蔣慶琳等

摘 要 為探究直接檢測瓜類單粒種子攜帶黃瓜綠斑駁花葉病毒（CGMMV）的快速檢測技術(shù)，以一步法RT-PCR為基礎(chǔ)，構(gòu)建同時(shí)擴(kuò)增CGMMV基因組3′端和5′端基因的（一步法）雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR和巢式雙重IC-RT-PCR技術(shù)，靈敏度分別為10-3、10-3、10-4，巢式雙重IC-RT-PCR靈敏度比雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR高10倍。對不同種質(zhì)、不同來源的種子及種子的不同部位進(jìn)行檢出率比較，巢式雙重IC-RT-PCR檢出率高于其它2個(gè)檢測技術(shù)，試驗(yàn)種子種表帶毒檢出率高于種子組織研磨物，商用種子種表帶毒檢出率低于種子組織研磨物。為有效阻斷毒源，建議同時(shí)對種表和種子組織研磨物進(jìn)行檢測，種表采用雙重RT-PCR檢測，種子組織研磨物采用雙重IC-RT-PCR或巢式雙重IC-RT-PCR檢測。

關(guān)鍵詞 黃瓜綠斑駁花葉病毒；雙重RT-PCR；雙重IC-RT-PCR；巢式雙重IC-RT-PCR；種子檢測

中圖分類號 S41-31 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract A comparative study on three one-step RT-PCR-based methods for rapid detection of CGMMV from individual cucurbitaceous seed is presented. Specific primers based on the 3′- and 5′-terminal regions of the CGMMV genome were screened and used for duplex RT-PCR， IC-RT-PCR， and nested-IC-RT-PCR detection. The results showed that the sensitivities of the three methods were 10-3， 10-3 and 10-4 respectively， with the latter method being the most sensitive. The nested-IC-RT-PCR method had higher detection rates than the other two methods in the detection of the seeds from different germplasms， sources or parts as well. In addition， the results showed that CGMMV detection rates obtained from the surface of experimental seeds were higher than those from ground seed tissue， and that from the surface of commercial seeds were lower than the latter. For effective quarantine， we suggest both the seed surface and ground seed tissue be subjected to RT-PCR detection， the former by duplex RT-PCR and the latter by duplex IC-RT-PCR or nested-IC-RT-PCR.

Key words CGMMV； Duplex RT-PCR； Duplex IC-RT-PCR； Duplex nested-IC-RT-PCR； Seed detection

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.09.033

黃瓜綠斑駁花葉病毒（Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）屬煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）成員，是為害葫蘆科作物的主要病毒之一。自1935年Ainsworth[1]首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道后，CGMMV通過種子帶毒進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，已廣泛分布在歐洲、印度、日本等國家和地區(qū)[2-4]。2005年中國首次報(bào)道CGMMV侵染廣西觀賞南瓜[5]，2006年遼寧省蓋州市西瓜大面積感染CGMMV，損失嚴(yán)重[6]。CGMMV對中國西瓜等葫蘆科作物生產(chǎn)已造成嚴(yán)重威脅和損失，農(nóng)業(yè)部發(fā)布第788號公告，將CGMMV確定為全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物[7]?？焖佟㈧`敏、簡便的種子帶毒檢測方法是控制CGMMV傳播和擴(kuò)展的有效途徑。目前，CGMMV種子帶毒檢測方法主要有生物學(xué)技術(shù)[8]、血清學(xué)技術(shù)[5，9-11]和分子生物學(xué)技術(shù)[10，12-14]。由于生物學(xué)技術(shù)工作量大、周期長，帶毒種子長成的植株不一定感病，血清學(xué)技術(shù)靈敏度低，易造成漏檢。因此具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便的分子生物學(xué)技術(shù)已成為主要檢測技術(shù)。鑒于種子中含有的多糖及次生代謝物質(zhì)影響RNA提取質(zhì)量[10]，造成RNA降解，檢測CGMMV單一目的片段的常規(guī)RT-PCR容易造成漏檢，根據(jù)CGMMV的全基因組序列，在5′端和3′端分別設(shè)計(jì)特異引物對，在一步法RT-PCR的基礎(chǔ)上，在同一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測CGMMV 5′端和3′端的2個(gè)基因片段，構(gòu)建（一步法）雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR、巢式雙重IC-RT-PCR檢測技術(shù)，并研究適宜不同種質(zhì)、不同來源的種子及種子不同部位的檢測技術(shù)，提高檢測的可靠性，對防止該病毒通過種子傳播擴(kuò)散，保護(hù)中國葫蘆科作物健康生產(chǎn)有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 種子 感病種子：試驗(yàn)種子，四葉期接種的感病黃瓜（粵秀3號）、苦瓜（豐綠）、絲瓜（夏寶）植株結(jié)果成熟后，收獲成熟飽滿的種子，清洗一遍后，吸干水份晾干，室溫保存。商用種子，黃瓜種子和南瓜種子為廣東省檢疫部門惠贈(zèng)，黃瓜品種為新農(nóng)3號，南瓜品種為旺優(yōu)蜜本，距生產(chǎn)日期1 a。

1.1.2 供試毒源 2006年底采自廣東省海豐縣的西瓜（Citrullus lanatus）病葉保存在-80 ℃超低溫冰箱，西瓜病葉常規(guī)汁液摩擦接種黃瓜幼苗，栽培于防蟲網(wǎng)室內(nèi)，以發(fā)病的黃瓜（Cucumis sativus）植株作為后續(xù)試驗(yàn)的毒源。

1.1.3 主要試劑 TaKaRa PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2購于大連寶生物工程有限公司；RNAiso Plus購于大連寶生物工程有限公司；CGMMV抗體購自美國Agdia公司CGMMV ELISA檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 引物合成、設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank已報(bào)道的CGMMV基因組序列，應(yīng)用DNAman 4.0軟件（Lynnon BioSoft，Quebec，Canada）分析各分離物基因組保守序列，在3′端外殼蛋白基因（coat protein gene，CP）和運(yùn)動(dòng)蛋白基因（move protein gene，MP）處設(shè)計(jì)4條上下游引物，在5′端設(shè)計(jì)4條上下游引物（見表1），其中3′端上游引物F1、F2，3′端下游引物R1、R2與李小妮等[15]報(bào)道相同。（一步法）雙重RT-PCR和雙重IC-RT-PCR引物對組合為F2/R1與5L1/5R1；巢式雙重IC-RT-PCR外引物對組合和內(nèi)引物對組合分別為：F1/R2、5L1/5R1和F2/R1、5L2/5R2。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.2.2 特異性檢測 參照RNAiso Plus說明書提取黃瓜、西瓜、苦瓜、絲瓜、冬瓜、葫蘆、小西葫蘆葉片總RNA，通過RT-PCR檢測（一步法）雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR引物對組合和巢式雙重IC-RT-PCR外引物對組合的特異性。RT-PCR反應(yīng)體系為15 μL：RNase-free water 2.2 μL，2×1 step buffer 7.5 μL，每條引物1 μL，共4 μL，Prime Script 1 Step Enzyme Mix 0.3 μL，RNA 1 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?0 ℃ 30 min，94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，35個(gè)循環(huán)；補(bǔ)充延伸72 ℃ 5 min。

1.2.3 （一步法）雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR、巢式雙重IC-RT-PCR檢測技術(shù)的比較

（1）靈敏度比較。以感病的黃瓜葉片為材料，將0.1 g感病葉片與PBST研磨緩沖液以1/10（w/V）充分研磨后，用PBST 10倍系列稀釋，10 000×g離心10 min，上清液即為檢測用的病葉粗汁液，取400 μL病汁液參照RNAiso Plus抽提RNA進(jìn)行雙重RT-PCR，剩余的病汁液用于雙重IC-RT-PCR、巢式雙重IC-RT-PCR，比較各檢測技術(shù)的靈敏度。雙重RT-PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同1.2.2。雙重IC-RT-PCR、巢式雙重IC-RT-PCR方法為：第一，病毒捕獲：PCR管中加入50 μL以1 ∶ 500稀釋的CGMMV抗體37 ℃孵育2 h或4 ℃過夜，用PBST洗滌液（不含NaDIECA）洗3次，每次洗滌停留2 min，吸取50 μL待檢樣品于200 μL PCR管中，37 ℃恒溫箱孵育3 h，PBST洗3次，DEPC水洗1次，洗畢短暫離心吸去余液，室溫晾干；第二，病毒裂解和RT-PCR：向PCR管中加入RNase-free water 3.0 μL，2×1 step buffer 7.5 μL，每條引物1 μL，共4 μL然后將反應(yīng)管置于PCR儀中，95 ℃加熱5 min，立即轉(zhuǎn)移至冰上，冰浴2 min，向管中加入TaKaRa PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 0.5 μL，放入PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增程序同1.2.2；第三，巢式雙重IC-RT-PCR第二輪反應(yīng)：共25 μL體系，10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 0.5 μL，rTaq 0.2 μL，DEPC水16.8 μL，每條引物1 μL，共4 μL，以第二的產(chǎn)物稀釋20～50倍為模板，1 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 2 min后，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)，補(bǔ)充延伸72 ℃ 5 min。

（2）各檢測技術(shù)對不同作物種子帶毒檢出率比較。第一，種表帶毒率檢測：以單粒試驗(yàn)種子為單位，檢測30粒黃瓜種子、苦瓜種子、絲瓜種子（單粒種子重約：黃瓜0.03 g，苦瓜0.2 g，絲瓜0.1 g，儲(chǔ)存5～6個(gè)月）。單粒種子用500 μL PBST浸泡30 min后，取出種子，獲得種表浸泡液，先取400 μL抽提RNA用于雙重RT-PCR，再分別取50 μL用于雙重IC-RT-PCR、巢式雙重IC-RT-PCR比較各檢測技術(shù)的檢出率。

第二，種子組織研磨物帶毒率檢測：取出浸泡后的種子，液氮研磨后加入500 μL PBST研磨緩沖液或直接加500 μL PBST研磨液充分研磨，10 000×g離心10 min，取上清各100 μL用于IC-RT-PCR、巢式IC-RT-PCR，剩余上清和種子組織加入RNAiso Plus RNA提取液充分研磨（黃瓜、苦瓜、絲瓜種子分別加入1、5、2 mL），室溫靜止5 min；加入氯仿/異戊醇（24 ∶ 1）（分別加入500、2 500、500 μL），劇烈振蕩15 s，冰浴10 min；4 ℃ 12 000 r/min離心15 min；后續(xù)步驟同RNAiso Plus說明（異丙醇用量改用500、1 500、500 μL）比較各檢測技術(shù)的檢出率。

（3）（一步法）雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR、巢式雙重IC-RT-PCR檢測進(jìn)出口岸商用種子應(yīng)用。以商用種子為檢測對象，檢測24粒黃瓜種子和30粒南瓜種子的種表和種子組織研磨物帶毒情況，比較各檢測技術(shù)，方法同（2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 （一步法）雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR、巢式雙重IC-RT-PCR引物對組合特異性檢測

以感染CGMMV的黃瓜、西瓜、苦瓜、絲瓜、冬瓜、葫蘆、小西葫蘆作物葉片組織總RNA為檢測對象，對雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR引物對組合和巢式雙重IC-RT-PCR外引物對組合進(jìn)行RT-PCR特異性檢測，結(jié)果表明能成功檢測感染CGMMV的黃瓜、西瓜、苦瓜、絲瓜、冬瓜、葫蘆、小西葫蘆作物葉片組織，雙重RT-PCR和雙重IC-RT-PCR引物對組合F2/R1與5L1/5R1，擴(kuò)增目的片段大小分別為309、748 bp，巢式雙重IC-RT-PCR外引物對組合F1/R2、5L1/5R1，擴(kuò)增目的片段大小分別為1 475、748 bp，相應(yīng)健康作物葉片組織對照無條帶，表明引物對特異性高（見圖1）。

2.2 一步法雙重RT-PCR、IC-RT-PCR、巢式IC-RT-PCR靈敏度比較

以感病的黃瓜葉片為材料，用PBST 10倍梯度稀釋，進(jìn)行（一步法）雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR、巢式雙重IC-RT-PCR檢測技術(shù)靈敏度比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2條目的條帶均清晰擴(kuò)增的稀釋倍數(shù)分別為103倍、103倍、104倍，巢式雙重IC-RT-PCR靈敏度比雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR高10倍（見圖2）。

2.3 不同作物種子（一步法）雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR、巢式雙重IC-RT-PCR檢出率比較

（一步法）雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR、巢式雙重IC-RT-PCR分別檢測30粒黃瓜、苦瓜、絲瓜試驗(yàn)種子的種表和種子組織研磨物帶毒情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同檢測方法檢測不同種子及部位，檢出率各異（見表2）。巢式雙重IC-RT-PCR帶毒檢出率總體高于雙重RT-PCR和雙重IC-RT-PCR，種表帶毒檢出率高于種子組織研磨物檢出率。黃瓜種子種表帶毒檢出率用雙重RT-PCR和巢式雙重IC-RT-PCR檢測高于雙重IC-RT-PCR；黃瓜種子組織研磨物和絲瓜種子種表帶毒檢出率用雙重RT-PCR檢測高于另外2個(gè)技術(shù)；苦瓜種子的種表、種子組織研磨物和絲瓜種子組織研磨物的帶毒檢出率用巢式雙重IC-RT-PCR檢測高于另外2個(gè)技術(shù)。

2.4 （一步法）雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR、巢式雙重IC-RT-PCR檢測技術(shù)的應(yīng)用

（一步法）雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR、巢式雙重IC-RT-PCR對24粒黃瓜種子和30粒南瓜種子的種表和種子組織研磨物進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，巢式雙重IC-RT-PCR帶毒檢出率高于雙重IC-RT-PCR和雙重RT-PCR，種子組織研磨物帶毒檢出率高于種表帶毒檢出率。放置1 a的商用黃瓜種子和南瓜種子用雙重RT-PCR檢測種表和種子組織研磨物結(jié)果均為0；雙重IC-RT-PCR、巢式雙重IC-RT-PCR檢測黃瓜種子種表結(jié)果均為8.3%，檢測黃瓜種子組織研磨物結(jié)果分別為8.3%、33.3%，檢測南瓜種子種表結(jié)果分別為0、16.7%，檢測南瓜種子組織研磨物結(jié)果分別為0、36.7%（見表3）。

3 討論與結(jié)論

（一步法）雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR、巢式雙重IC-RT-PCR應(yīng)用于試驗(yàn)種子和商用種子攜帶CGMMV的帶毒率檢測，結(jié)果表明巢式雙重IC-RT-PCR以其高靈敏度性，檢出率總體高于雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR，不同種質(zhì)、不同來源的種子及種子的不同部位的檢出率存在差異，即試驗(yàn)種子檢出率高于商用種子，試驗(yàn)種子的種表帶毒檢出率總體高于種子組織研磨物，商用種子的種表帶毒檢出率低于種子組織研磨物。除受CGMMV主要附著在種子表皮[16]，且不同瓜類CGMMV種子帶毒率不同[6]等因素影響外，儲(chǔ)藏時(shí)間的不同，對種子處理方式不同也會(huì)影響檢出率，即試驗(yàn)種子采集后清洗一遍吸干水份后晾干，而商用種子通常會(huì)對種子進(jìn)行清洗或消毒等多次處理造成種表攜帶病毒含量不同。另外，采種時(shí)，攜帶病毒的果肉汁液殘留種表的多少以及不同種子表皮結(jié)構(gòu)對病毒依附種表的影響，也會(huì)影響不同種子及種子不同部位的檢出率。而用雙重IC-RT-PCR和巢式雙重IC-RT-PCR檢測試驗(yàn)種子的絲瓜種子，種子組織研磨物帶毒檢出率高于種表；試驗(yàn)種子的黃瓜種子組織研磨物和絲瓜種子種表用巢式雙重IC-RT-PCR檢測，帶毒檢出率低于雙重RT-PCR，而商用種子不存在此類現(xiàn)象，除受檢測技術(shù)靈敏度的影響外，不同種子RNA提取質(zhì)量受多糖及次生代謝物質(zhì)限制的差異，種子帶毒量的多少，以及免疫RT-PCR抗體的特異性、抗體與PCR管結(jié)合力和病毒的捕獲能力等因素也會(huì)造成檢出率差異。

綜合考慮3種檢測技術(shù)，巢式雙重IC-RT-PCR以其高于雙重RT-PCR和雙重IC-RT-PCR 10倍的靈敏度，適用于帶毒率較低、多糖及次生代謝物質(zhì)含量較高以及儲(chǔ)存時(shí)間較長的種子帶毒檢測；雙重RT-PCR、雙重IC-RT-PCR以其快速、簡便，適用于帶毒率較高、多糖和次生代謝物質(zhì)較少以及儲(chǔ)存時(shí)間較短的種子帶毒檢測。為有效阻斷毒源，建議種表采用雙重RT-PCR檢測，種子組織研磨物采用雙重IC-RT-PCR或巢式雙重IC-RT-PCR檢測，并對種表和種子組織研磨物同時(shí)進(jìn)行檢測。為提高效率，可增加檢測樣本量，對多粒種子種表同時(shí)進(jìn)行處理，種子種表總RNA提取可直接用RNAiso Plus浸泡提取。另外，RT-PCR檢測種子組織研磨物時(shí)，若在加入氯仿/異戊醇（24 ∶ 1）冰浴10 min后，上層液體渾濁不清含大量種子研磨物時(shí)，重新將上層液體轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入適量RNAiso Plus RNA提取液和氯仿/異戊醇（24 ∶ 1）直至冰浴10 min后，上層液體較為清澈時(shí)進(jìn)行后續(xù)步驟可成功提取RNA。

參考文獻(xiàn)

[1] Ainsworth G C. Mosaic disease of cucumber[J]. Ann Appl Biol， 1935（22）： 55-67.

[2] Hollings M， Komuro Y， Tochihara H. Cucumber green mottle mosaic virus. Descriptions of plant viruses[M]. Kew： CMI/AAB， 1975.

[3] Tarasashvili L. Study on the spread and harmfulness of Cucumber ordinary mosaic virus in Georgia and on the resistance of varieties to the disease[J]. Trudy Naucho Issledovatel'skogo Instituta Zashchity Rasten ii Gruz SSR， 1976（28）： 31-34.

[4] Choi G， Choi G S. Occurrence of two tobamovirus diseases in cucurbits and control measures in Korea[J]. Plant Pathology Journal， 2001， 17（5）： 243-248.

[5] 秦碧霞， 蔡健和， 劉志明， 等. 侵染觀賞南瓜的黃瓜綠斑駁花葉病毒的初步鑒定[J]. 植物檢疫， 2005， 19（4）： 198-200.

[6] 古勤生. 防治監(jiān)控黃瓜綠斑駁花葉病毒， 確保瓜類安全生產(chǎn)[J]. 中國瓜菜， 2007（1）： 47-48.

[7] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告（第788號）[J]. 中國植保導(dǎo)刊， 2007（3）： 11.

[8] 馮蘭香， 謝丙炎， 楊宇紅， 等. 檢疫性黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測和防疫控制[J]. 中國蔬菜， 2007（9）： 34-38.

[9] 趙世恒， 李明福， 張永江， 等. 引進(jìn)種質(zhì)西瓜中黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2007， 22（2）： 32-34.

[10] 張永江， 馬 潔， 李桂芬， 等. 3種葫蘆科作物種質(zhì)資源中黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢測[J]. 種子， 2008， 27（10）： 41-43.

[11] Kawai A， Kinura S， Nishio T. Detection for Cucumber green mottle mosaic virus in cucumber seeds using enzyme linked inmunosorbent assay[J]. Research Bulletin of the Plant Protection Service， 1985（21）： 47-53.

[12] 黃 靜， 廖富榮， 林石明， 等. 南瓜種子中黃瓜綠斑駁花葉病毒IC-RT-PCR檢測方法的建立[J]. 漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2009， 11（1）： 12-15.

[13] 張衛(wèi)東， 權(quán)永兵， 廖 力， 等. RT-PCR法特異性快速檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 33（1）： 43-46.

[14] Varveri C， Vassilakos N， Bem F. Characterization and detection of Cucumber green mottle mosaic virus in Greece[J]. Phytoparasitica， 2002， 30（5）： 493-501.

[15] 李小妮， 任小平， 王 琳， 等. 廣東省黃瓜綠斑駁花葉病毒分子檢測及防疫[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2009， 36（3）： 283-284.

[16] 種 炎. 黃瓜綠斑駁花葉病毒導(dǎo)致的西瓜花葉病及其檢疫性評估[J]. 植物檢疫， 1993， 7（4）： 325-326.