王志鳳　程玉祥　李淑娟

摘要[目的]鑒定擬南芥AtGDPD-like6和AtGDPD-like7基因的突變體。[方法]以擬南芥AtGDPD-like6和AtGDPD-like7為研究對象，采用半定量RT-PCR法進行分析，并用3引物PCR擴增法進行篩選和鑒定。[結果]各得到2個AtGDPD-like6和AtGDPD-like67獨立T-DNA插入純合突變體。半定量RT-PCR結果顯示，4個純合突變體中目標基因轉錄表達都被完全敲除。[結論]AtGDPD-like6和AtGDPD-like67突變體材料的獲得為生理功能的鑒定提供了反向遺傳學材料。

關鍵詞 擬南芥；AtGDPD-like6；AtGDPD-like7；T-DNA；突變體鑒定

中圖分類號S188文獻標識碼A文章編號0517-6611（2014）07-01921-02

基金項目國家高技術研究發(fā)展計劃（2013AA102702）。

作者簡介王志鳳（1988-），女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，研究方向：林木遺傳育種。*通訊作者，高級工程師，從事林木分子遺傳改良、林木基因工程育種。

收稿日期20140120甘油磷酸二酯磷酸二酯酶GDPD（glycerophosphodiester phosphodiesterase）廣泛地存在于原核和真核生物中，最早在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，有2個成員：glpQ和ugpQ，參與細菌的碳、磷營養(yǎng)代謝[1-2]。酵母GDPD（GDE1）水解產(chǎn)生的肌醇、膽堿等是其重要的代謝物質[3-4]。哺乳動物GDPD家族成員生理功能被報道較多，例如：GDE1/MIR16在磷酸肌醇代謝和G蛋白信號轉導之間起橋梁作用[5]；GDE2參與調解脊髓運動神經(jīng)元的分化[6]；GDE6則促進了骨細胞分化[7]。植物GDPD活性在胡蘿卜懸浮細胞的細胞壁和液泡中被最先報道[8]，該活性還受低磷環(huán)境刺激[9]。

擬南芥有13個含GDPD結構域的基因，分為GDPD和GDPDlike 2個亞家族，且GDPDlike亞族基因是植物界（含藻類）所特有的[10]。此外，根毛發(fā)育障礙、側根較少的shv3突變體是由AtGDPDlike3突變所致[11]。目前，關于植物GDPDlike的功能研究鮮有報道。Wang等的轉錄組數(shù)據(jù)提示，2個同源基因AtGDPDlike6和AtGDPDlike7可能參與擬南芥花粉萌發(fā)和花粉管伸長[12]。筆者對AtGDPDlike6和AtGDPDlike7組織表達模式進行鑒定，并篩選出其TDNA插入突變體，以期為下一步研究這2個基因功能奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 研究對象。擬南芥材料均為Columbia型，TDNA插入株系為SALK_037722C、SALK_121181、SALK_057184C和CS801992，均購自ABRC Ohio State University。

1.1.2 主要試劑。植物基因組DNA快速提取試劑盒，購自百泰克公司；pBIOZOL Reagent，購自BioFlux公司；Silica Bead DNA Gel Extraction，購自KitFermentas公司；pMD18T載體、Taq DNA聚合酶和PrimeScript RT reagent Kit With gDNA反轉錄試劑盒，均購自TaKaRa公司；引物，由Invitrogen公司合成。

1.2方法

1.2.1 植物基因組DNA提取。操作過程參照試劑盒說明書。

1.2.2 植物總RNA提取及cDNA合成。取植物材料，經(jīng)過液氮速凍、研碎至粉末，用4 ℃預冷的pBIOZOL試劑懸浮粉末后移入1.5 ml離心管，具體步驟參照pBIOZOL Reagent說明書?？俢DNA合成使用Primescript RT reagent Kit with gDNA eraser試劑盒。