo-NDM-1的立體結構3S0Z-A來自蛋白質三維結構PDB數(shù)據庫。替加環(huán)素藥物分子由Sybyl-x軟件繪制得到。

2.2 實驗方法

2.2.1多序列比對與分子進化樹構建

本文構建氨基酸和基因序列進化樹的方法是序列相似性比較，利用Mega軟件[10]采用NJ鄰接法對上述所得金屬-β-內酰胺酶的氨基酸和基因序列進行多序列比對，生成分子進化樹文件，并修改注釋信息，生成環(huán)狀系統(tǒng)樹圖像。

2.2.2GC含量分析

在R軟件的seqinr程序包[11]中，計算NDM-1 [Klebsiella pneumoniae]和YP_458405.1 [Erythrobacter litoralis HTCC2594]編碼基因及其上下游1000bp基因的GC含量，滑動窗口為100bp，每次向右滑動1bp。以編碼基因開始的位置為橫軸0點，得到GC含量隨基因位置變化圖。

2.2.3替加環(huán)素與NDM-1分子對接

選用3S0Z-A蛋白的結構文件，使用pymol軟件包，去掉蛋白質中的小分子和水，再利用Sybyl-x軟件繪制替加環(huán)素分子。結合文獻報導以及CASTp網站工具[12]預測得到的3S0Z-A的活性位點，將替加環(huán)素分子移動到3S0Z-A預測作用位點。將對接文件讀入Autodock軟件中，確定小分子構象變化的范圍，進行vina批處理，生成最優(yōu)結合方式的文件以及其結合能。最后用DS軟件讀入對接好的文件，選定小分子為中性，顯示與其相距5.00?的蛋白的部分，此范圍為可能形成氫鍵的范圍，統(tǒng)計與替加環(huán)素分子相距5.00?的氨基酸和該位置出現(xiàn)潛在氫鍵的構象個數(shù)。

3 結果與討論

3.1 氨基酸序列的分子進化樹構建

使用Mega軟件對金屬β-內酰胺酶族的氨基酸序列進行多序列比對，構建分子進化樹并查看環(huán)狀無根樹結構圖像。分子進化樹共分為3個主枝，分別對應為Bush分類中的三大類。與NDM系列分子進化關系最近的MBL為3個分類并不明確的bl2，分別為YP_003061440.1[Hirschia baltica ATCC 49814]，YP_003270512.1[Haliangium ochraceum DSM 14365]，YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]，Hirschia baltica屬于紅細菌屬，Erythrobacter litoralis屬于赤桿菌屬，Haliangium ochraceum是來源于海洋的一類粘細菌，三種細菌均來自于海洋。

蛋白質的序列差異關系所構建的分子進化樹，給出分支層次或拓撲圖形，是產生新的基因復制或享有共同祖先的生物體的歧異點的一種反映，通過蛋白質的分子進化樹分析，為從分子水平研究蛋白質進化關系。金屬-β-內酰胺酶族的氨基酸序列的分子進化樹顯示NDM-1與來自海洋細菌的MBL具有在功能上具有較近的距離。因此，從分子進化的角度來看，NDM-1與YP_003061440.1, YP_003270512.1, YP_458405.1具有較高的同源性，而與其他MBL同源性較低。這個現(xiàn)象啟示我們NDM-1可能在遺傳上與來自海洋細菌的MBL有著密不可分的關系。

3.2 基因序列的分子進化樹構建

使用Mega軟件對金屬-β-內酰胺酶族的基因序列進行多序列比對，構建分子進化樹并查看無根樹結構圖像，發(fā)現(xiàn)MBL的基因序列分子進化樹與氨基酸序列的分子進化樹并不完全一致，改變最為明顯的為NDM系列與三種分類不明確的bl2。與NDM系列分子進化關系最近的MBL基因，其編碼蛋白是YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]，另兩個與NDM系列功能進化關系較近的M B L，即YP_003061440.1[Hirschia baltica ATCC 49814]，YP_003270512.1[Haliangium ochraceum DSM 14365]，其基因序列的進化關系較遠。

在親緣關系較遠的物種間某個特定基因序列有較高相似性，一般可以作為基因水平轉移的初始證據或懷疑對象。雖然進化樹也有其本身的缺陷，用于構建進化樹的序列信息并不能準確的反映所有物種之間的進化關系，但進化樹法仍是檢測基因水平轉移行之有效的方法之一。根據我們所得到的基因序列分子進化樹，與NDM編碼基因分子進化關系最近的MBL編碼基因為YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]編碼基因，來源物種為海洋細菌，在物種進化關系上與肺炎克雷伯菌和大腸桿菌等細菌關系較遠，這一結果為NDM-1與基因水平轉移相關提供佐證。

3.3 GC含量分析

計算目標基因序列及其上下游1000bp序列的GC含量，取編碼基因起始的地方為x軸的0值，發(fā)現(xiàn)NDM-1上游100～350bp的GC含量異常，出現(xiàn)較大波動，由60%左右下滑至越35%。與YP_458405.1對比來看，NDM-1與其在編碼區(qū)段GC含量具有較高的吻合度，平均在63%附近，并且波動正常，而在非編碼區(qū)段的上下游1000bp內GC含量差別較大，并且沒有直觀的聯(lián)系。

原核生物不同細菌物種之間基因的GC含量不同，而每個細菌物種基因組GC含量相對來說是較穩(wěn)定的，不受外界因素影響，某段特定DNA序列的GC含量明顯高于或低于其基因組的其他部分或者出現(xiàn)較為異常的波動可以作為推斷其是否發(fā)生基因水平轉移的依據。NDM-1上游GC含量的劇烈波動以及其與YP_458405.1編碼基因區(qū)段GC含量的高度吻合，在一定程度上證明了基因水平轉移的可能性。

圖1金屬-β-內酰胺酶氨基酸序列的分子進化樹Fig.1Phylogenetic tree of metallo-β-lactamase amino acid sequence

圖2金屬β-內酰胺酶基因序列的分子進化樹Fig.2Phylogenetic tree of metallo-β-lactamase gene sequence

圖3NDM-1與YP_458405.1編碼基因的GC含量Fig.3GC content of NDM-1 and YP_458405.1 encoding gene

3.4 NDM-1與替加環(huán)素對接分析

利用Autodock軟件得到9種最優(yōu)的結合方式（表1），其中最優(yōu)構象如圖4所示。在Discovery studio軟件中顯示與替加環(huán)素分子相距5.00?的蛋白部分，記錄對應的氨基酸和該位置出現(xiàn)潛在氫鍵的構象個數(shù)（表2）。

表1替加環(huán)素與3S0Z-A對接的最優(yōu)結合方式Table 1the optimal combination ways of tigecycline docking with 3S0Z-A

表2與替加環(huán)素分子相距5.00?的氨基酸和該位置出現(xiàn)潛在氫鍵的構象個數(shù)Table 2The amino acid and number of potential hydrogen bonds within 5.00? apart

NDM-1對除了多粘菌素（colistin）和替加環(huán)素（圖5）（tigecyline）外的幾乎所有類型的抗生素均具有耐藥性[13]。多粘菌素的反應機理是與原核生物的核糖體S30小亞基相互結合抑制細菌，而且現(xiàn)已出現(xiàn)抗藥型菌株。替加環(huán)素是2005年FDA認證的抗生素藥物[14]，可以競爭性抑制NDM-1蛋白，然而替加環(huán)素并不能始終如一的抑制NDM-1蛋白，所以基于替加環(huán)素的新藥研發(fā)成為一個治療超級細菌感染的突破點。

圖4替加環(huán)素與3S0Z-A對接的最優(yōu)構象Fig 4the optimal conformation of tigecycline docking with 3S0Z-A

文獻中報導了Ceftriaxone、Cefepime、Cefoperazone、Imepenum和Meropenum這5種抗生素與3S0Z-A對接形成的氫鍵方式（表3）[15]，結合本文潛在氫鍵分析統(tǒng)計（表2），其中204H和165K是其它抗生素的氫鍵區(qū)，而替加環(huán)素的9種結合方式都普遍與氫鍵143H和76H形成氫鍵，即這兩個氫鍵很可能是替加環(huán)素獨特的結合方式。

表35種抗生素與3S0Z-A對接形成的氫鍵方式Table 3 hydrogen bond of 5 antibiotics docking with 3S0Z-A

分析對接的結合能改變，最優(yōu)結構為結合能為-8.8kcal/mol，最差結構為-7.5kcal/mol，均比5種抗生素的結合能低，所以推斷出替加環(huán)素的IC50可能更小，說明滅菌一半時所需抗生素藥物濃度更少，所以在同樣濃度抗生素與蛋白質作用時替加環(huán)素比其它β-內酰胺類抗生素更加有競爭性抑制優(yōu)勢。

結合NDM-1和替加環(huán)素結合的三維結構，ASL1環(huán)位于反應中心上，像一個蓋子一樣蓋住反應中心。當有底物結合時ASL1環(huán)上的76H可能與替加環(huán)素上的-HN-CH2-CO-NH-的2個N原子形成氫鍵。另外143H可能與替加環(huán)素八氫并四苯環(huán)上的-NH3基團形成氫鍵。此外替加環(huán)素上的羰基、氨基等都是可能形成氫鍵的基團。這些基團都可能通過改變取代基的方式來降低結合能，使得更加有競爭性優(yōu)勢。

圖5替加環(huán)素分子結構Fig 5Molecular structure of tigecycline

4 結論

本文通過對金屬-β-內酰胺酶氨基酸序列的系統(tǒng)進化分析，發(fā)現(xiàn)NDM-1與YP_003061440.1[Hirschia baltica ATCC 49814]，YP_003270512.1[Haliangium ochraceum DSM 14365]，YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]三種來自海洋細菌的MBL在功能上關系較近。而通過對MBL的基因序列進化分析，發(fā)現(xiàn)NDM-1僅與YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]具有較近的進化關系。無論從氨基酸序列還是從基因序列，NDM-1與其它MBL進化距離均較遠。分子進化樹與物種進化樹之間巨大的差異有很大可能是由于基因水平轉移導致的。

接著，通過對NDM-1的GC含量進行分析，發(fā)現(xiàn)其編碼基因上游100～350bp處具有較大的波動，而YP_458405.1編碼基因波動平緩，NDM-1與YP_458405.1在編碼基因區(qū)段GC含量相似度較高，基于我們對基因GC含量異?？赡艿脑蛘J識，認為有可能是基因進行水平轉移而導致的GC含量異常。

最后，通過半柔性分子對接，并對NDM-1與替加環(huán)素的優(yōu)勢結合構象的潛在氫鍵進行分析，與另外5種抗生素與NDM-1的對接結果進行比較，初步確定替加環(huán)素對于NDM-1蛋白存在競爭抑制優(yōu)勢。

因此，本文通過NDM-1的功能進化關系和遺傳進化關系，以及NDM-1的GC含量變化，提出NDM-1可能與YP_458405.1[Erythrobacter litoralis HTCC2594]進行基因水平轉移相關的猜想。通過替加環(huán)素與NDM-1分子對接及與其他藥物分子對比，提出替加環(huán)素對于NDM-1蛋白存在競爭抑制優(yōu)勢，從而為NDM-1抑制劑的設計提供有價值的信息。

[1] Walsh T. The emergence and implications of metallo-β-lactamases in Gram-negative bacteria. Clinical Microbiology and Infection,2005, 11(s6): 2-9.

[2] Ambler R. The Structure of $ beta $-Lactamases. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B. Biological Sciences,1980, 289(1036): 321-331.

[3] 李志江, 李海權, 刁現(xiàn)民. 基因水平轉移的評判方法和轉移方式研究進展. 遺傳, 2008, 30(9): 1108-1114.

[4] Yong D, Toleman M A, Giske C G,et al.Characterization of a new metallo-beta-lactamase gene, bla(NDM-1), and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumoniae sequence type 14 from India. Antimicrob Agents Chemother, 2009, 53(12): 5046-5054.

[5] Zhang H, Hao Q. Crystal structure of NDM-1 reveals a common beta-lactam hydrolysis mechanism. FASEB J, 2011, 25(8): 2574-2582.

[6] Branko J, Zorica L, Vesna S. Emergence of NDM-1 metallo-betalactamase in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates from Serbia.Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(8): 3929-3931.

[7] Green V L, Verma A, Owens R J. Structure of New Delhi metalloβ-lactamase 1 (NDM-1). Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun, 2011, 67(Pt 10): 1160-1164.

[8] Wachino J, Arakawa Y. Exogenously acquired 16S rRNA methyltransferases found in aminoglycoside-resistant pathogenic Gram-negative bacteria: an update. Drug Resist Updat, 2012, 15(3):133-148.

[9] Bebrone C. Metallo-beta-lactamases (classification, activity, genetic organization, structure, zinc coordination) and their superfamily.Biochem Pharmacol, 2007, 74(12): 1686-1701.

[10] Tamura K, Dudley J, Nei M. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular biology and evolution, 2007, 24(8): 1596-1599.

[11] Charif D. Lobry J R. SeqinR 1.0-2: a contributed package to the R project for statistical computing devoted to biological sequences retrieval and analysis. Structural approaches to sequence evolution Biological and Medical Physics, Biomedical Engineering. Springer,2007: 207-232.

[12] Dundas J, Ouyang Z, Tseng J ,et al.CASTp: computed atlas of surface topography of proteins with structural and topographical mapping of functionally annotated residues. Nucleic acids research,2006, 34(suppl 2): 116-118.

[13] Kumarasamy K K, Toleman M A, Walsh T R,et al.Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK:a molecular, biological, and epidemiological study. Lancet Infect Dis, 2010, 10(9): 597-602.

[14] Livermore D M. Tigecycline: what is it, and where should it be used?Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 2005, 56(4): 611-614.

[15] Sowmiya M, Umashankar V, Muthukumaran S,et al.Studies on New Delhi Metallo-Beta-Lactamse-1 producing Acinetobacter baumannii isolated from donor swab in a tertiary eye care centre,India and structural analysis of its antibiotic binding interactions.Bioinformation, 2012, 8(10): 445-452.