王心靜，王仲元

結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷新技術(shù)的臨床應(yīng)用

王心靜，王仲元

結(jié)核分枝桿菌全基因組測序的完成，使得對結(jié)核分枝桿菌的認(rèn)識進(jìn)入分子水平，分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展為診斷新方法提供了技術(shù)平臺，結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)得到快速發(fā)展。為幫助臨床醫(yī)生了解現(xiàn)有新技術(shù)，以便更好地應(yīng)用，本文系統(tǒng)介紹現(xiàn)有結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷新技術(shù)的原理和臨床應(yīng)用特點(diǎn)。

結(jié)核分枝桿菌；基因擴(kuò)增；診斷

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis,Mtb）感染造成的慢性傳染病，1993年WHO宣布全球結(jié)核病控制處于緊急狀態(tài)[1]，2006年提出全球結(jié)核病控制目標(biāo)是到2015年結(jié)核病患病率和病死率較1990年降低一半[2]。2013年報(bào)告新發(fā)結(jié)核病例數(shù)減少，但患病率下降緩慢，耐多藥結(jié)核?。╩ultidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB）的診治遠(yuǎn)未達(dá)到目標(biāo)[3]。結(jié)核病控制效果不佳原因很多，AIDS、糖尿病和自體免疫性疾病等影響機(jī)體免疫功能的疾病發(fā)病率上升，以及耐多藥Mtb尤其是廣泛耐藥Mtb感染率上升是重要因素；另一個十分重要的原因是結(jié)核病傳統(tǒng)的抗酸桿菌涂片及培養(yǎng)等技術(shù)靈敏度低、耗時長，造成結(jié)核病的診斷延遲或誤診。

在WHO的推動下，結(jié)核病的實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)時效性和準(zhǔn)確率上得到了顯著提高。為幫助臨床醫(yī)生了解結(jié)核病檢測技術(shù)，以便更好地應(yīng)用，本文系統(tǒng)介紹現(xiàn)有結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷新技術(shù)的原理和應(yīng)用。

1 核酸擴(kuò)增技術(shù)（nucleic acid am plification tests, NAAT）

Mtb H37Rv株的全基因組測序工作的完成，使得人們能夠從基因水平上認(rèn)識Mtb[4]。近些年，針對Mtb耐藥和遺傳變異等相關(guān)基因的序列和功能的研究取得了突破性進(jìn)展，如發(fā)現(xiàn)分枝桿菌特異性保守序列IS6110、16S rRNA基因、hsp65基因和rpoB基因等[5]，為開發(fā)新的診斷技術(shù)提供了理論基礎(chǔ)。

NAAT的快速性和高靈敏度是其用于結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷的最大優(yōu)勢。近幾年NAAT的快速發(fā)展為結(jié)核病診斷提供了技術(shù)基礎(chǔ)，Mtb核酸檢測也成為結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)發(fā)展的最大亮點(diǎn)。

1.1 技術(shù)原理及相應(yīng)產(chǎn)品

1.1.1 實(shí)時熒光定量PCR此技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、可有效解決PCR污染問題以及自動化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用[6]。熒光定量PCR技術(shù)有以下2個需要了解的概念。Ct值：C代表Cycle，t代表threshold（閾值，臨界值）。Ct值的含義是每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。熔解曲線：PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后，逐漸升高溫度，隨著反應(yīng)中雙鏈DNA變性，熒光染料又回復(fù)到游離狀態(tài)導(dǎo)致熒光信號降低。用熒光信號改變的負(fù)一次導(dǎo)數(shù)與溫度作圖，形成熔解曲線，不同產(chǎn)物有自己的特征峰（熔解溫度，即DNA雙鏈解鏈50%的溫度），用這個特征峰可將特異性產(chǎn)物與其他產(chǎn)物區(qū)分開。

目前，臨床開展的Mtb核酸檢測多數(shù)是使用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)[7]，根據(jù)Ct值判斷樣本中是否存在Mtb特有DNA片斷，敏感性良好。但是由于死亡的Mtb DNA也能夠被檢測到，所以不能作為病情追蹤。

根據(jù)熔解曲線與標(biāo)準(zhǔn)曲線的對照，能夠準(zhǔn)確區(qū)分野生型、雜合突變型和純和突變型基因。此法不受突變位點(diǎn)和類型的局限，無需序列特異性探針，但不能測出基因突變的具體位置和類型。臨床上已有應(yīng)用此技術(shù)檢測Mtb耐藥的試劑盒[8-9]。

1.1.2 RNA恒溫?cái)U(kuò)增實(shí)時檢測（simultaneousamplification and testing,SAT）該技術(shù)是將新一代核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和實(shí)時熒光檢測技術(shù)相結(jié)合的一種新型核酸檢測技術(shù)。在同一溫度下，首先通過M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生靶標(biāo)核酸RNA的1個雙鏈DNA拷貝，然后利用T7RNA多聚酶從該DNA拷貝上產(chǎn)生多個RNA拷貝，每個RNA拷貝再從反轉(zhuǎn)錄開始進(jìn)入下一個擴(kuò)增循環(huán)；同時，帶有熒光標(biāo)記的探針和這些RNA拷貝特異結(jié)合，產(chǎn)生熒光。此實(shí)驗(yàn)檢測的底物是RNA，其擴(kuò)增效率、靈敏度和特異度高，反應(yīng)時間短，操作簡單，同時RNA容易降解，可減少污染。

將SAT技術(shù)應(yīng)用于Mtb檢測是國內(nèi)自主專利技術(shù)[10]。因?yàn)橹挥谢罹庞嘘栃詸z測結(jié)果，因此與DNA檢測相比，此檢測結(jié)果可作為區(qū)分死菌和活菌的依據(jù)，有利于用藥后的療效監(jiān)測。

1.1.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loopmediated isothermal amplification,LAMP）該技術(shù)于2000年由日本榮研公司開發(fā)，利用鏈置換型DNA聚合酶在恒溫下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，產(chǎn)生大量的擴(kuò)增產(chǎn)物即焦磷酸鎂白色沉淀，通過肉眼觀察白色沉淀的有無判斷靶基因是否存在，是一種適合現(xiàn)場和基層進(jìn)行快速檢測的方法。

應(yīng)用LAMP定性檢測臨床標(biāo)本中的Mtb DNA無需擴(kuò)增儀，肉眼就能觀察結(jié)果，整個過程只需要1h。2011年WHO專家組認(rèn)為LAMP是一項(xiàng)潛在的快速診斷結(jié)核病的技術(shù)。但是與痰涂片鏡檢相比，其特異性是個問題，較高的成本可能會制約臨床應(yīng)用[11]。

1.1.4 基因芯片技術(shù)基因芯片又稱DNA芯片（DNA chip）或DNA微陣列（DNAmicroarray），是將大量特定序列的探針分子密集、有序地固定于經(jīng)過處理的載體上，加入標(biāo)記的待測樣品，進(jìn)行多元雜交，通過雜交信號的強(qiáng)弱及分布，用特殊儀器來分析目的分子的有無，從而獲得樣品的遺傳信息?；蛐酒軌蜻M(jìn)行高通量篩選及檢測分析，解決了傳統(tǒng)核酸印記雜交技術(shù)操作復(fù)雜、檢測目的分子數(shù)量少等不足。

臨床上應(yīng)用我國有自主知識產(chǎn)權(quán)的Mtb耐藥檢測芯片及非Mtb菌種鑒定芯片，耐藥芯片可同時檢測利福平和異煙肼的耐藥情況，非Mtb菌種鑒定芯片可鑒定常見的17種非Mtb。這2種芯片檢測均可在6 h內(nèi)完成，但結(jié)果與樣本中菌量有一定的相關(guān)性，菌量過少或操作失誤容易出現(xiàn)無效檢測結(jié)果。

1.1.5 分子線性探針技術(shù)（line probe assay,LPA）此技術(shù)基于多重PCR原理，將PCR擴(kuò)增、反向雜交和膜顯色技術(shù)合為一體。首先通過使用引物擴(kuò)增目的片斷，擴(kuò)增產(chǎn)物后與膜上已固定的特異性探針雜交，雜交物通過生物素標(biāo)記的酶發(fā)生顯色反應(yīng)，由此判斷靶DNA特定基因的堿基突變。

GenoType MtbDR是德國Hain Lifescience的產(chǎn)品，利用LPA檢測是否存在Mtb DNA，同時檢測Mtb耐利福平和異煙肼基因來診斷MDR-TB，在2008年得到WHO的認(rèn)可[12]。推薦LPA用于涂片陽性的痰標(biāo)本和培養(yǎng)物中，以快速檢測利福平和異煙肼耐藥，但不推薦用于二線抗結(jié)核藥耐藥性檢測。此技術(shù)耗時約8 h，反應(yīng)相對容易被污染，對技術(shù)水平要求較高。

1.1.6 自動化核酸擴(kuò)增Xpert Mtb/RIF由美國Cepheid公司研發(fā)，是一項(xiàng)全自動分子診斷方法，集痰標(biāo)本處理、DNA提取、核酸擴(kuò)增、Mtb特異核酸檢測和利福平耐藥基因檢測于一體，是一種半巢式實(shí)時熒光定量PCR體外診斷技術(shù)，只需2 h即可同時實(shí)現(xiàn)Mtb定性和利福平耐藥的檢測。整個過程在封閉的腔室內(nèi)自動化完成，可在普通實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行。2010年12月，該技術(shù)被WHO譽(yù)為突破性結(jié)核病診斷方法而向全球推薦[13]。2013年5月，WHO推薦對結(jié)核病疑似患者首先使用Xpert Mtb/RIF檢驗(yàn)，尤其是疑似MDR-TB患者和合并HIV感染者，并建議在MDR-TB或HIV感染率低的地區(qū)，Xpert Mtb/RIF可用于涂片陰性病例的進(jìn)一步檢測[14]。

1.2 臨床應(yīng)用效率以上結(jié)核分子診斷產(chǎn)品部分已應(yīng)用于各國臨床檢驗(yàn)，因此應(yīng)用效率研究報(bào)告比較豐富，WHO亦對其推薦的產(chǎn)品做了詳細(xì)的報(bào)告分析。比較分析這些報(bào)告的樣本均是臨床患者痰標(biāo)本，考慮到每份痰標(biāo)本的異質(zhì)性，培養(yǎng)和核酸檢測如果不是來自同一份痰標(biāo)本，可能會有不同的結(jié)果。它們的比較標(biāo)準(zhǔn)均是培養(yǎng)陽性，其中部分是羅氏固體培養(yǎng)陽性，部分是液體培養(yǎng)陽性，而液體培養(yǎng)靈敏度比固體培養(yǎng)高。另外，檢測場所的級別不同造成環(huán)境條件和使用人員的技術(shù)水平差別，這些因素都將影響最后的結(jié)果，因此試驗(yàn)結(jié)論不盡相同。但基本共識是結(jié)核分子診斷產(chǎn)品所需時間少、診斷特異性高，可提高對涂片陰性患者的診斷靈敏度。表1～2為不同分子檢測的靈敏度和特異度。

應(yīng)用于Mtb檢測的核酸擴(kuò)增方法檢測快速、準(zhǔn)確率高、便捷，優(yōu)點(diǎn)很突出。但是臨床標(biāo)本成分復(fù)雜，可能存在PCR反應(yīng)的抑制因素，如某些血痰或干酪樣痰可能由于蛋白成分過高而造成檢測假陰性，這在臨床檢測中并不少見。耐藥基因的存在不是惟一的耐藥機(jī)制，Mtb katG和inhA基因突變占異煙肼耐藥菌株約80%，即使是靈敏度最高的耐利福平基因rpoB突變，也只能發(fā)現(xiàn)約95%的耐藥菌，臨床應(yīng)用時會發(fā)現(xiàn)耐藥表型和基因型不一致[21-22]。所以，核酸擴(kuò)增方法還不能完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)的抗酸桿菌涂片和培養(yǎng)方法。另外，目前國內(nèi)核酸擴(kuò)增方法的收費(fèi)、試劑或儀器價格比較高，在很大程度上影響了臨床應(yīng)用。

表2 不同核酸擴(kuò)增方法診斷M tb耐藥的靈敏度和特異度Table 2 Sensitivity and specificity of different diagnostic assays for detecting drug-resistant M tb

2 免疫學(xué)診斷

2.1 Mtb干擾素釋放試驗(yàn)Mtb核酸的RD-1區(qū)是卡介苗和大部分非Mtb缺失的部分，RD-1區(qū)表達(dá)的蛋白ESAT-6和CFP-10是Mtb特異的分泌蛋白，免疫原性強(qiáng)，被用作Mtb的特異性刺激原。多種Mtb特異性反應(yīng)性因子如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-2和干擾素γ誘導(dǎo)蛋白-10等被用做Mtb感染的潛在診斷指標(biāo)[23-25]。其中干擾素γ釋放試驗(yàn)（interferon-gamma release assay,IGRA）已被WHO宣布為Mtb潛伏感染的診斷試驗(yàn)，此試驗(yàn)有ELISA方法和ELISpot方法，這2種方法診斷潛伏感染效能無差別，用于診斷結(jié)核病時，ELISpot方法靈敏度更高，但也有研究認(rèn)為差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[26-27]。

近幾年對干擾素釋放試驗(yàn)在結(jié)核病診斷中的意義有較多研究，有研究顯示在結(jié)核病的治療過程中干擾素水平下降；也有截然相反的研究結(jié)果，即治療過程中干擾素水平上升，還有研究發(fā)現(xiàn)治療2個月后干擾素的下降水平與復(fù)發(fā)的可能性相關(guān)[28-29]。目前多數(shù)研究認(rèn)為干擾素釋放試驗(yàn)不適于評價治療反應(yīng)[30]。2011年10月WHO發(fā)表專家報(bào)告，指出IGRA不能準(zhǔn)確預(yù)測潛伏感染發(fā)展至活動性結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)，不應(yīng)作為活動性結(jié)核病的診斷指標(biāo)[31]。干擾素釋放試驗(yàn)在結(jié)核病和結(jié)核感染診斷上是否優(yōu)于結(jié)核菌素試驗(yàn)還有爭議，基本達(dá)成共識的是對卡介苗接種人群和非Mtb感染高發(fā)人群，干擾素釋放試驗(yàn)的特異度顯著高于結(jié)核菌素試驗(yàn)[30]。因此，對于結(jié)核病高發(fā)區(qū)，干擾素釋放試驗(yàn)的意義更在于其對陰性的排除診斷價值[32-33]。但要注意此試驗(yàn)的假陰性，尤其對于伴發(fā)其他免疫性或血液疾病的患者以及應(yīng)用糖皮質(zhì)激素治療超過1周的患者，陰性結(jié)果不能排除診斷。

2.2 結(jié)核抗體檢測結(jié)核抗體檢測已歷時多年，現(xiàn)有的抗體檢測主要是針對Mtb LAM、38kD和16kD抗原，已有報(bào)道的靈敏度和特異度比較差異較大。WHO明確提出現(xiàn)有結(jié)核抗體試驗(yàn)不能作為結(jié)核病和結(jié)核感染的診斷依據(jù)，希望新的具有診斷效能的抗原被發(fā)現(xiàn)，而試圖發(fā)現(xiàn)新的具有高診斷效能因子的腳步從未停歇[34]。

3 結(jié)語

分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展為結(jié)核病診斷技術(shù)的突破提供了可能，目前新出現(xiàn)的核酸擴(kuò)增方法和免疫學(xué)方法在診斷效能上確有提高，但由于其自身的限制和Mtb的特點(diǎn)，這些方法依舊不能替代傳統(tǒng)的Mtb涂片和培養(yǎng)方法，臨床應(yīng)用時應(yīng)清楚每一種診斷方法的意義和局限性，以利于臨床診斷和治療。

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（2014-07-29收稿 2014-08-15修回）

（責(zé)任編委 王永怡 本文編輯 陳玉琪）

Clinical application of the new laboratory diagnostic techniques of tuberculosis

WANG Xin-jing,WANG Zhong-yuan
Clinical Laboratory Department,Institute of Tuberculosis,309 Hospital of PLA,Beijing 100091,China

As whole-genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis(Mtb)makes it possible to understand Mtb at the molecular level,and the development ofmolecular biology and immunology provides a technology platform for the new diagnostic assays,there has been a rapid development in novel diagnostic assays designed to detect Mtb and its drug resistance.To help clinicians understand the existing novel assays for better application,the authors introduce the principles and features of the existing novel diagnostic techniques of tuberculosis.

Mycobacterium tuberculosis;gene amplification;diagnosis

R378.911

A

1007-8134(2014)06-0373-04

國家自然科學(xué)基金（81071319）

100091北京，解放軍第三〇九醫(yī)院結(jié)核病研究所臨床實(shí)驗(yàn)室（王心靜），全軍結(jié)核病研究所（王仲元）