艾 婷，周 軍，陳 濤，胡 衛(wèi)，萬(wàn)信念，?？〗?/p>

乳腺癌是最常見(jiàn)的導(dǎo)致婦女死亡的惡性腫瘤之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)在西方國(guó)家，乳腺癌每年的發(fā)病率和死亡率在所有婦女癌癥中是最高的，且呈逐年增加的趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅女性的健康。預(yù)計(jì)到2030年，乳腺癌的死亡率將是現(xiàn)在的兩倍［1］。中藥復(fù)方目前仍是中醫(yī)藥防治腫瘤的主流，QHF復(fù)方是從具有清熱解毒(Q)、活血化瘀 (H)、扶正固本 (F)作用的中藥中提取的多個(gè)抗腫瘤有效組分，通過(guò)文獻(xiàn)研究及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并采用均勻設(shè)計(jì)法篩選得到的成分組方［2］。前期實(shí)驗(yàn)已經(jīng)表明QHF復(fù)方在體內(nèi)具有良好的抗腫瘤作用，本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步研究其體外抗癌作用的效果及可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞系華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。華蟾素注射液購(gòu)自安徽金蟾生化股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字:Z34020273，批號(hào):120811-3，規(guī)格:5 ml/支;20(R)人參皂苷Rg3標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司，批號(hào):20120506，規(guī)格:20 mg/瓶;香菇多糖購(gòu)自南京澤朗植提技術(shù)有限公司，規(guī)格:1 g/包;注射用血塞通 (凍干)購(gòu)自昆明制藥集團(tuán)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字:Z20026438，批號(hào):12GA12，規(guī)格:400 mg/支;注射用鹽酸多柔比星購(gòu)自浙江海正藥業(yè)股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字:H33021980，批號(hào):012027CF，規(guī)格:10 mg/支;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;胰蛋白酶購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子酶聯(lián)免疫分析試劑盒購(gòu)自上海勁馬有限公司。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 藥物的配制 (1)20(R)人參皂苷Rg3原液的配制:用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取10 mg 20(R)人參皂苷Rg3，在超凈工作臺(tái)上加入400μl二甲基亞砜 (DMSO)溶解，加DMEM培養(yǎng)基至10ml，使其濃度為1mg/ml，4℃冰箱保存。(2)三七總皂苷原液的配制:用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取血塞通凍干粉末10 mg，在超凈工作臺(tái)上加DMEM培養(yǎng)基至10 ml，使其濃度為1 mg/Ml，4℃冰箱保存。(3)香菇多糖原液的配制:用分析天平準(zhǔn)確稱(chēng)取60 mg香菇多糖，在超凈工作臺(tái)上加DMEM培養(yǎng)基至10 ml，使其濃度為10 mg/ml，4℃冰箱保存。(4)中藥QHF復(fù)方的配制:按照華蟾素∶人參皂苷Rg3∶三七總皂苷∶香菇多糖=57∶1∶0．4∶7的比例進(jìn)行配制。QHF濃度從高到低依次命名為:QHF1、QHF2、QHF3、QHF4和QHF5，每次配制3 ml。配方見(jiàn)表1，4℃冰箱保存。(5)鹽酸多柔比星原液的配制:在超凈工作臺(tái)上，加DMEM培養(yǎng)基將鹽酸多柔比星稀釋至1 mg/ml，4℃冰箱避光保存。

1．2．2 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37℃，含5%二氧化碳 (CO2)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液一次，當(dāng)細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)并處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

表1 QHF復(fù)方的配制 (3 ml)Table 1 Preparation of QHF

1．2．3 四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法 (MTT法)測(cè)定中藥QHF復(fù)方對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，用0．25%胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞計(jì)數(shù)，以2×104個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于96孔板，37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h后給藥。設(shè)空白組 (不加細(xì)胞)、正常對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組 (加入鹽酸多柔比星使其終濃度為2．5μg/ml)、QHF藥物組 (分為5個(gè)濃度)分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，每個(gè)濃度和時(shí)間點(diǎn)設(shè)5個(gè)復(fù)孔。藥物作用時(shí)間終止前4 h，于每孔中各加入5 mg/ml MTT 20μl，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h。吸棄96孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入150μl DMSO，搖床上振蕩5 min，使紫色結(jié)晶充分溶解。于酶標(biāo)儀上在波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)各孔光密度值。按下列公式計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率=〔(正常對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值)/(正常對(duì)照組OD值-空白組OD值)〕 ×100%。

1．2．4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 根據(jù)MTT法計(jì)算出中藥QHF復(fù)方半數(shù)抑制濃度 (IC50)，將實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、QHF復(fù)方組 (濃度為IC50)、鹽酸多柔比星組、聯(lián)合用藥組(中藥QHF復(fù)方+鹽酸多柔比星)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰酶消化后臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞活力大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×104/ml。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。消化收集細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，將細(xì)胞重懸于1 ml75%的冰乙醇中，4℃固定過(guò)夜。過(guò)夜后，800 r/min離心5 min(離心半徑135 mm)，棄去固定液，磷酸鹽緩沖液 (PBS)3 ml沖洗2次，800 r/min離心5 min(離心半徑135 mm)，每個(gè)標(biāo)本加入40μg/Ml RNA酶400μl，37℃水浴30 min，然后每個(gè)標(biāo)本加入碘化并啶(PI)染液100μl混勻，4℃避光染色30 min，用300目尼龍膜過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1．2．5 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 (ELISA)法檢測(cè)細(xì)胞上清液中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (VEGF)的含量 收集不同濃度中藥QHF復(fù)方處理后的MCF-7細(xì)胞上清液，檢測(cè)各組上清液中VEGF含量，具體的實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

1．2．6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用胰酶消化后，用含0．2%胎牛血清清蛋白 (BSA)的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞活力大于95%，調(diào)整細(xì)胞濃度為7×104/ml。取100μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室的上室中，分別加入不同濃度的中藥QHF復(fù)方，使上室中的液體總濃度為200μl。下室中加入600μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將小室放入，于37℃，含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄小室內(nèi)的培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦去膜內(nèi)表面的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定1 h，結(jié)晶紫染色30 min后，清水沖洗3次，用鑷子輕輕揭下濾膜，放在載玻片上。200倍光鏡下觀察濾膜外的細(xì)胞，隨機(jī)選擇5個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算出平均值。

1．2．7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將盛有Matrigel膠的EP管從-20℃冰箱中取出，4℃過(guò)夜融化。用預(yù)冷的槍頭將Matrigel膠與無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基按1∶3稀釋。在小室濾膜的上表面涂一層50μl稀釋過(guò)的Matrigel膠，放入37℃，CO2的培養(yǎng)箱中30 min，使其聚合成凝膠，用之前在紫外燈下殺菌2 h。其余步驟同遷移性實(shí)驗(yàn)。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以 (±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 中藥QHF復(fù)方對(duì)MCF-7細(xì)胞的體外增殖抑制效果MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:不同濃度的QHF作用于MCF-7細(xì)胞24、48、72 h后，隨著中藥QHF復(fù)方濃度的增加，生長(zhǎng)抑制率不斷增加;且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，生長(zhǎng)抑制率逐漸增加 (=18．383，P ＜0．01，見(jiàn)圖 1)。24、48、72 h的中藥 QHF 復(fù)方IC50值對(duì)應(yīng)華蟾素濃度分別為 214．3、44．8、2．8 μl。

2．2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果 作用48 h后，與正常對(duì)照組比較，QHF復(fù)方組、鹽酸多柔比星組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞周期位于G0/G1期和S期的比例增多，位于G2/M期的比例減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0．05);與聯(lián)合用藥組比較，QHF復(fù)方組、鹽酸多柔比星組細(xì)胞周期位于G0/G1期的比例減少，位于S期和G2/M期的比例增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05，見(jiàn)表2)。

表2 不同組人乳腺癌MCF-7細(xì)胞不同細(xì)胞周期所占比例比較(± s，%)Table 2 Comparison of different cell cyclesofhuman breast cancer cell line MCF-7 in different groups

表2 不同組人乳腺癌MCF-7細(xì)胞不同細(xì)胞周期所占比例比較(± s，%)Table 2 Comparison of different cell cyclesofhuman breast cancer cell line MCF-7 in different groups

注:與正常對(duì)照組比較，*P＜0．05;與聯(lián)合用藥組比較，△P＜0．05

組別 例數(shù) G0/G1期 S期 G2/M期正常對(duì)照組 3 3．9 ±0．25 9．7 ±0．36 86．4 ±4．68 QHF 復(fù)方組 3 43．5 ±1．32＊△ 34．9 ±3．17＊△ 21．6 ±1．80＊△鹽酸多柔比星組 3 43．1 ±3．80＊△ 35．1 ±1．96＊△ 21．8 ±2．69＊△聯(lián)合用藥組 3 56．6 ±3．14* 32．9 ±1．60* 10．5 ±2．27*F 0．000 0．000 0．000 238．234 110．256 383．572 P值值

2．3 中藥QHF復(fù)方對(duì)MCF-7細(xì)胞上清液中VEGF含量的影響 ELISA結(jié)果顯示:作用48 h后，與正常對(duì)照組比較，QHF1組、QHF2組、QHF3組、QHF4組和QHF5組上清液中VEGF含量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=238．234，P＜0．05，見(jiàn)圖 2)。

2．4 中藥QHF復(fù)方對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移及侵襲能力的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:QHF1組、QHF2組對(duì)細(xì)胞的抑制作用較大，使穿膜的細(xì)胞數(shù)顯著減少，對(duì)Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大，選取QHF3組、QHF4組和QHF5組3個(gè)抑制作用相對(duì)較低的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。與正常對(duì)照組 (127．3±5．7)比較，QHF3組 (17．7 ±5．0)、QHF4 組 (51．3 ±2．9)和 QHF5 組(63．0±6．6)穿透濾膜的MCF-7細(xì)胞數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (F=109．667，P ＜0．01，見(jiàn)圖3)。

圖1 中藥QHF復(fù)方對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率Figure 1 Growth-inhibiting effect of compound QHF on MCF-7 cells

圖2 ELISA法檢測(cè)上清液中VEGF的表達(dá)Figure 2 Expression of VEGF determined by ELISA

圖3 中藥QHF復(fù)方對(duì)MCF-7細(xì)胞侵襲能力的影響 (結(jié)晶紫染色，光鏡，×200)Figure 3 Effect of compound QHF on MCF-7 cell invasion determined by crystal violet staining

3 討論

乳腺癌是導(dǎo)致婦女死亡最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，容易早期發(fā)生血行播散，對(duì)女性健康威脅極大。目前，乳腺癌的治療措施有外科手術(shù)、化療、放療、靶向生物治療等，對(duì)大多數(shù)乳腺癌細(xì)胞有一定的殺傷作用，但仍有25%～30%的早期乳腺癌患者在隨訪10～15年之后發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［3］。同時(shí)腫瘤細(xì)胞的耐藥性及化療藥物的毒副作用也是腫瘤治療過(guò)程中的另一難題，因此動(dòng)、植物來(lái)源的天然化合物已經(jīng)成為抗癌藥物的主要研究方向。目前中藥復(fù)方仍是中醫(yī)藥防治腫瘤的主流，其多成分、多環(huán)節(jié)和多靶點(diǎn)整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)對(duì)于多基因調(diào)控、發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、病情多變的腫瘤防治來(lái)說(shuō)具有非常重要的意義。且中藥又因其獨(dú)特的抗腫瘤效應(yīng)、放化療增敏以及減輕放化療毒副作用及延長(zhǎng)患者生存期等方面獨(dú)具效果而逐漸被重視［4-6］。因此，本實(shí)驗(yàn)的目的就是探討中藥QHF復(fù)方在體外對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及VEGF表達(dá)的影響，從而為乳腺癌的臨床治療奠定基礎(chǔ)。

中藥QHF復(fù)方是由華蟾素、人參皂苷Rg3、三七總皂苷、香菇多糖以一定比例配伍而成，其中華蟾素與人參皂苷Rg3在復(fù)方中占主導(dǎo)地位［7］。華蟾素注射液由中華大蟾蜍皮經(jīng)過(guò)水化萃取、加工而成，美國(guó)已經(jīng)完成華蟾素注射液Ⅰ期抗腫瘤的臨床試驗(yàn)，目前正在進(jìn)行華蟾素注射液的Ⅱ期抗腫瘤臨床試驗(yàn)［8］。研究表明華蟾素能抑制HepG-2細(xì)胞的增殖并呈濃度依賴(lài)性，還能阻滯腫瘤細(xì)胞周期［9］，本研究 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同濃度的中藥QHF復(fù)方均能抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖，且隨著藥物濃度的增大及作用時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率也隨之增大;流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，QHF復(fù)方組細(xì)胞周期位于G0/G1期和S期的比例增多，位于G2/M期的比例減少。人參皂苷Rg3是一種四環(huán)三萜皂苷，是從中藥人參根的浸出液中分離出來(lái)的一種有效單體成分，其抗腫瘤作用已經(jīng)引起了廣泛重視，但確切機(jī)制尚未明了。有研究證實(shí)人參皂苷Rg3能抑制動(dòng)物體內(nèi)多種移植瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，且對(duì)重要臟器無(wú)明顯毒副作用［10］。本研究通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)表明，中藥QHF復(fù)方能降低MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力，且呈現(xiàn)較好的濃度依賴(lài)性。研究結(jié)果表明QHF復(fù)方有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力，與現(xiàn)有的研究報(bào)道結(jié)果相符［11］。

乳腺癌患者死亡的主要原因是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，而導(dǎo)致腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要因素是腫瘤新生血管的形成。已經(jīng)證實(shí)VEGF是目前發(fā)現(xiàn)最重要的直接作用于血管內(nèi)皮的生長(zhǎng)因子［12］。VEGF是由腫瘤細(xì)胞分泌進(jìn)入體液，其能特異性地對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)的降解及血管構(gòu)建等方面進(jìn)行調(diào)控。研究表明，無(wú)論是在mRNA水平還是蛋白水平，在多種惡性腫瘤中VEGF的表達(dá)均增高，而抑制VEGF的表達(dá)可抑制腫瘤的生長(zhǎng)［13］。因此探討中藥QHF復(fù)方對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響對(duì)研究中藥QHF復(fù)方抗腫瘤的具體機(jī)制有重要意義。本研究結(jié)果表明，中藥QHF復(fù)方能降低人乳腺癌MCF-7細(xì)胞上清液中VEGF含量，提示中藥QHF復(fù)方抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用的可能與其抑制腫瘤細(xì)胞VEGF的分泌和合成有關(guān)。目前，對(duì)中藥抗腫瘤血管生成研究主要圍繞中藥對(duì)腫瘤新生血管形成的影響及抑制VEGF/血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 (VEGFR)相關(guān)信號(hào)通路展開(kāi)［14］，但其調(diào)控信號(hào)傳導(dǎo)從細(xì)胞外經(jīng)細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核而發(fā)揮效應(yīng)的具體機(jī)制和環(huán)節(jié)尚需進(jìn)一步的研究證實(shí)，也是本課題今后研究的方向之一。

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