何 犇李 強(qiáng)*卓 暉唐 偉楊敏美

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬成都第二臨床學(xué)院/成都市第三人民醫(yī)院泌尿外科（成都 610031）；2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科; 3.四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心內(nèi)科

雙向電泳分析精索靜脈曲張不育患者精子蛋白質(zhì)的表達(dá)差異

何 犇1李 強(qiáng)1*卓 暉1唐 偉2楊敏美3

1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬成都第二臨床學(xué)院/成都市第三人民醫(yī)院泌尿外科（成都 610031）；2. 重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院泌尿外科; 3.四川省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心內(nèi)科

目的比較分析正常生育男性與精索靜脈曲張（varicocele, VC）不育患者差異表達(dá)的精子蛋白質(zhì)。方法應(yīng)用計算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)行精液分析，采取Percoll密度梯度離心法提取正常生育男性與VC不育患者精子，利用雙向電泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）分離精子蛋白質(zhì)，建立并優(yōu)化精子蛋白質(zhì)2-DE圖譜，利用PDQuest8.0軟件分析兩組蛋白質(zhì)的差異表達(dá)。結(jié)果正常生育組精子活力高于VC不育組，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩組精子密度比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。獲得了分辨率和重復(fù)性均較好的2-DE圖譜，兩組差異點共36個，VC不育組有11個蛋白位點表達(dá)上調(diào)，19個蛋白位點表達(dá)下調(diào)，2個在VC不育組特異性表達(dá)，4個在正常生育組特異性表達(dá)。結(jié)論 VC不育患者與正常生育男性的精子蛋白存在差異，這些差異蛋白質(zhì)的分離為深入探討VC導(dǎo)致不育的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

精子; 蛋白質(zhì)類; 精索靜脈曲張; 電泳, 凝膠, 雙向; 蛋白質(zhì)組學(xué)

精索靜脈曲張（varicocele, VC）系指精索蔓狀靜脈叢因各種原因引起回流不暢或因靜脈瓣損壞引起血液倒流而形成局部靜脈擴(kuò)張、遷曲、伸長的病理現(xiàn)象[1]。VC是男性不育的常見原因，在男性人群中發(fā)病率為15%～20%[2]，世界衛(wèi)生組織已把VC列為男性不育的首位病因[3]。目前為止，VC引起男性不育的機(jī)制尚不完全清楚。

蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics)是研究一個細(xì)胞、一類組織或一種生物的基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)[4]。雙向電泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）是蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)之一[5]，是當(dāng)前用于尋找差異表達(dá)蛋白質(zhì)的有效手段。本研究采用2-DE分離正常生育男性與VC不育患者精子蛋白質(zhì)，通過建立的2-DE圖譜，比較分析差異表達(dá)的精子蛋白質(zhì)，為進(jìn)一步探討VC導(dǎo)致男性不育的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料和方法

一、材料

蛋白質(zhì)定量試劑盒和PMSF均由碧云天生物技術(shù)研究所提供；Percoll為Bioshorp公司產(chǎn)品；固相化pH梯度膠條（immobilized pH gradient IPG 17cm pH5-8）、Bio-Lyte、clean-up kit試劑盒及尿素均購自美國Bio-Rad公司；硫脲、CHAPS、二硫蘇糖醇（DTT）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、碘乙酰胺（IAA）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、過硫酸銨（APS）、五水硫酸鈉、碳酸鈉均購自加拿大BBI公司；40%丙烯酰胺/甲叉丙烯酰胺購自上海生物工程有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純，所有試劑均用MQ水配制。

（二）精液樣品采集

共收集35份（例）精液標(biāo)本，其中正常生育男性精液（對照組）10份（例），VC不育患者精液（實驗組）25份（例）。研究對象：（1）成年男性，年齡20～35歲，從事非有害有毒工作；（2）無吸煙史或吸煙極少，不善于飲酒和近2周未飲酒；（3）實驗組符合雙側(cè)Valsalva法Ⅱ-Ⅲ級VC的診斷標(biāo)準(zhǔn)，男性患者的女方婦科檢查正常，但婚后同居一年之上無懷孕史。所有樣本均禁欲7d后，采取手淫法收集，并經(jīng)過倫理道德委員會批準(zhǔn)和獲得志愿者簽署知情同意書。

二、方法

（一）精液分析與精子蛋白提取

37℃水浴箱內(nèi)精液液化15～30min后，采用計算機(jī)輔助精子分析系統(tǒng)（computer-assisted semen analysis, CASA）分析精液結(jié)果。根據(jù)處在不同成熟階段的精子和各種細(xì)胞成分有一定的密度差異，在4℃采用50% Percoll密度梯度離心法800g×20min以去除精漿和圓細(xì)胞[6]。用Hepes液連續(xù)懸浮沉積物并離心2×10min，用洗滌緩沖液調(diào)整精子濃度到1×106個/mL。將精子細(xì)胞加入終濃度為1mmol/L的PMSF、EDTA和各10U/mL的DNaseⅠ，RNaseA酶中，搖勻后反復(fù)凍融破碎細(xì)胞。隨后加入裂解液（7mol/L尿素，2mol/L硫脲，4%CHAPS，65mmol/lDTT，0.2%（w/ v）的Ampholyte，0.001%（w/v）的溴酚藍(lán)）冰浴條件下裂解精子樣品。將獲得透明澄清的精子總蛋白溶液在4℃，20 000×g，離心10min，收集上清采用改良Bradford法進(jìn)行蛋白定量。采取clean-up kit法按照試劑盒說明書操作去除雜質(zhì)后，用裂解液重溶。獲得的蛋白樣品存放在-80℃?zhèn)溆谩?/p>

（二）等電聚焦（IEF）電泳

從-80℃冰箱中取樣本后室溫溶解，加入上樣水化液（7mol/L尿素、2mol/L硫脲、4%(m/v) CHAPS、65mmol/LDTT、0.2%Bio-Lyte、0.001%（w/v）的溴酚藍(lán)），采用250μg的上樣量，pH5-8的膠條，主動水化方式行等電聚焦。

（三）十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳

羅四強(qiáng)突然伸出手機(jī)，說：“阿里，你聽這個。”他說著，按了一個鍵。哀樂立即響了起來。雖然夾著雜音，卻也低沉婉轉(zhuǎn)地回蕩在房間里。

將等電聚焦后的IPG膠條于5mL平衡緩沖液Ⅰ（6mol/L尿素、2%SDS 0.375mol/L Tris-HCl pH 8.8、20%甘油、2%DTT）內(nèi)搖床振蕩平衡15min；換用平衡緩沖液Ⅱ（6mol/L尿素、2%SDS、0.375mol/L Tris-HCl pH 8.8、20%甘油、2.5%IAA）振蕩平衡15min。將平衡好的膠條移至12%的聚丙烯酰胺凝膠上端，上部用0.5%低溶點瓊脂糖封膠。設(shè)置電泳參數(shù)進(jìn)行二向垂直平板SDS-PAGE。

（四）凝膠染色及圖像分析

采用改良硝酸銀法。銀染固定液（體積分?jǐn)?shù)50%甲醇，體積分?jǐn)?shù)10%乙酸）固定凝膠2h；體積分?jǐn)?shù)50%乙醇洗滌液漂洗3次，10min/次；敏化液（0.2%硫代硫酸鈉）敏化2min；超純水洗滌3次，5min/次；加新配制的銀染液（0.2%AgNO3、體積分?jǐn)?shù)0.075%甲醛）避光銀染25min后超純水漂洗3次，1min/次；加顯色液（2%無水碳酸鈉、0.0004%硫代硫酸鈉、體積分?jǐn)?shù)0.05%甲醛）反應(yīng)4～15min后，終止液（體積分?jǐn)?shù)50%甲醇，體積分?jǐn)?shù)10%乙酸）終止反應(yīng)。保存液（1%乙酸）4℃冰箱保存凝膠。雙向電泳凝膠用GS-800Calibrated Densitometer圖像掃描儀透射掃描，將掃描后的圖像采用PDQuest8.0雙向凝膠軟件分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，各組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組結(jié)果比較采用方差分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、兩組精液分析的比較

根據(jù)新編寫的第五版《世界衛(wèi)生組織人類精液分析實驗室技術(shù)手冊》（WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)）[7]，采用CASA分析精液結(jié)果見表1。兩組精液精子密度無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），精子活力有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

二、精子蛋白2-DE圖譜的建立

我們采取clean-up kit法對樣品進(jìn)行預(yù)處理，選取pH5-8的固相化pH梯度膠條，采用250μg的上樣量有效的分離了精子蛋白，凝膠背景干凈，蛋白點分布均勻、清晰，橫條紋較少，圖譜質(zhì)量較好。經(jīng)圖像分析軟件PDQuest8.0分析，發(fā)現(xiàn)正常生育男性組與VC不育組圖譜平均蛋白質(zhì)點數(shù)分別為：889±26個和（857±16）個，其匹配率分別達(dá)77.9%和78.9%。蛋白質(zhì)點主要分布在等電點5～7之間，相對分子質(zhì)量為14～97kD。兩組圖譜在等電聚焦方向上的平均偏差分別為（0.78±0.14）mm和（0.82±0.16）mm，在SDSPAGE電泳方向上的平均偏差分別為（1.13±0.18）mm和（1.02±0.21）mm。以上結(jié)果表明我們已建立了分辨率高、重復(fù)性好的精子蛋白2-DE圖譜（圖1）。

表1 正常生育組與VC不育組精液分析結(jié)果的比較（±s）

表1 正常生育組與VC不育組精液分析結(jié)果的比較（±s）

注:*與對照組比較,P＜0.05

精子參數(shù) 正常生育男性 VC不育患者P值(n=10) (n=25)精子密度(106/mL) 27.50±4.92 25.60±6.57 0.361前向運動精子(%) 38.80±5.92 20.20±6.92*0.000

圖1 正常生育男性與VC不育患者精子蛋白2-DE圖譜

三、2-DE圖譜中的特點和差異蛋白點分析

將兩組2-DE圖譜上的蛋白質(zhì)點進(jìn)行匹配分析，發(fā)現(xiàn)兩組中存在差異表達(dá)的蛋白36個。與正常生育男性組相比，VC不育組有11個蛋白點表達(dá)上調(diào)（相差兩倍以上），19個蛋白點表達(dá)下調(diào)（相差兩倍以上）。另外有2個蛋白點在VC不育組中特異表達(dá)，4個蛋白點在正常生育男性組中特異表達(dá)。特異表達(dá)的差異蛋白點放大圖譜見圖2，等電點和分子量見表2。

表2 特異表達(dá)蛋白質(zhì)的等電點和分子量

圖2 兩組特異表達(dá)蛋白質(zhì)點的放大圖譜

討 論

VC是青年男性泌尿科常見疾病，1880年英國外科醫(yī)生Barfield首先報道了VC可導(dǎo)致不育。國外學(xué)者報道VC在原發(fā)性不育男性中發(fā)病率為30%～35%，繼發(fā)性不育男性中發(fā)病率為69%～81%[8,9]。國內(nèi)報告約21%～41%的VC患者因不育就診[10]，進(jìn)一步研究表明隨著VC程度加重，患者精液參數(shù)異常更加明顯[11]。目前對于VC致男性不育的機(jī)制已進(jìn)行了不少研究，但其發(fā)病機(jī)制至今仍未完全清楚，可能是通過睪丸微循環(huán)、血管活性物質(zhì)、氧自由基、缺氧、一氧化氮、免疫及凋亡等多種途徑共同作用[12-14]。VC與所有疾病的發(fā)生一樣，都會在蛋白質(zhì)水平出現(xiàn)與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)異常，而且這種變化必然涉及到許多蛋白質(zhì)及蛋白質(zhì)之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)。以往的研究大多停留在基因水平，而且僅研究單個或者少數(shù)幾個分子的作用，在蛋白質(zhì)水平上缺乏系統(tǒng)性的整體研究。我們前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)VC不育患者與正常成人精漿蛋白表達(dá)存在差異，提示VC導(dǎo)致不育可能與這些蛋白的表達(dá)或修飾改變相關(guān)[15]。

比較蛋白質(zhì)組學(xué)即通過比較分析不同條件蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)，著眼發(fā)現(xiàn)和鑒定出有差異的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)群。目前，比較蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于尋找新的藥物治療靶點、研究發(fā)病機(jī)制等方面。采用2-DE結(jié)合生物質(zhì)譜分析技術(shù)，從比較蛋白質(zhì)組的角度對VC不育患者精子蛋白質(zhì)進(jìn)行研究，有可能發(fā)現(xiàn)與VC致男性不育的相關(guān)蛋白，可以為研究VC致男性不育的病理機(jī)制提供有益線索。同時，新發(fā)現(xiàn)的蛋白有可能成為男性不育的治療靶點。因此，采用比較蛋白質(zhì)組技術(shù)研究VC致男性不育的病理機(jī)制具有重要意義。

本實驗采用比較蛋白質(zhì)學(xué)的研究思路，以正常生育男性與VC不育患者為研究對象，比較兩組精子蛋白組的差異，尋找VC引發(fā)男性不育的相關(guān)蛋白。分析雙向電泳圖譜表明：兩組共有36個差異點，其中在VC不育組有11個表達(dá)上調(diào)，19個表達(dá)下調(diào)，2個蛋白點在VC不育組中特異表達(dá)，4個蛋白點在正常生育男性組中特異表達(dá)。這些實驗結(jié)果顯示，兩組在蛋白質(zhì)水平上存在明顯差異，同時提示VC引發(fā)男性不育不僅涉及少數(shù)的幾種蛋白質(zhì)，而是大量蛋白質(zhì)相互作用的結(jié)果。那些在VC不育組中低表達(dá)的蛋白質(zhì)可能是男性生育的必須蛋白，而高表達(dá)的蛋白質(zhì)可能起著干擾生育某個環(huán)節(jié)的作用。目前這些差異蛋白質(zhì)的基本屬性如等電點和分子量已經(jīng)初步明確，尚需要進(jìn)行質(zhì)譜測序鑒定，并了解其生物學(xué)功能和結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步探索VC引發(fā)男性不育的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

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（2014-03-25收稿）

Differential expression analysis of sperm proteins in infertile men with varicocele using two-dimensional gel electrophoresis

He Ben1, Li Qiang1*, Zhuo Hui1, Tang Wei2, Yang Minmei31. Department of Urology, the Second Aff liated Hospital of Chengdu, Chongqing Medical University/the Third Peoples Hospital of Chengdu, Chengdu, China; 2. Department of Urology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University; 3.Department of Cardiology, Sichuan Provincial Hospital of Integrative of Traditional Chinese and Western Medicine

Li Qiang, E-mail: cdlql2002@yahoo.com.cn

ObjectiveTo study the differential expression of sperm proteins between fertile men and infertile men with varicocele(VC).MethodsSperm samples were analyzed by computer-assisted semen analysis system. Sperm proteins were extracted by percoll density gradient centrifugation, and the separation of total proteins was performed by two-dimensional electrophoresis(2-DE). The differentially expressed proteins of two groups were analyzed with PDQuest software.ResultsThe sperm motility in infertile men with VC demonstrated a signif cant decrease compared with the fertile men(P<0.05), and there was no signif cant difference between two groups in sperm concentration(P>0.05). Protein prof le of sperm was acquired with clear background, high resolution and better reproduction.Total of 36 different proteins were found, including 11 upregulated protein and 19 downregulated proteins in infertile men with VC group, and two proteins only expressed in infertile men with VC group, the other four proteins only expressed in fertile men group.ConclusionThere are differential expression of sperm proteins between fertile men and infertile men with VC. Differential proteins analysis will be helpful to explore the molecular mechanism of VC-associated male infertility.

spermatozoa; proteins; varicocele; electrophoresis, gel, two-dimensional; proteomics

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.06.005

R697+. 24

*通訊作者, E-mail: cdlql2002@yahoo.com.cn