郭小玉，苗云，楊海峰

（上海師范大學生命與環(huán)境科學學院化學系，上海 200234）

基于金納米-植酸膠束混合組裝的過氧化氫傳感器的電化學研究

郭小玉，苗云，楊海峰*

（上海師范大學生命與環(huán)境科學學院化學系，上海 200234）

采用混合組裝技術(shù)，利用植酸膠束（IP6m icelles）的磷酸酯鍵絡(luò)合辣根過氧化物酶（HRP）和金納米粒子（GNPs），形成了具有生物親和性的納米復(fù)合材料，保持了辣根過氧化物酶的生物活性，并利用金納米粒子的高電子密度、介電特性和催化性能，實現(xiàn)了HRP與玻碳電極（GCE）表面的直接電子轉(zhuǎn)移。Nafion膜的滴加能提高電極的選擇性和穩(wěn)定性。實驗過程中借助紫外－可見吸收光譜和透射電子顯微鏡進行表征，實驗結(jié)果證明：GNPs的高導(dǎo)電和高催化性能，結(jié)合植酸膠束的優(yōu)良生物相容性和對酶的高負載量的特點，使得吸附在其上的HRP保持活性，制備的生物傳感器能對H2O2進行電催化還原。Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/ GCE對H2O2的線性濃度范圍為5×10－7～1．15×10－5mol/L（線性相關(guān)系數(shù)r=0．993，n=9），最低檢測限為0．1 μmol/L（信噪比S/N=3），米氏常數(shù)為0．002 4mmol/L。

植酸膠束；金納米粒子；辣根過氧化酶；過氧化氫傳感器

0 引言

近年來，隨著納米技術(shù)與生物傳感器的日益發(fā)展與融合，納米生物傳感器引起了越來越多的關(guān)注。納米生物傳感器是納米技術(shù)與生物傳感器的聯(lián)結(jié)，綜合運用光、聲、電等檢測技術(shù)，其研究范圍涉及到生物科學、信息技術(shù)、納米技術(shù)、界面科學等眾多領(lǐng)域，因而成為研究熱點。在對生物傳感器研究中，將納米材料與多種生物分子結(jié)合，實現(xiàn)識別捕獲、信號傳導(dǎo)和信號放大等功能的集成，從而可以在單體系中一步實現(xiàn)高效生物檢測［1～3］。酶傳感器作為生物傳感器的一種，由于其對被檢測物質(zhì)的專一性和高效性，在過氧化氫、葡萄糖、膽固醇、抗壞血酸、亞硝酸鹽等物質(zhì)的檢測方面應(yīng)用前景廣泛。金納米（GNPs）在電化學生物傳感器的研制中，是研究最廣泛的納米材料之一。金納米粒子（GNPs）的粒徑在100 nm以內(nèi)，具有高電子密度、介電特性和催化作用，可與多種蛋白質(zhì)或酶結(jié)合，不影響其生物活性。利用氯金酸還原法可以制備出各種不同粒徑的GNPs。GNPs是一種極好的催化劑，因其粒子尺寸小、表面積大、表面原子配位不齊，故表面的活性位點增加，使它具備了作為催化劑的基本條件［4～8］。GNPs具有制備簡單、優(yōu)良的導(dǎo)電性，較大的比表面積、催化效率高、性能穩(wěn)定，吸附能力強，良好的生物相容性，易于進行表面化學修飾而被廣泛應(yīng)用于傳感器中酶的固定。GNPs可與酶分子的某些特定基團定向結(jié)合，提高固定酶的活性且提高酶與電極間的電子傳遞速率。該文研究工作采用混合組裝技術(shù)，利用植酸膠束的磷酸酯鍵絡(luò)合辣根過氧化物酶和金納米粒子，形成了具有生物親和性的納米復(fù)合材料，因此保持了納米復(fù)合材料中辣根過氧化物酶的生物活性，并利用金納米粒子的高電子密度、介電特性和催化性能，實現(xiàn)了HRP與玻碳電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移。Nafion膜的滴加能提高電極的選擇性和穩(wěn)定性。實驗結(jié)果證明，制備的生物傳感器能對H2O2進行電催化還原。

1 實驗部分

1.1 實驗試劑

辣根過氧化物酶凍干粉（HRP，E．C．1．11．1．7， RZN3．0，A＞250 U/mg，上海市生物化學試劑公司）；高氯金酸（HAuCl4·3H2O），植酸鈉（記作Na12IP6）和全氟磺酸樹脂（Nafion，5%，溶劑：乙醇和水）均購自Sigma公司；0．1 mol/L磷酸緩沖溶液（PBS）由磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀的水溶液配制而成，并且通過加入0．1mol/L磷酸和氫氧化鉀的水溶液配置成不同pH的PBS；過氧化氫（H2O2，30%，上海潤潔化學試劑公司），其它試劑均為分析純試劑，未經(jīng)任何純化。實驗過程中均用去離子水。

1.2 實驗儀器

JEM－2100型透射電子顯微鏡（日本電子）；UV－8500型紫外－可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；CHI 660 D型電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）；pH計（梅特勒－托利多儀器上海有限公司）；SK2200H超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.3 植酸膠束的制備

植酸膠束（IP6micelles）的制備參照文獻［9］并略做一些改動。1mmol/L植酸鈉溶液在90℃條件下加熱回流20min，然后冷卻到室溫以形成植酸膠束。

1.4 納米金制備

參照文獻［10］合成納米金（GNPs）并略作改動。所用玻璃儀器均用王水清洗浸泡1 h，二次去離子水清洗至少3次。從配置好的HAuCl4（1%）中，移取1．0 mL滴加到100 mL冰水中在冰浴條件下攪拌，使其均勻分散。然后快速加入1%檸檬酸三鈉1．0 mL，再慢慢逐滴加入0．075%NaBH41．3mL，攪拌15min，即制得納米金（GNPs）。

1.5 修飾電極的制備

玻碳電極（GCE，φ=3mm）先后用0．3和0．05 μmα－Al2O3粉在麂皮上打磨成鏡面，再依次用去離子水、乙醇、去離子水進行超聲清洗，最后用氮氣吹干后備用。將植酸膠束、辣根過氧化酶、納米金按1∶2∶2的比例混合，并靜置2 h后，移取5μL此混合液滴于玻碳電極表面，置于4℃冰箱中晾干待用，使用前滴加5μLNafion修飾電極，記作Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE修飾電極，作為對比，分別制作了Nafion/HRP－GNPs/GCE，Nafion/HRP/GCE修飾電極。

1.6 實驗方法

采用普通的三電極體系，以修飾好的玻碳電極（φ=3mm）作為工作電極，鉑片電極和飽和甘汞電極（SCE）分別作為對電極和參比電極。循環(huán)伏安實驗和計時電流實驗前，將高純氮氣通入PBS中至少15min以除去氧氣，保證實驗在氮氣氛下進行。

2 結(jié)果與討論

2.1 金納米粒子（GNPs）的TEM表征

圖1是金納米粒子（GNPs）的透射電子顯微鏡圖。從圖上可以觀察到GNPs的粒徑為3～8 nm，呈球形均勻分布，且沒有發(fā)生團聚現(xiàn)象。期望利用納米金的高電子密度、介電特性和催化作用，并能與生物酶結(jié)合，且不影響其生物活性的特性，在玻碳電極與辣根過氧化物酶之間起電子導(dǎo)線的作用，提高電子轉(zhuǎn)移速率。

圖1 金納米粒子（GNPs）的TEM表征圖Fig．1 TEM imageofGNPs

2.2 紫外-可見吸收圖譜表征

由圖2知，IP6micelles（a）無紫外可見吸收；GNPs（b）的最大吸收峰出現(xiàn)在509 nm；HRP（c）的最大吸收峰位于395 nm。HRP（c）在395 nm位置處的最大吸收峰所對應(yīng)的是HRPFe（Ⅲ）的Soret吸收帶［11］。當植酸膠束（IP6micelles），金納米粒子（GNPs）和辣根過氧化物酶（HRP）按1∶2∶2的比例混合并靜置2 h后，HRP－IP6micelles－GNPs（d）的最大吸收峰在396 nm和509 nm［12～13］處，分別對應(yīng)于辣根過氧化物酶和納米金。并且納米金的特征峰并無變化，說明GNPs在HRP－IP6micelles－GNPs中未發(fā)生團聚并且分散均勻［14］。HRP－IP6micelles－GNPs（d）中HRPFe（Ⅲ）的Soret吸收帶，與HRP在395 nm處的特征峰相比，僅發(fā)生1 nm的紅移，表明修飾在HRP－IP6micelles－GNPs中的HRP其構(gòu)象可能發(fā)生了細微的變化，但仍保持著其原有的生物活性，并未發(fā)生變性。

圖2 （a）IP6micelles，（b）GNPs，（c）HRP和（d）HRP－IP6micelles－GNPs的紫外－可見光譜圖Fig．2 UV－vis spectra of（a）IP6micelles，（b）GNPs，（c）HRPand（d）HRP－IP6micelles－GNPs

2.3 直接電化學行為

圖3 （a）裸玻碳電極，（b）Nafion/HRP/GCE，（c）Nafion/ HRP－IP6micelles/GCE和（d）Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE在PBS（pH7．0）中的循環(huán)伏安曲線。掃速：100mV/sFig．3 Cyclic voltammograms（CVs）of（a）bareGCE，（b）Nafion/HRP/GCE，（c）Nafion/HRP－IP6micelles/GCEand（d）Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE in PBS（pH7．0）．Scan rate：100mV/s

利用HRP－IP6micelles－GNPs三者混合組裝，固定到玻碳電極表面，研究HRP的直接電化學行為。圖3是（a）裸玻碳電極，（b）Nafion/HRP/ GCE，（c）Nafion/HRP－IP6micelles/GCE和（d）Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE在PBS（pH7．0）中的循環(huán)伏安曲線。裸玻碳電極（a）和Nafion/HRP/GCE（b）的循環(huán)伏安曲線上未觀察到氧化還原峰。在曲線（d）Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE上可以觀察到一對明顯的氧化還原峰，而在（c）Nafion/ HRP－IP6micelles/GCE上有一對相對微弱的峰，這說明GNPs的存在能促進HRP在電極表面的直接電化學行為，IP6micelles－GNPs提供的微環(huán)境，不僅可以保持HRP的生物相容性，而且能有效地加快HRP與玻碳電極的電子轉(zhuǎn)移。當掃速為100 mV/s時，Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/ GCE的氧化峰電位Epa=－0．347 V，還原峰電位Epc=－0．397 V。由此推得式量電位E0'=－0．372 V（E0'=（Epa+Epc）/2），ΔEp=50mV，說明Nafion/HRPIP6micelles－GNPs/GCE實現(xiàn)了直接電子轉(zhuǎn)移，電子傳遞速率較快，是一個準可逆的電化學過程。

2.4 不同掃速的循環(huán)伏安曲線

圖4是Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE在PBS中不同掃速的循環(huán)伏安曲線，其峰電流均隨掃速的增加而增加，峰電位基本不變。由內(nèi)插圖觀察到，在掃速50～500mV/s范圍內(nèi)，氧化還原峰電流之比（Ipa/Ipc）接近1，峰電流與掃速成正比。說明這是一個表面控制的電極反應(yīng)過程。同時這也進一步說明HRP已固定到了電極上，并發(fā)生了直接電子轉(zhuǎn)移。

圖4 Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE在PBS（pH7．0）中不同掃速的循環(huán)伏安曲線：50，100，200，300，400，500mV/s（由內(nèi)至外）。內(nèi)插圖：峰電流與掃速的線性關(guān)系Fig．4 CVsofNafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE in PBS（pH7．0）atscan ratesof50，100，200，300，400，500 mV/s（from interior toexterior）．Inset：peak currentversusscan rate

2.5 溶液pH的影響

圖5是Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE在pH值5．0，6．0，7．0，8．0和9．0的PBS中的循環(huán)伏安曲線。從圖上可以看到可逆的氧化還原峰，并且隨著pH值的增加，氧化還原峰電位發(fā)生負移。內(nèi)插圖是式量電位E0'與pH值的線性關(guān)系圖，斜率為－53．8mV/pH。這一數(shù)值稍小于伴隨一個質(zhì)子轉(zhuǎn)移的單電子可逆電極反應(yīng)的理論值－57．6mV/pH。原因可能是受到了水合鐵離子或血紅素軸向配位基團的質(zhì)子化作用的影響［15～17］。

2.6 Nafion/HRP-IP6m icelles-GNPs/GCE對過氧化氫的催化

圖6是Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE對不同濃度的H2O2的循環(huán)伏安圖。當H2O2加入到PBS（pH7．0）后，Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/ GCE的還原峰電流變大而氧化峰電流變小。隨著H2O2濃度的增加，還原峰電流逐漸增大，而氧化峰電流逐漸減小甚至消失。實驗結(jié)果表明：Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE修飾電極可以電催化還原H2O2。

圖5 Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE在pH值為5．0，6．0，7．0，8．0和9．0PBS中循環(huán)伏安曲線。內(nèi)插圖：式量電位E0'與pH值的線性關(guān)系。掃速：100mV/sFig．5 CVsof Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE in PBSwith pH value of5．0，6．0，7．0，8．0 and 9．0．Inset：plotof formalpotential versus the pH．Scan rate：100mV/s

圖6 Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE在PBS（pH7．0）中含（a）0，（b）1×10－5，（c）5．0×10－5，（d）1．0×10－4，（e）2．0×10－4，（f）3．0×10－4和（g）4．0×10－4mol/LH2O2的循環(huán)伏安曲線。掃速：100mV/sFig．6 CVsofNafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE in PBS（pH7．0）in the presenceof（a）0，（b）1×10－5，（c）5．0× 10－5，（d）1．0×10－4，（e）2．0×10－4，（f）3．0×10－4and（g）4．0× 10－4mol/LH2O2．Scan rate：100mV/s

2.7 Nafion/HRP-IP6m icelles-GNPs/GCE計時電流

圖7是Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE對H2O2的計時電流曲線。內(nèi)插圖：響應(yīng)電流與H2O2濃度的校正曲線。隨著H2O2的不斷滴加，還原電流逐級增加并在3 s內(nèi)達到穩(wěn)態(tài)電流的95%，證明這是一個快速的電催化反應(yīng)。內(nèi)插圖反映了該傳感器對催化電流的線性校正關(guān)系，Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE對H2O2的線性濃度范圍為5×10－7～1．15×10－5mol/L（線性相關(guān)系數(shù)r=0．993，n=9），最低檢測限為0．1μmol/L（信噪比S/N=3）。由Lineweaver－Burk方程計算得Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE的表觀米氏常數(shù)（apparentMichaelis-Menten constant，K），K =0．002 4mmol/L，說明固定在IP6micelles－GNPs基底上的HRP具有較高的活性，對H2O2具有良好親和性。

2.8 穩(wěn)定性

修飾電極Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/ GCE在PBS中以100mV/s連續(xù)掃描50圈，其響應(yīng)電流無變化。Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/ GCE傳感器放置在4℃下儲存30 d后，測定其循環(huán)伏安電流及峰位置未發(fā)生變化。且得到的響應(yīng)電流為初始電流的94%。

圖7 Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE在－0．24V工作電位下在10mLPBS（pH7．0）中連續(xù)加10μL 0．1mmol/LH2O2和10μL 1mmol/LH2O2的計時電流響應(yīng)曲線。內(nèi)插圖：響應(yīng)電流與H2O2濃度的校正曲線Fig．7 Amperometric responsesof the Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCEat－0．24 V to successive addition of 10μL 0．1mmol/LH2O2and 10μL 1mmol/LH2O2in a10mLPBS（pH7．0）under stirring．Inset：plotsof the linear calibration curves

3 結(jié)論

該研究工作采用混合組裝技術(shù)，利用植酸膠束的磷酸酯鍵絡(luò)合辣根過氧化物酶和金納米粒子，形成了具有生物親和性的納米復(fù)合材料，因此保持了納米復(fù)合材料中辣根過氧化物酶的生物活性，并利用金納米粒子的高電子密度、介電特性和催化性能，實現(xiàn)了HRP與玻碳電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移。以此制備的Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE可以電催化還原H2O2并可用于對H2O2快速檢測。

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Hydrogen pero xidebio sensor based on gold nanoparticles-phytic acidm icellem ixed assemble

Guo Xiao-yu，Miao Yun，Yang Hai-feng*
（DepartmentofChemistry，Collegeof lifeand EnvironmentSciences，ShanghaiNormalUniversity，Shanghai 200234，China）

A hybrid and bio－compatible sensor constructed with IP6micelles phosphate bonded horseradish peroxidaseand gold nanoparticles．Thenano－compositematerialsnotonly keep thebiologicalactivity ofhorseradish peroxidase，but also achieve the high electron density，dielectric properties and catalytic performance of gold nanoparticles to facilitate the directelectron transfer．Furthermore，Nafionmembrane can improve the selectivity and stability of sensor．The characterizations of UV－visible absorption spectroscopy and transmission electron microscopy showed that the high conductivity and high catalytic properties of nanoparticles together with the excellent biocompatibility and high enzyme loading IP6micellesmade the adsorption of HRP and maintained its activity．Nafion/HRP－IP6micelles－GNPs/GCE biosensor can electrocatalytically reduce H2O2．The current response with the concentration of H2O2has a linear relationship within the concentration range of 5×10－7～1．15×10－5mol/L（linear correlation coefficient r=0．993，n=9），the detection limitwas 0．1μmol/L（signal to noise ratio S/N=3），Michaelis constantof0．002 4mmol/L．

IP6m icelles;gold nanoparticles;horseradish peroxidase;hydrogen peroxide sensor

國家自然科學面上基金項目（21073121）

*通訊聯(lián)系人，E－mail：haifengyang＠yahoo．com，Tel：Fax：021－64322511