UPLC-MS/MS檢測降血脂類保健食品中違法添加物

郝剛 顧炳仁

（蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇蘇州 215104）

UPLC-MS/MS檢測降血脂類保健食品中違法添加物

郝剛 顧炳仁

（蘇州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇蘇州 215104）

目的：建立專屬、靈敏的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）用于快速定性定量檢測降血脂類保健食品中3種違法添加化學(xué)成分。方法：供試品經(jīng)甲醇提取后，采用UPLC-MS/MS，以BEH-C18為分析柱，流動(dòng)相采用含20 mmol/L乙酸銨的水溶液和甲醇進(jìn)行等度洗脫，采用電噴霧電離、子離子掃描（Daughter Scan）及多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式對保健食品中違法添加的煙酸、辛伐他汀、洛伐他汀3種化學(xué)成分進(jìn)行快速定性定量檢測。結(jié)果：所建立方法可在1 min內(nèi)快速定性定量檢測保健食品中3種違法添加化學(xué)藥物，且線性關(guān)系良好，平均加樣回收率在95.4%～98.8%，方法檢出限為0.5～12.5 μg/g。結(jié)論：該方法快速、靈敏、專屬性強(qiáng)，適用于降血脂類保健食品中違法添加化學(xué)藥物的快速定性定量檢測。

超高效液相-串聯(lián)質(zhì)譜法；多重反應(yīng)監(jiān)測；降血脂類保健食品；違法添加物

WORDSUPLC-MS/MS；MRM；Lipid Lowering Health Foods；Illegal Additives

近年來，伴隨高血脂發(fā)病率的逐年上升，降血脂類中成藥和保健食品等健康產(chǎn)品的市場銷量不斷上升[1]。一些不法企業(yè)為牟取暴利，在產(chǎn)品中添加具有降血脂功效的化學(xué)治療藥物，不僅嚴(yán)重影響了降血脂類健康產(chǎn)品的行業(yè)發(fā)展，也給廣大人民的飲食用藥安全帶了嚴(yán)重危害[2]。原國家食品藥品監(jiān)督管理局于2010年頒布了煙酸、辛伐他汀、洛伐他汀等3種輔助降血脂類保健食品違法添加藥物的檢測方法，但該方法檢測時(shí)間長（進(jìn)樣時(shí)間為36 min），且靈敏度低[3]。本實(shí)驗(yàn)基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS），采用多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式，建立了同時(shí)定性、定量檢測降煙酸、辛伐他汀、洛伐他等違法添加藥物的分析方法，為降血脂類保健食品的安全監(jiān)控提供可靠的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 儀器

ACQUITY UPLC Xevo TQ-S三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國Waters公司）；電噴霧離子源（ESI），Masslynx 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（Waters）；Thermo低溫離心機(jī)；KQ-300DA型數(shù)控型超聲波清洗器；MILLIPORE純水儀。

1.2 樣品與試劑

煙酸對照品（批號(hào)：201102，含量99.9%）、辛伐他汀對照品（批號(hào)：100601-201003，含量99.0%）、洛伐他汀對照品（批號(hào)：100600-201003，含量99.4%）均購于中國食品藥品檢定研究院；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為色譜純。實(shí)驗(yàn)所用樣品均為當(dāng)?shù)厥称匪幤繁O(jiān)督管理局抽樣樣品。

1.3 色譜條件

色譜柱：BEH-C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：A（含20 mmol/L乙酸銨的水溶液）：B（甲醇）=20:80（v/v），流速0.3 mL/min。色譜柱溫度：25℃；進(jìn)樣盤溫度：4℃；進(jìn)樣量：1 μL。

（7）Marriage,Divorce and Quasi-rents:Or,I Gave Him the Best Years of My Life(結(jié)婚、離婚與準(zhǔn)用；或“青春年華付與君”)

1.4 質(zhì)譜條件

ESI；正離子掃描；毛細(xì)管電壓4.0 kV；脫溶劑氣溫度：350℃；脫溶劑氣體流量：800 L/h；錐孔氣流量：150 L/h；碰撞氣體為氬氣；子離子掃描及MRM模式同時(shí)監(jiān)測。

1.5 對照品溶液

分別精密稱取煙酸約50 mg，辛伐他汀、洛伐他汀約10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，混勻，作為煙酸（500 μg/mL）、辛伐他?。?00 μg/mL）、洛伐他?。?00 μg/mL）對照品儲(chǔ)備液。將上述3種對照品儲(chǔ)備液各量取10 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，作為混合對照品儲(chǔ)備液。

1.6 樣品制備

樣品研細(xì)后，精密稱取細(xì)粉1.0 g置于50 mL量瓶中，加甲醇約20 mL，超聲15 min，放冷至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，13 000 r/m離心10 min，取上清液稀釋500倍，13 000 r/m離心10 min，0.22 μm濾膜過濾，取上清液1 μL進(jìn)樣分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

分別將3種對照品儲(chǔ)備液用甲醇稀釋成500 ng/mL的對照溶液，選用ESI（＋）離子化模式，通過直接進(jìn)樣法，進(jìn)行質(zhì)譜條件優(yōu)化。首先，采用一級(jí)質(zhì)譜掃描方式得到各化合物準(zhǔn)分子離子峰，在確定準(zhǔn)分子離子的基礎(chǔ)上，進(jìn)行錐孔電壓的優(yōu)化，得到各化合物的最佳錐孔電壓。再通過子離子掃描模式，對各種化合物的分子離子進(jìn)行二級(jí)碎片離子掃描，每種化合物選擇2個(gè)特征碎片離子作為檢測離子，用于化合物定性判斷的依據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。各化合物的分子離子及特征碎片離子分別為：煙酸（m/z）：124＞106，80；辛伐他?。╩/z）：419＞285,199；洛伐他?。╩/z）：405＞285，199。

實(shí)驗(yàn)中同時(shí)確定各化合物的最佳碰撞能量，并采用MRM掃描模式對各化合物的檢測離子進(jìn)行掃描，其中響應(yīng)較高的離子對作為定量離子對。各化合物質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果如表1所示。

2.2 方法專屬性

精密量取煙酸、辛伐他汀、洛伐他汀對照品儲(chǔ)備液各1 mL至100 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容，作為混合對照品溶液，取1 μL進(jìn)樣分析，MRM離子流色譜圖如圖2（A）所示，煙酸、洛伐他汀、辛伐他汀保留時(shí)間分別為0.44，0.81，0.89 min。

取空白樣品（經(jīng)檢測不含違法添加成分的降血脂類保健食品），按“1.6樣品制備”方法處理后進(jìn)樣分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2（B）所示，空白生物樣品MRM離子流色譜圖在0～2 min內(nèi)無干擾。

圖1 子離子質(zhì)譜

表1 MRM分析的質(zhì)譜條件

取空白樣品溶液，加入1 mL混合對照品溶液，再按“1.6樣品制備”方法處理后進(jìn)樣分析，MRM離子流色譜圖如圖2（C）所示，空白樣品對3種化合物的保留時(shí)間無影響，所建方法專屬性良好。

2.3 線性范圍

精密量取煙酸、辛伐他汀、洛伐他汀對照品儲(chǔ)備液各1 mL至50 mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容，作為混合對照品溶液，再用甲醇逐級(jí)稀釋成不同濃度的混合對照品系列溶液。其中，煙酸濃度為：1 000，500，200，100，50，10，5 ng/mL；辛伐他汀與洛伐他汀的濃度為：200，100，40，20，10，2，1 ng/mL，取系列溶液中不同濃度混合對照品溶液1 μL進(jìn)樣分析，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），各對照品濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果如表2所示，煙酸在5.0～1 000.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，辛伐他汀與洛伐他汀在1.0～200.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

圖2 MRM離子流色譜

表2 線性范圍實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 檢出限

分別取3種化合物的對照品儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋到一定濃度，以信噪比（S/N）大于3為儀器檢出限，結(jié)果如圖3所示，煙酸、辛伐他汀、洛伐他汀的儀器檢出限分別為：0.5，0.05和0.02 ng/mL。

根據(jù)儀器檢出限及“1.6樣品制備”項(xiàng)的稀釋倍數(shù)，空白樣品中加入對照品溶液，經(jīng)處理后進(jìn)樣分析，以S/N等于3，測得方法檢出限分別為：煙酸12.5 μg/g，洛伐他汀1.25 μg/g，辛伐他汀0.5 μg/g。

圖3 煙酸(A)、洛伐他汀(B)、辛伐他汀(C)的檢出限

2.5 精密度試驗(yàn)

取2.3項(xiàng)下的混合對照品溶液（煙酸：50 ng/mL；辛伐他汀、洛伐他?。?0 ng/mL），連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算3種化合物峰面積的RSD分別為：煙酸：1.91%；辛伐他?。?.23%；洛伐他?。?.70%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 加樣回收率

分別精密吸取混合對照品儲(chǔ)備液8，10，12 mL各3份，共9份，分別置于50 mL量瓶中，每個(gè)量瓶精密加入經(jīng)測定不含違法添加藥物的保健品試樣處理液20 mL，按“1.6樣品制備”方法處理后進(jìn)樣分析，將結(jié)果代入回歸方程，計(jì)算回收率，3種化學(xué)成分的平均加樣回收率分別為：煙酸96.9%，辛伐他汀98.8%，洛伐他汀95.4%。

2.7 樣品測定結(jié)果

按1.6項(xiàng)下對20批降血脂類保健食品進(jìn)行樣品前處理，以所建液質(zhì)聯(lián)用方法對樣品進(jìn)行定性、定量分析，其中2批供試品的子離子掃描圖與煙酸對照品的特征離子對（m/z 124→106和m/z 124→80）一致，通過MRM質(zhì)譜圖計(jì)算煙酸含量分別為89.2 μg/g和125.4 μg/g，其余批次樣品均未檢出煙酸、辛伐他汀和洛伐他汀。此外，運(yùn)用國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的標(biāo)準(zhǔn)方法對上述批次樣品檢測[3]，其陽性檢出結(jié)果與本方法一致。

3 討論

高血脂癥作為一種高發(fā)的現(xiàn)代病，可引發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、胰腺炎等一些嚴(yán)重危害人體健康的疾病。除了降血脂藥物，以調(diào)節(jié)血脂為功效的保健食品的國內(nèi)市場銷量不斷上升。然而，一些生產(chǎn)商受利益驅(qū)動(dòng)，在該類保健品中人為摻雜化學(xué)藥物，嚴(yán)重威脅了服用者的生命健康[4-5]。如長期過量服用煙酸可導(dǎo)致心律失常、肝功能損傷[6]；而他汀類藥物除一般的消化系統(tǒng)反應(yīng)外，還能誘發(fā)橫紋肌溶解癥，重者可導(dǎo)致急性腎衰[7-8]。由于這些違禁藥物具有添加量少，隱蔽性強(qiáng)等特點(diǎn)，開發(fā)靈敏度高、專屬性強(qiáng)的快速定性、定量分析方法已成為當(dāng)務(wù)之急。

本實(shí)驗(yàn)針對國家食品藥品監(jiān)督管理總局規(guī)定的煙酸、辛伐他汀、洛伐他汀等3種輔助降血脂類保健品違法添加藥物，基于UPLC的超高分辨能力、超高分析速度，及MS/MS提供的結(jié)構(gòu)信息，開發(fā)了同時(shí)定性、定量檢測上述3種非法添加藥物的分析方法。通過子離子掃描和MRM掃描模式，針對每個(gè)化合物選取兩個(gè)特征碎片離子作為定性依據(jù)，同時(shí)選擇其中響應(yīng)較高的反應(yīng)離子對作為定量離子對，從而實(shí)現(xiàn)定性定量同時(shí)分析。并將該方法應(yīng)用于20批降血脂類保健品非法添加的檢測，檢驗(yàn)結(jié)果與國家食品藥品監(jiān)督管理總局頒布的標(biāo)準(zhǔn)方法一致，但本方法大大縮短了分析所需時(shí)間，并同時(shí)計(jì)算出違法添加藥物的含量，改進(jìn)了現(xiàn)行的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，提高了降血脂類保健食品非法添加的檢驗(yàn)效率，為該類保健食品的安全監(jiān)控提供了可靠的技術(shù)保障。

[1]白鴻.保健食品功效成分檢測方法[M].北京：中國中醫(yī)藥出版社，2011：66.

[2]謝志潔.健康產(chǎn)品中非法添加化學(xué)成分快速篩查方法理論與實(shí)踐[M].廣東：華南理工大學(xué)出版社，2011：10-16.

[3]國家食品藥品監(jiān)督管理局.輔助降血脂類保健食品違法添加藥物的檢測方法[S].國食藥監(jiān)辦許[2010]114號(hào).2010-04-27.

[4]李丹，文紅梅，崔福春，等.LC-MS/MS法快速測定中成藥、保健食品中非法添加的36種化學(xué)成分[J].藥物分析雜志，2010，30（8）：135-140.

[5]陳海濱，吳春敏，胡敏，等.LC-MS/MS檢測降壓類中藥制劑中非法添加的9種化學(xué)藥物[J].海峽藥學(xué)，2012，24（9）：51-54.

[6]Kirkland JB.Niacin requirements for genomic stability[J].Mutat Res，2012，733（1-2）：14-20.

[7]Toth PP.An update on the benefits and risks of rosuvastatin therapy[J].Postqrad Med，2014，126（2）：7-17.

[8]Robinson M，Gunning K，Pippitt K，et al.Team-based approach to addressing simvastatin safety concerns[J].J Am Pharm Assoc，2013，53（5）：539-544.

Rapid Identification of Illegal Additives in Lipid Lowering Health Foods by UPLC-MS/MS

Hao Gang，Gu Bingren（Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215104，China）

Objective：To develop a specific and sensitive method by UPLC-MS/MS for the qualitative and quantitative detection of 3 illegal additives in lipid lowering health foods.Methods：UPLC-MS/MS was adopted to test the samples extracted with methanol.BEH-C18was used as the analytical column with 20 mmol/L ammonium acetate aqueous solution and methanol as the mobile phase for isocratic elution.The qualitative and quantitative detections of 3 chemical components including nicotinic acid，simvastatin and lovastatin were conducted UPLC-MS/MS in the mode of electrospray ionization (ESI)，the daughter ion scan and multiple reaction monitoring（MRM）.Results：The established method can identify within 1 min the 3 illegal additives in health foods qualitatively and quantitatively.The calibration curves showed a good linear relationship for each component.The determination limit was at 0.5～12.5 μg/g，and the average recovery rate was 95.4%～98.8%.Conclusion：The method was proved to be specific，rapid and sensitive，which can be used to identify 3 illegal additives in lipid lowering health foods.

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.07.005

2014-06-27）

蘇州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目科技支撐計(jì)劃（SS201220）

郝剛，男，博士，主管藥師。研究方向：食品藥品質(zhì)量安全監(jiān)控。E-mail:haogang531@163.com

顧炳仁，男，主任藥師。研究方向：食品藥品質(zhì)量安全監(jiān)控。通訊作者E-mail:gubingren@163.com