劉超 張悅麗 張博 李長(zhǎng)松 石磊 齊軍山

摘 ?要：為監(jiān)測(cè)灰霉病菌對(duì)腐霉利的抗藥性，2012年12月到2013年5月，在山東省內(nèi)10個(gè)市縣，采集灰霉病菌樣本150余份，分離得到灰葡萄孢（Botrytis cinerea）菌株130株，采用生長(zhǎng)速率法對(duì)130株灰霉病菌進(jìn)行抗藥性檢測(cè)。結(jié)果表明，腐霉利對(duì)灰霉病菌的EC50的范圍為0.1208～12.486 ?g/mL，平均EC50為4.03 ?g/mL，抗性頻率達(dá)到67.69%。其中低抗菌株占52.38%，中抗菌株占19.048%，未檢測(cè)到高抗菌株。本研究可為灰霉病的防治特別是殺菌劑的輪換使用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：灰葡萄孢;殺菌劑;腐霉利;抗藥性

中圖分類(lèi)號(hào)：S482.2 ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ?論文編號(hào)：2014-0213

Resistance Detection for Botrytis cinerea Against Procymidone in Shandong Province

Liu Chao1，2， Zhang Yueli2， Zhang Bo2， Li Changsong2， Shi Lei1， Qi Junshan2

（1School of Life Science， Qufu Normal University， Qufu 273165， Shandong， China;

2Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences/

Shandong Province Key Laboratory of Plant Virology， Jinan 250100， Shandong， China）

Abstract： In order to monitor procymidone resistance of Botrytis cinerea， from December of 2012 to May of 2013， many Botrytis cinerea samples were collected from 10 cities in Shandong， and 130 isolates were purified from them. The resistances of Botrytis cinerea were determined in 130 isolates by measuring the mycelia growth on the fungicide-amended media. The means of the 50% effective concentration values （EC50） were 4.03 ?g/mL. The resistance frequency was 67.69%， 52.38% of Botrytis cinerea was low resistant strains， 19.048% of Botrytis cinerea was moderate resistant strains; there was no high resistant strain. The results provided a theoretical basis for using fungicides efficiently to prevent and control botrytis cinerea in the field.

Key words： Botrytis cinerea; Fungicides; Procymidone; Resistance

0 ?引言

灰霉病是危害最嚴(yán)重、分布最廣泛的植物病害之一，其病原灰葡萄孢（Botrytis cinerea），于2012年被《Molecular Plant Pathology》雜志評(píng)為最重要的十大植物病原真菌中的第2位。可侵染番茄、草莓、梨、黃瓜、西葫蘆、蕓豆、萵苣、辣椒、獼猴桃、葡萄以及核桃甚至小麥等數(shù)百種作物[1-5]。據(jù)黑龍江農(nóng)科院的王春艷[6]報(bào)道，1988年黑龍江省綏化地區(qū)大面積爆發(fā)灰霉病，損失高達(dá)38%～42%，發(fā)病面積占生產(chǎn)面積的80%以上，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

灰霉病菌繁殖快、易變異，其防治難點(diǎn)在于極易產(chǎn)生抗藥性。國(guó)內(nèi)外對(duì)灰霉病抗藥性有不少的報(bào)道，1992年劉波等[7]發(fā)現(xiàn)某些地區(qū)的灰霉菌株對(duì)腐霉利有一定的抗藥性，并得出苯并咪唑類(lèi)和二甲酰亞胺類(lèi)的抗藥性二者不存在交互抗性的結(jié)論。1997年，李林等[8]在對(duì)282株灰霉菌株的研究中，發(fā)現(xiàn)多菌靈的抗性菌株已經(jīng)達(dá)到了81.9%，而對(duì)腐霉利已經(jīng)產(chǎn)生抗性，大多數(shù)菌株處于低抗水平。2001年，丁中等[9]在山東3個(gè)保護(hù)地的采樣結(jié)果表明，多菌靈與腐霉利的雙抗菌株的頻率達(dá)到100%。病菌的抗藥性監(jiān)測(cè)是一項(xiàng)日常性又極為重要的工作，雖然已經(jīng)有不少類(lèi)似的研究，但是不同地區(qū)的病菌抗藥性不同。即便同一地區(qū)，隨著時(shí)間的發(fā)展，病菌的抗藥性也會(huì)發(fā)生變化。本研究的目的是對(duì)當(dāng)前山東地區(qū)灰霉病菌對(duì)腐霉利抗藥性進(jìn)行檢測(cè)，為田間用藥以及灰霉病的防治提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?灰霉菌株的采集與分離

2012年12月—2013年5月，在山東省內(nèi)10個(gè)城市的多個(gè)區(qū)縣保護(hù)地，以大棚為單位進(jìn)行灰霉病果和病葉的采集，每個(gè)大棚采集2～4個(gè)病果或者病葉。將樣品包好帶回實(shí)驗(yàn)室，分離純化，獲得灰霉菌株。

1.2 ?供試藥劑

98.4%腐霉利原藥（如東縣華盛化工有限公司）。

1.3 ?供試含藥培養(yǎng)基

98.4%腐霉利原藥用丙酮配制成10000 μg/mL的母液，且以0.2%的量加入乳化劑Tween-80。將母液置于4℃冰箱內(nèi)貯存，將其稀釋到合適的濃度使用。

1.4 ?抗藥頻率的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)采用最低抑制法（MIC），以Yarden[10]標(biāo)準(zhǔn)為基準(zhǔn)，如果能在5 μg/mL腐霉利PDA含藥平板上生長(zhǎng)的菌株為抗性菌株。

將待測(cè)菌株在21℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天，用5 mm的打孔器在菌落的邊緣打孔，將菌柄移至帶藥平板中央，培養(yǎng)5天，觀察結(jié)果，統(tǒng)計(jì)菌株的抗性頻率。

1.5 ?抗性水平的測(cè)定

采用生長(zhǎng)速率法，將抗性和敏感菌株分別在含有腐霉利梯度平板上進(jìn)行毒力測(cè)定，重復(fù)3次，待4～5天，對(duì)照長(zhǎng)滿(mǎn)平板時(shí)，采用十字交叉法量取菌落直徑，計(jì)算抑制率。利用DPS統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)算菌株的EC50，得到菌株的抗性水平。

抗性菌株=[抗性菌株EC50敏感菌株EC50]

根據(jù)抗性水平，可將灰霉菌株分為3種抗性類(lèi)型[11]，如果抗性菌株的EC50與敏感菌株的EC50的比值小于10時(shí)，則為低抗型，如果在11～100倍之間時(shí)，則為中抗型，如果大于100倍時(shí)，則為高抗型。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?灰霉病原菌的分離和基本特征

將采集到的灰霉病樣品，室內(nèi)分離并得到Botrytis cinerea菌株130株，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，灰葡萄孢菌落初為白色，產(chǎn)孢后菌絲聚集呈褐色;分生孢子梗數(shù)根叢生，具隔，褐色，頂端具有分枝，梗頂稍膨大，呈棒頭狀，其上密生小柄并有大量分生孢子?；移咸焰呔谄桨迳系男螒B(tài)如圖1。

2.2 ?灰霉病菌對(duì)腐霉利抗性頻率測(cè)定

以5 μg/mL為抗感標(biāo)準(zhǔn)，灰霉菌株對(duì)腐霉利敏感菌株42株，抗性菌株88株，抗性頻率為67.69%。通過(guò)對(duì)不同地區(qū)的抗性頻率的統(tǒng)計(jì)（如圖2）發(fā)現(xiàn)，棗莊地區(qū)對(duì)5 μg/mL腐霉利的抗性頻率達(dá)到93.33%，而聊城地區(qū)的抗性頻率為0%，由此可見(jiàn)，各地區(qū)對(duì)腐霉利的抗性頻率是不盡相同的。

2.3 ?灰霉菌株對(duì)腐霉利抗性水平測(cè)定

在分離得到的130株中，根據(jù)地區(qū)分布選取21株進(jìn)行抗藥性測(cè)定，EC50的范圍為0.1208～12.486 ?g/mL，平均EC50為4.03 ?g/mL，根據(jù)抗性頻數(shù)分布圖（圖3）可以得知，大部分的EC50分布在1～5 ?g/mL，其中敏感菌株為28.571%，低抗菌株為52.38%，中抗菌株為19.048%，沒(méi)有高抗菌株。

3 ?結(jié)論與討論

二甲酰亞胺類(lèi)殺菌劑腐霉利，在20世紀(jì)70年代曾被認(rèn)為是苯并咪唑類(lèi)藥物的最佳替代品。早在1971年Bollen和Scholten[12]就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了苯并咪唑類(lèi)的抗藥性菌株，而二甲酰亞胺抗藥性菌株的發(fā)現(xiàn)大多集中在八九十年代。1992年Moorman和Lease[13]調(diào)查了13個(gè)賓夕法尼亞州的種植園，發(fā)現(xiàn)苯并咪唑類(lèi)和二甲酰亞胺類(lèi)的抗藥性菌株，并且發(fā)現(xiàn)雙抗菌株，1996～1997年，Yourman和Jeffers[14]從35個(gè)保護(hù)地325株灰霉菌株中，發(fā)現(xiàn)69%的菌株對(duì)二甲酰亞胺類(lèi)農(nóng)藥乙烯菌核利有抗藥性，而對(duì)苯并咪唑類(lèi)和二甲酰亞胺類(lèi)的雙重抗藥性菌株達(dá)67%。根據(jù)1997年英國(guó)人LaMondia和Douglas[15]報(bào)道，45株灰霉菌中有43%對(duì)二甲酰亞胺類(lèi)農(nóng)藥乙烯菌核利存在抗藥性。這說(shuō)明，自20世紀(jì)90年代以來(lái)，二甲酰亞胺類(lèi)殺菌劑的抗藥性問(wèn)題越來(lái)越突出。

本實(shí)驗(yàn)室自20世紀(jì)90年代開(kāi)始監(jiān)測(cè)灰霉病菌的抗藥性，1997年曾對(duì)腐霉利的抗藥性進(jìn)行過(guò)報(bào)道[8]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EC50值在1.1598～4.5631之間，全部為低水平抗性菌株，未檢測(cè)到高水平抗性菌株。本次檢測(cè)結(jié)果EC50有66.67%分布在1～6 ?g/mL之間，其中低抗菌株為52.38%、中抗菌株為19.048%，沒(méi)有高抗菌株。與十幾年前的檢測(cè)結(jié)果相比，經(jīng)過(guò)10余年的用藥，其EC50的范圍波動(dòng)不大，但是抗性頻率、抗性水平明顯提高。結(jié)果中聊城地區(qū)灰霉菌株抗藥性頻率為0%，可能與采樣范圍及其代表性有關(guān)。抗藥性的產(chǎn)生，主要是因?yàn)榉N植者在一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)內(nèi)持續(xù)使用同一種殺菌劑，使病菌面臨強(qiáng)大的選擇壓力產(chǎn)生抗性菌株。近年來(lái)由于乙霉威、嘧霉胺、嘧菌環(huán)胺等不同類(lèi)型殺菌劑的交替使用，延緩了腐霉利抗藥性的大面積發(fā)生。生產(chǎn)上，應(yīng)該綜合應(yīng)用農(nóng)業(yè)措施、生態(tài)治理、生物防治以及輪換使用不同類(lèi)型的化學(xué)殺菌劑來(lái)防治灰霉病，避免連續(xù)使用單一的化學(xué)殺菌劑以免病菌產(chǎn)生抗藥性導(dǎo)致防治失敗。

參考文獻(xiàn)

[1] Jarvis W R. Botryotinia and Botrytis species： taxonomy， physiology and pathogenicity： a guide to the literature[M]. Canada： Canada Department of agriculture，1977：1-20.

[2] 齊軍山，張悅麗，張博，等.設(shè)施番茄灰霉病綠色防控技術(shù)[J].中國(guó)蔬菜，2013（15）：26-27.

[3] Joel Davis， Daozhan Yu， Wendy Evans， et al. Mapping of loci from Solanum lycopersicoides conferring resistance or susceptibility to Botrytis cinerea in tomato[J] Theor Appl Genet，2009，119：305-314.

[4] Zhonghua Ma， Themis J. Michailides， Genetic structure of Botrytis cinerea populations from different host plants in California[J]. Plant Disease，2005，89（10）：1083-1089.

[5] Cheryl L Lennox， Robert A. Spotts. Sensitivity of populations of from pear related sources to benzimidazole and dicarboximide fungicides [J] ，Plant Disease，2003，87（6）：645-649.

[6] 王春艷.草莓灰霉病發(fā)生危害及防治研究初報(bào)[J].植物保護(hù)，1997，23（3）：32-33.

[7] 劉波，葉鐘音.速克靈抗性灰霉病菌菌株性質(zhì)的研究[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào)，1992，19（4）：297-302.

[8] 李林.山東省灰霉菌對(duì)速克靈、多菌靈田間抗性檢測(cè)研究初報(bào)[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997（3）：32-35.

[9] 丁中，劉峰，王會(huì)利，等.番茄灰霉菌的多重抗藥性研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2001，32（4）：452-456.

[10] Yarden O， Katan T. Mutations leading to substitutions at aminoacids 198 and 200 of beta-tubulin that correlatewith benomyl resistance phenotypes of field strain of Botrytis cinerea[J]. Phyto pathology，1993，83：1478-1483.

[11] 韓巨才，閆秀琴，劉慧平，等.灰霉病原菌對(duì)速克靈的抗性監(jiān)測(cè)[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2003，23（4）：299-302.

[12] Bollen G J， Scholten G. Acquired resistance to benomyl and some other systemic fungicides in a strain of Botrytis cinerea in cyclamen[J]. Neth J Pl Path，1971，77（2）：83-90.

[13] Gary W Moorman， Roxanne J. Lease， Benzimidazole and dicarboximide resistant Botrytis cinerea from Pennsylvania greenhouses [J]. Plant Disease，1992，76（5）：477-480.

[14] Yourman L F， Jeffers S N. Resistance to benzimidazole and dicarboximide fungicides in greenhouse isolate of Botrytis cinerea[J]. Plant Disease，1999，83（6）：569-575.

[15] Lamondia J A， Douglas S M. Sensitivity of Botrytis cinerea from onnecticut green houses to benzimidazole and dicarboximide Fungicides [J]. Plant Disease，1997，81（7）：729-732.