沈薔，章海敏，施旆旆，胡軍祥

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 臨安 311300）

玻璃化凍存對(duì)鯽魚卵細(xì)胞活性的影響

沈薔1，章海敏2，施旆旆1，胡軍祥2

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 林業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 臨安 311300；2.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 臨安 311300）

以鯽魚Carassius cuvieri未成熟的卵細(xì)胞為材料，研究了玻璃化凍存對(duì)鯽魚卵細(xì)胞的存活率及琥珀酸脫氫酶（SDH）活性的影響。結(jié)果表明：鯽魚卵細(xì)胞存活率在1～6 d下降明顯，6～8 d下降趨勢(shì)減弱，保持相對(duì)穩(wěn)定；琥珀酸脫氫酶活性呈顯著下降（P＜0.05）。玻璃化凍存液VSd組的凍存效果最好，其組分為180.0 g·L-11,2-丙二醇，110.0 g·L-1甲醇，0.1 mol·L-1海藻糖和40.0 g·L-1聚乙二醇。該玻璃化凍存液配方及方法在一定時(shí)間內(nèi)保存鯽魚未成熟卵細(xì)胞具有一定的應(yīng)用價(jià)值。圖4表2參22

動(dòng)物學(xué)；卵細(xì)胞；玻璃化凍存；玻璃化凍存液；存活率；琥珀酸脫氫酶（SDH）

玻璃化冷凍保存技術(shù)對(duì)魚類卵細(xì)胞的冷凍保存仍少見報(bào)道［1］。魚類的卵與一般細(xì)胞相比由于其體積大，相對(duì)比表面積小，含水率高，卵黃多等特點(diǎn)，限制了水分的滲出和抗凍劑滲入的速率。同時(shí)由于卵細(xì)胞具有高度的冷凍敏感性,容易造成冷凍損傷［2］。因此，探索適合于魚類卵細(xì)胞玻璃化冷凍保存技術(shù)，可為建立魚卵細(xì)胞庫(kù)提供技術(shù)與方法。本研究以鯽魚Carassius cuvieri未成熟的卵細(xì)胞為材料，對(duì)幾種毒性相對(duì)較低的滲透性抗凍劑的混合比例、玻璃化凍存對(duì)卵細(xì)胞存活率和琥珀酸脫氫酶（SDH）活性的影響進(jìn)行研究，以期為魚類卵細(xì)胞冷凍保存及損傷機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 鯽魚卵細(xì)胞的分離

選取性發(fā)育成熟的雌性鯽魚，用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇消毒，剪開腹部，取出兩側(cè)卵巢，置于D-hank’s液中。去除卵巢周圍的脂肪、結(jié)締組織及血塊等，撕開卵巢外膜并輕輕抖動(dòng)，用移液管輕輕吹打卵細(xì)胞5～10次至卵細(xì)胞單個(gè)分離。用D-hank’s溶液洗滌分離好的卵細(xì)胞2～3次［6］。

1.2 鯽魚卵細(xì)胞玻璃化溶液的配方設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)根據(jù)本課題組已成功凍存胚腦［4］、軟骨［5］等細(xì)胞的玻璃化溶液為基礎(chǔ)進(jìn)行改良。根據(jù)Plachinta等［6］、Zhang等［7］的研究結(jié)果，選用了對(duì)魚卵細(xì)胞毒性較低的1,2-丙二醇（PG）為主因子，輔以二甲基亞砜、甲醇、乙酰胺、蔗糖、海藻糖和聚乙二醇（平均分子量為4 000）等保護(hù)劑成分，再根據(jù)章龍珍等［8］和Zhang等［9］研究的耐受極限濃度，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定各組分的濃度范圍，然后進(jìn)行均勻設(shè)計(jì)，以是否含有海藻糖分成2組，共11種玻璃化溶液（表1～2），并根據(jù)Guan等［1］、章龍珍等［10］和田永勝等［11］的方法進(jìn)行玻璃化形成能力檢測(cè)，各組均能形成玻璃化。

表1 不含海藻糖的玻璃化溶液Table 1 Vitrification solutions without trehalose

表2 含海藻糖的玻璃化溶液Table 2 Vitrification solutions with trehalose

1.3 鯽魚卵細(xì)胞的玻璃化凍存程序

1.3.1 冷凍前的預(yù)平衡 將鯽魚卵細(xì)胞在0℃下進(jìn)行預(yù)平衡，采用三步平衡法：取100粒卵在1∶2稀釋的玻璃化液中平衡10 min，再在1∶1稀釋的玻璃化液中，平衡10 min后，取出轉(zhuǎn)入玻璃化液中平衡10 min，分裝入2.0 mL冷凍保存管中。

1.3.2 凍存 將上述冷凍管進(jìn)行標(biāo)記，直接投入到液氮（-196℃）中保存，凍存時(shí)間為：1，2，3，4，6和8 d。

1.3.3 復(fù)溫 從液氮中取出的冷凍管直接投入37℃的水浴中，充分振蕩使其快速?gòu)?fù)溫融化。

1.3.4 凍存液的洗脫 復(fù)溫融化后樣品迅速轉(zhuǎn)移到無菌離心管中。然后加入2倍體積的1.5 mol·L-1的蔗糖溶液，搖勻、靜置10 min，去上清液，再加入2倍體積的0.5 mol·L-1的蔗糖溶液重懸浮，然后靜置10 min，去上清液，加2倍體積的D-hank’s液重懸浮3次，去上清，加D-hank’s液搖勻備用。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 卵細(xì)胞存活率檢測(cè) 以臺(tái)盼藍(lán)拒染法檢測(cè)細(xì)胞存活率。計(jì)算公式為：細(xì)胞的存活率=（洗脫后的活細(xì)胞數(shù)/洗脫后的細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.4.2 MTT［3-（4，5）-dimethylthiahiazo（-z-y1）-2,5-diphenytetrazoliumromide］法檢測(cè)卵細(xì)胞琥珀酸脫氫酶（SDH）活性根據(jù)Mosmann的方法［12］稍加改進(jìn)，取凍存后洗脫的卵細(xì)胞于16孔無菌培養(yǎng)板中，加入1.0 mL培養(yǎng)液，再加入5.0 g·L-1的MTT溶液100 μL，放入37℃的50.0 mL·L-1二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育240 min，使MTT充分被還原，然后加入1.0 mL二甲基亞砜，搖勻30 min，使結(jié)晶物充分溶解后，在酶標(biāo)儀上測(cè)定570 nm處的吸光值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以上方法均隨機(jī)選取多個(gè)樣本，每個(gè)樣本多次重復(fù)。采用Excel和SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行分析，比較結(jié)果用字母a，b，c，d，e，f在圖中標(biāo)記，圖中在表示標(biāo)準(zhǔn)誤差的誤差線上方的字母相同表示差異不顯著（P＞0.05），字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 玻璃化凍存對(duì)鯽魚卵細(xì)胞存活率的影響

圖1所示為不含海藻糖組（VS1～VS6）玻璃化凍存液對(duì)鯽魚卵細(xì)胞存活率的影響。經(jīng)1～8 d的凍存后，各組卵細(xì)胞的存活率都隨凍存天數(shù)的延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)，6 d后下降趨勢(shì)減弱。VS1組和VS3組在1～2及3～6 d的存活率下降幅度較大（P＜0.05），在2～3 d和6～8 d之間變化不明顯（P＞0.05）；VS2組的存活率在1，3，4和6 d之間存在顯著性差異（P＜0.05）；VS4組的存活率在1，2，4和6 d之間存在顯著性差異（P＜0.05）；VS5組的存活率除在2～3 d之間變化不明顯外，在其他各天數(shù)之間都有顯著變化（P＜0.05）；VS6組各天數(shù)之間均存在顯著性差異（P＜0.05）。比較各組存活率，VS4組的卵細(xì)胞存活率最高，經(jīng)過1，2，3，4，6和8 d凍存后，卵細(xì)胞的存活率分別為65.49%±0.49%，57.97%±1.68%，56.79%±0.40%，54.89%±1.26%，41.82%±1.87%，39.96%±0.82%。

圖1 不同玻璃化溶液（VS1～VS6組）對(duì)鯽魚卵細(xì)胞存活率的影響（n=6）Figure 1 Changes of survival rate of VS1-VS6（n=6）

圖2所示為海藻糖組（VSa～VSe）玻璃化凍存液在經(jīng)過1～8 d的凍存后，對(duì)卵細(xì)胞存活率的影響。各組卵細(xì)胞的存活率都隨凍存天數(shù)的延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)，6 d后下降趨勢(shì)減弱。VSa組和VSc組的存活率在1，2，4和6 d之間存在顯著性差異（P＜0.05）；VSb組的存活率除在3～4 d之間下降不明顯（P＞0.05）外，在其他各天數(shù)之間都有顯著性下降（P＜0.05）；VSd組的存活率在1，3，4和6 d之間存在顯著性差異（P＜0.05）；VSe組的存活率在前6 d下降較快（P＜0.05），在6～8 d之間變化不明顯（P＞0.05）。在各組玻璃化液中，VSd組的卵細(xì)胞存活率要高于其他組，經(jīng)過1，2，3，4，6和8 d凍存后，卵細(xì)胞的存活率分別為64.40%±2.12%，60.24%±3.36%，57.20%±3.55%，51.90%±1.14%，40.29%±3.14%，37.98%±1.13%。

2.2 玻璃化凍存對(duì)鯽魚卵細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶（SDH）活性的影響

圖2 不同玻璃化溶液（VSa～VSe組）對(duì)鯽魚卵細(xì)胞存活率的影響（n=5）Figure 2 Changes of survival rate of VSa-VSe（n=5）

圖3所示為不含海藻糖組（VS1～VS6）玻璃化凍存液在經(jīng)過不同時(shí)間的凍存后，對(duì)鯽魚卵細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶（SDH）活性的影響。隨著凍存天數(shù)的延長(zhǎng)，凍存后的細(xì)胞內(nèi)SDH活性逐漸降低。VS1組的SDH活性在前6 d下降幅度較大（P＜0.05），在6～8 d變化不明顯（P＞0.05）；VS2組的SDH活性在1，2，4和6 d之間存在顯著性差異（P＜0.05）；VS3，VS4和VS5的細(xì)胞經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，其吸光值在2～3 d之間無顯著性變化（P＞0.05）。VS6組各天數(shù)之間均存在顯著下降（P＜0.05）。從整體上來看，在各組玻璃化液中，VS4組凍存后卵細(xì)胞內(nèi)的SDH活性要明顯高于其他組，在經(jīng)過1，2，3，4，6和8 d凍存后，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的吸光值分別為0.581±0.010，0.469±0.006，0.462±0.007，0.373±0.006，0.291± 0.008，0.272±0.011。

圖3 不同玻璃化溶液（VS1～VS6組）對(duì)鯽魚卵細(xì)胞SDH活性的影響（n=6）Figure 3 SDH activity of eggs in VS1-VS6（n=6）

圖4為海藻糖組（VSa～VSe）玻璃化凍存液對(duì)卵細(xì)胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶（SDH）活性的影響。在凍存過程中，卵細(xì)胞內(nèi)SDH活性逐漸降低。VSa組的SDH活性在前6 d下降幅度較大（P＜0.05），在6～8 d變化不明顯（P＞0.05）；VSb和VSc組各天數(shù)之間均存在顯著性下降（P＜0.05）；VSd組的SDH活性在1，2，4和6 d之間存在顯著性差異（P＜0.05）；VSe的細(xì)胞經(jīng)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，其吸光值在2～4 d之間無顯著性差別（P＞0.05）。比較各組玻璃化凍存液，VSd組凍存后鯽魚卵細(xì)胞內(nèi)的SDH活性要明顯高于其他組，在經(jīng)過1，2，3，4，6和8 d凍存后，MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的吸光值分別為0.585±0.007，0.490± 0.009，0.473±0.008，0.423±0.014，0.305±0.016，0.290±0.016。

圖4 不同玻璃化溶液（VSa～VSe組）對(duì)鯽魚卵細(xì)胞SDH活性的影響（n=5）Figure 4 SDH activity of eggs in VSa-VSe（n=5）

3 討論

玻璃化溶液的組分和冷凍保護(hù)劑的配比是凍存獲得成功的關(guān)鍵，玻璃化凍存液應(yīng)具備低毒、高滲和高玻璃化形成能力等特征。大多數(shù)玻璃化凍存液在高濃度使用時(shí)，對(duì)卵細(xì)胞有較大毒性，容易造成細(xì)胞滲透損傷［13］。冷凍保護(hù)劑的混合使用可能使單獨(dú)使用時(shí)的毒性得到部分中和。本研究根據(jù)Guan等［1］、Plachinta等［6］、Zhang等［7］和Zhang等［14］的研究結(jié)果，結(jié)合本課題組已有的研究成果［4-5］，選用1,2-丙二醇、二甲基亞砜、甲醇和乙酰胺等為滲透性保護(hù)劑，海藻糖、蔗糖和聚乙二醇等為非滲透性保護(hù)劑，配制成玻璃化溶液。1,2-丙二醇具有較低毒性和較強(qiáng)玻璃化形成能力。二甲基亞砜在大量實(shí)驗(yàn)中被證明具有易玻璃化和高滲透性等特點(diǎn)。乙酰胺是一種具有較高滲透性及毒性中和能力的保護(hù)劑。甲醇已被證明在斑馬魚Danio rerio的胚胎以及幾種魚類精子的冷凍保存具有明顯效果［6］。海藻糖對(duì)生物體或生物大分子具有抗脫水、抗冷凍、抗高滲等非特異性保護(hù)作用。結(jié)果表明：不含海藻糖組的玻璃化溶液VS4和海藻糖組的VSd凍存鯽魚卵細(xì)胞后的存活率較高，其組分分別為160.0 g·L-11,2-丙二醇，100.0 g·L-1二甲基亞砜，150.0 g·L-1甲醇，120.0 g·L-1乙酰胺，0.6 mol·L-1蔗糖，30.0 g·L-1聚乙二醇以及180.0 g·L-11,2-丙二醇，110.0 g·L-1甲醇，0.1 mol·L-1海藻糖，40.0 g·L-1聚乙二醇。且發(fā)現(xiàn)在海藻糖的濃度明顯低于蔗糖時(shí)，2組的存活率并沒有顯著差異。海藻糖可能比蔗糖更適合作為玻璃化冷凍保護(hù)劑。

卵細(xì)胞膜對(duì)冷凍非常敏感，容易在冷凍過程中損傷［15］，影響卵細(xì)胞的進(jìn)一步發(fā)育［16］及受精時(shí)精卵質(zhì)膜的融合。當(dāng)細(xì)胞處于過冷狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞膜上從液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槟z態(tài)，同時(shí)，細(xì)胞膜的不等收縮會(huì)導(dǎo)致機(jī)械性的膜破裂及膜表面結(jié)構(gòu)的改變，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［17-18］。本研究以臺(tái)盼藍(lán)拒染法來檢測(cè)玻璃化凍存后鯽魚卵細(xì)胞的存活率，發(fā)現(xiàn)隨著凍存天數(shù)的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率成下降趨勢(shì)，在6 d后基本達(dá)到穩(wěn)定。我們認(rèn)為玻璃化冷凍保存過程中凍存液濃度變化以及冰晶形成等都會(huì)對(duì)膜造成損傷，加入混合冷凍保護(hù)劑可以減輕這種損傷。

線粒體是卵細(xì)胞中最豐富的細(xì)胞器之一，數(shù)量巨大［19］，其主要功能是為卵細(xì)胞的成熟、受精及卵裂提供能量。線粒體對(duì)環(huán)境因素的作用非常敏感,許多環(huán)境因素的影響都能迅速引起線粒體發(fā)生變化［20］。琥珀酸脫氫酶（SDH）位于線粒體內(nèi)膜上，它參與線粒體內(nèi)多種與細(xì)胞生命活動(dòng)相關(guān)的反應(yīng)，如呼吸鏈的電子傳遞、三磷酸腺苷（ATP）的合成等［21］。因此，SDH活性檢測(cè)對(duì)評(píng)價(jià)冷凍前后線粒體功能具有重要意義［22］。卵細(xì)胞經(jīng)玻璃化凍存后，SDH活性顯著下降。可能是細(xì)胞在冷凍與解凍后，線粒體部分損傷，使線粒體內(nèi)的酶分布發(fā)生改變，甚至引起酶的釋放。這些酶游離出來進(jìn)入基質(zhì)，影響了酶的穩(wěn)定性和活性；也有可能是冷凍保護(hù)劑的高毒性引起酶復(fù)合蛋白體解聚，造成酶系結(jié)構(gòu)和功能的變化。

4 結(jié)論

從本研究結(jié)果分析，隨著凍存天數(shù)的延長(zhǎng)，鯽魚卵細(xì)胞的存活率下降較為明顯，但6 d后，存活率基本趨于穩(wěn)定；而鯽魚卵細(xì)胞的琥珀酸脫氫酶（SDH）活性則持續(xù)降低。玻璃化凍存液VSd組的配方及玻璃化凍存方法對(duì)保存魚鯽魚卵細(xì)胞有一定效果，但有待進(jìn)一步研究和改進(jìn)。

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Effects of vitrification in crucian carp（Carassius cuvieri）oocytes

SHEN Qiang1，ZHANG Haimin2，SHI Peipei1，HU Junxiang2
（1.School of Forestry and Biotechnology，Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China；2.School of Animal Science and Technology，Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，Zhejiang，China）

The objectives were to analyze the effects of vitrification on the survival rate and succinate dehydrogenase（SDH）activity with immature oocytes in crucian carp（Carassius cuvieri）.Results showed that the survival rate decreased significantly within 6 d after vitrification（P＞0.05），and SDH activity continued to decrease（P＜0.05）.Glycol-based vitrification solutions（180.0 g·L-1propylene glycol，110.0 g·L-1methanol, 0.1 mol·L-1trehalose and 40.0 g·L-1polyethylene glycol）were selected for vitrification due to survival rates and SDH activity.This indicated that with this vitrification solution and method，cryopreservation for immature oocytes of crucian carp was practical.［Ch，4 fig.2 tab.22 ref.］

zoology；oocytes；vitrification solution；survival rate；succinate dehydrogenase（SDH）

S965.117；Q959.46+8

A

2095-0756（2014）01-0083-06

10.11833/j.issn.2095-0756.2014.01.013

2013-03-04；

2013-04-27

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY13C110001）

沈薔，從事動(dòng)物生理和低溫生物學(xué)等研究。E-mail：shen.qiang.105@163.com。通信作者：胡軍祥，教授，博士，從事動(dòng)物生理和低溫生物學(xué)等研究。E-mail：hjxy060222@163.com