朱楠等

摘 要 采用卡寶品紅染色壓片法對(duì)黃花煙草（Nicotiana rustica）、栽培煙草（Nicotiana tabacum L. Var. K326）和殘波煙草（Nicotiana repanda）的小孢子發(fā)生發(fā)育過(guò)程進(jìn)行研究。結(jié)果表明：黃花煙草、栽培煙草K326及殘波煙草小孢子發(fā)生和發(fā)育過(guò)程的胞質(zhì)分裂皆為同時(shí)型，四分體有十字交叉型、正四面體型和左右對(duì)稱型3種構(gòu)型，成熟花粉粒為2細(xì)胞型。3種煙草小孢子發(fā)生發(fā)育過(guò)程基本正常，但不同程度地出現(xiàn)了減數(shù)分裂異?，F(xiàn)象，如同一花藥內(nèi)小孢子發(fā)育不同步以及同一細(xì)胞內(nèi)染色體步調(diào)不一致、染色體橋、染色體落后、微核等。

關(guān)鍵詞 煙草；小孢子；雄配子體；減數(shù)分裂

中圖分類號(hào) S572 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Microsporogenesis and Male Gametophytic Development

of Three Species of Nicotiana

ZHU Nan1， LIAO Jugou1， SONG Biqing2， SUO Wenlong2

YAO Heng3， CHEN Suiyun1 *， MA Wenguang3 *

1 School of Life Science， Yunnan University， Kunming， Yunnan 650091， China

2 Yuxi Zhongyan Tobacco Seed Co.， Ldt.， Yuxi， Yunnan 653100， China

3 Tobacco Research Institute， Yuxi， Yunnan 653100， China

Abstract The microsporogenesis and development of male gametophyte of Nicotiana rustica， Nicotiana tabacum L. Var. K326 and Nicotiana repanda were observed via light microscopy after staining with carbolfuchs. Results showed that ： meiosis in microspore was simultaneous cytokinesis in the development of male gametophyte of Nicotiana tabacum L. Var. K326， Nicotiana rustica and Nicotiana repanda. Cytokinesis at meiosis of microspore mother cells was simultaneous and tetrads were mostly decussate， tetrahedral and isobilateral. The mature pollens belong to 2 cells type. Microsporogenesis and development of male gametophyte of different tobacco are in common with those of others. However， the phases of meiosis of microspore mother cells in some cultivars developed abnormally in the same microsporangium to some extent. The chromosomes were out of step in the same cell， with laggard chromosomes， chromosome bridges or micronucleus.

Key words Nicotiana； Microsporogenesis； Male gametophyte； Meiosis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.04.004

煙草隸屬雙子葉植物綱（Dicotyledoneae），茄科（Solanaceae），煙草屬（Nicotiana）[1]。煙草屬包括3個(gè)亞屬：黃花煙亞屬（Rustica）、普通煙亞屬（Tabacum）和碧冬煙亞屬（Petuuioides），共計(jì)66個(gè)種。黃花煙草為黃花煙草亞屬（Rustica）黃花煙草組（Rusticae）中僅有的1個(gè)種，原產(chǎn)于南美洲，是我國(guó)栽培利用的重要煙草種之一[2]。普通煙亞屬中的栽培品種K326（Nicotiana tabacum L. Var. K326）是廣泛種植的烤煙品種[3]，栽培煙草遺傳基礎(chǔ)狹窄，對(duì)許多病蟲害不具抗性[4]。N. repanda W.屬于碧冬煙亞屬，對(duì)多種病蟲害等具有高抗性，是栽培煙草改良的天然基因庫(kù)[5]。目前對(duì)煙草的研究主要集中在抗病性[6]、栽培模式[7]、環(huán)境調(diào)控技術(shù)[8]、基因組學(xué)[9]等方面。煙草大小孢子的發(fā)生發(fā)育過(guò)程直接影響該物種的生殖和繁衍，決定著煙草種質(zhì)資源的保持和開發(fā)利用?？导t梅[10]等研究了煙草大孢子發(fā)生發(fā)育過(guò)程，但針對(duì)煙草小孢子發(fā)育相關(guān)的研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)對(duì)3種不同煙草的小孢子發(fā)生發(fā)育過(guò)程進(jìn)行觀察比較，以期為煙草的系統(tǒng)分類、遺傳育種、種質(zhì)資源優(yōu)化等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為種植于昆明市官渡區(qū)試驗(yàn)田的黃花煙草、栽培煙草K326、殘波煙草。材料于2011年8月移栽，花期為2011年9月至2011年11月。在現(xiàn)蕾期分別采集各種煙草生長(zhǎng)直徑短于0.5 cm的花蕾各30朵，放入Carnoy固定液（無(wú)水酒精 ∶ 冰乙酸=3 ∶ 1）固定24 h后，轉(zhuǎn)移到70%的酒精中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

將準(zhǔn)備好的材料轉(zhuǎn)入45%的冰乙酸中軟化20 min，按花蕾的大小不同分類，由小到大取出花藥，分別置于干凈的載玻片中央，滴加少量卡寶品紅，用鑷子擠壓出花粉粒，蓋上蓋玻片，壓片，置于Olympus顯微鏡下觀察及拍照[11]。

2 結(jié)果與分析

3種煙草花均為兩性花，每朵花5個(gè)花藥，每個(gè)花藥具4個(gè)花粉囊。在花蕾早期，花粉囊內(nèi)表皮下的孢原細(xì)胞首先進(jìn)行1次平周分裂，形成兩層細(xì)胞，即外層的初生壁細(xì)胞和內(nèi)層的造孢細(xì)胞。初生壁細(xì)胞進(jìn)行平周分裂形成內(nèi)外兩層次生壁細(xì)胞，連同外面的表皮共3層細(xì)胞。同時(shí)造孢細(xì)胞也不斷分裂分化而形成次生造孢組織。次生造孢細(xì)胞排列緊密、體積大、胞質(zhì)濃厚、核仁大而顯著， 由其進(jìn)行不斷的分裂分化而發(fā)育形成小孢子母細(xì)胞。小孢子母細(xì)胞周圍開始沉積胼胝質(zhì)，最終形成一層胼胝質(zhì)壁，隨著胼胝質(zhì)壁不斷增厚，它由不規(guī)則的形狀變成圓形，隨后彼此分離開始進(jìn)入減數(shù)分裂期。減數(shù)分裂前核內(nèi)出現(xiàn)一團(tuán)明顯的細(xì)絲狀染色質(zhì)，并與核仁連在一起處于核的一側(cè)，可作為減數(shù)分裂起始的標(biāo)志。黃花煙草小孢子的減數(shù)分裂與其他兩個(gè)煙草種基本相似，在此以黃花煙草減數(shù)分裂和小孢子發(fā)育過(guò)程為例闡述三者之間的共性。

2.1 黃花煙草小孢子減數(shù)分裂過(guò)程

減數(shù)第一次分裂前細(xì)線期（圖版Ι-1），此時(shí)細(xì)胞核腔內(nèi)充滿了細(xì)長(zhǎng)、線狀的染色體，細(xì)胞核和核仁增大，隨后細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂前期中的細(xì)線期。緊接著細(xì)胞內(nèi)的同源染色體兩兩配對(duì)，為偶線期（圖版Ι-2）。染色體繼續(xù)縮短變粗，即進(jìn)入粗線期，在此期間，四分體中的姐妹染色單體之間發(fā)生了DNA片段的交換，導(dǎo)致其父本和母本之間遺傳信息的互換，導(dǎo)致基因重組。隨后細(xì)胞中發(fā)生交叉的染色單體開始分開，進(jìn)入雙線期（圖版Ι-3）。染色單體分開后，染色體變成緊密凝集的狀態(tài)向核四周靠近。核膜、核仁消失，紡錘體形成，進(jìn)入終變期（圖版Ι-4）。之后小孢子母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂中期I（圖版Ι-6），該時(shí)期中各成對(duì)的同源染色體雙雙移向細(xì)胞中央的赤道板，著絲點(diǎn)依次成對(duì)排列在赤道板兩側(cè)。在紡錘體的牽引下，成對(duì)的同源染色體各自發(fā)生分離，分別移向兩極，即后期（圖版Ι-8）。到達(dá)兩極的同源染色體又凝聚起來(lái)，核膜、核仁重新出現(xiàn)，細(xì)胞分裂進(jìn)入末期（圖版Ι-9），此時(shí)細(xì)胞質(zhì)不分裂，形成一個(gè)雙核細(xì)胞。這個(gè)雙核細(xì)胞中每個(gè)細(xì)胞核染色體數(shù)目只有原來(lái)母細(xì)胞的一半。有雙核的細(xì)胞緊接著發(fā)生第二次減數(shù)分裂，進(jìn)入減數(shù)第二次分裂前期（圖版Ι-10），細(xì)胞中兩個(gè)核附近的染色體散亂分布，隨后再次凝聚，核膜、核仁再次消失，紡錘體形成。接著染色體著絲點(diǎn)排列到細(xì)胞中央的赤道板上，即減數(shù)第二次分裂中期（圖版Ι-12）。其染色體形態(tài)和減數(shù)分裂中期I大致相同，但不存在同源染色體。之后每條染色體著絲點(diǎn)分離，兩條姐妹染色單體分開，成為兩條染色體。它們?cè)诩忓N絲的牽引下移向細(xì)胞的兩極，即后期（圖版Ι-14），末期核膜、核仁重新出現(xiàn)，到達(dá)兩極的染色體分別進(jìn)入兩個(gè)子細(xì)胞。

2.2 黃花煙草雄配子體發(fā)育過(guò)程

減數(shù)第二次分裂后，四核細(xì)胞最初被共同的胼胝質(zhì)包圍，隨著細(xì)胞板的形成，四核細(xì)胞發(fā)生胞質(zhì)分裂，小孢子四分體形成，在3種煙草中都觀察到十字交叉型（圖版Ι-16）、左右對(duì)稱型（圖版Ι-17）和正四面體型（圖版Ι-18）的四分體，3種煙草小孢子四分體的3種排列形式的頻率統(tǒng)計(jì)見表1。剛釋放出來(lái)的小孢子細(xì)胞壁較薄、富含原生質(zhì)、核居中、無(wú)萌發(fā)孔，即單核居中期（圖版Ι-21）。隨著小孢子的繼續(xù)發(fā)育，由解體絨氈層供給其營(yíng)養(yǎng)，小孢子細(xì)胞壁逐漸增厚，出現(xiàn)中央液泡，單核被液泡推向細(xì)胞邊緣，出現(xiàn)3個(gè)萌發(fā)孔，即單核靠邊期（圖版Ι-22）。此時(shí)細(xì)胞原生質(zhì)濃厚，細(xì)胞分裂更加旺盛，緊接著小孢子進(jìn)行有絲分裂，形成一個(gè)較大的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和一個(gè)較小的生殖細(xì)胞，即二核靠邊期（圖版Ι-23）。其中營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)富含淀粉、脂類等物質(zhì)，為花粉管的萌發(fā)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。即煙草的單核小孢子通過(guò)先進(jìn)行1次正常的非均等分裂，然后通過(guò)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞反復(fù)分裂的發(fā)育途徑進(jìn)行發(fā)育[12]。由于壁物質(zhì)的不均等加厚，此時(shí)整個(gè)花粉粒外壁形成一個(gè)弓形隔壁，不久弓形壁消失，發(fā)育為成熟花粉粒（圖版Ι-24），此時(shí)花粉內(nèi)營(yíng)養(yǎng)核和生殖細(xì)胞占據(jù)大部分體積，在后期花粉內(nèi)將積累淀粉粒和脂肪。

2.3 煙草小孢子發(fā)生發(fā)育過(guò)程出現(xiàn)的異常現(xiàn)象

對(duì)3種煙草的小孢子發(fā)生發(fā)育過(guò)程觀察結(jié)果表明：3種煙草小孢子發(fā)生發(fā)育過(guò)程基本正常，但少數(shù)細(xì)胞中出現(xiàn)了染色體橋、染色體滯后、不同步和微核等異常現(xiàn)象，不同種煙草出現(xiàn)異常類型和比率有差異。

2.3.1 染色體橋 染色體橋是由于正常的染色體同倒位染色體之間發(fā)生交叉互換，使配子染色體上某一區(qū)段缺失或重復(fù)，導(dǎo)致子代出現(xiàn)異常性狀。對(duì)栽培煙草K326的小孢子發(fā)育過(guò)程觀察后發(fā)現(xiàn)，少數(shù)細(xì)胞在其減數(shù)第一次分裂后期Ⅰ出現(xiàn)染色體橋（圖版Ⅱ-9），出現(xiàn)染色體橋的細(xì)胞占有絲分裂細(xì)胞總數(shù)的0.05%（表2），黃花煙草和殘波煙草小孢子發(fā)生發(fā)育過(guò)程未觀察到染色體橋出現(xiàn)。

2.3.2 染色體滯后 染色體滯后是由于受外界環(huán)境的影響，少數(shù)染色體不能進(jìn)一步分裂，在同一有絲分裂中期或后期以染色單體的形式表現(xiàn)出來(lái)。在對(duì)黃花煙草、栽培煙草、殘波煙草3個(gè)煙草種小孢子減數(shù)第一次分裂中期（圖版Ⅰ-7；圖版Ⅱ-7；圖版Ⅲ-8）和減數(shù)第二次分裂中期（圖版Ⅰ-13；圖版Ⅱ-14；圖版Ⅲ-14）的觀察中發(fā)現(xiàn)，3種煙草均出現(xiàn)個(gè)別染色體滯后的現(xiàn)象，3種所觀察出現(xiàn)的概率統(tǒng)計(jì)分別為0.1%、0.05%、0.07%（表2）。

2.3.3 微核 微核（micronucleus，MCN）是出現(xiàn)在主核旁邊體積通常小于主核1/3的小核，它是真核類生物細(xì)胞中染色體畸變形成的一種異常結(jié)構(gòu)。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到在殘波煙草小孢子發(fā)育四分體時(shí)期有微核的出現(xiàn)（圖版Ⅲ-11、16），出現(xiàn)微核的細(xì)胞比率為0.08%（表2）。初步推測(cè)殘波煙草微核的形成有兩方面的原因：一可能是殘波煙草小孢子在減數(shù)分裂時(shí)期，由于分裂間期產(chǎn)生的染色體斷片在分裂過(guò)程中不能與正常染色體協(xié)同活動(dòng)，在進(jìn)入分裂期時(shí)，被排斥在主核周圍形成不規(guī)則的染色質(zhì)團(tuán)（圖版Ⅲ-5），占統(tǒng)計(jì)細(xì)胞比率為7%（表2）。有的染色體質(zhì)團(tuán)會(huì)被包埋在主核內(nèi)（圖版Ⅲ-4），所占細(xì)胞比率統(tǒng)計(jì)為：0.8%（表2）。隨后發(fā)育成微核。二則可能是減數(shù)分裂過(guò)程中形成的滯后染色體在分裂末期形成微核。出現(xiàn)微核的細(xì)胞普遍出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)著色淺、透光性較強(qiáng)，而且細(xì)胞核體積縮小，染色質(zhì)染色較深，染色質(zhì)呈現(xiàn)部分或者全部凝集。其他兩個(gè)煙草品種有滯后染色體出現(xiàn)，卻未發(fā)現(xiàn)有微核的形成，可能是所觀察的細(xì)胞數(shù)量不足。

2.3.4 減數(shù)分裂節(jié)奏高度不同步 在對(duì)3種煙草小孢子壓片觀察后發(fā)現(xiàn)：小孢子發(fā)育不同步包括同一花藥的不同花粉囊中發(fā)育時(shí)期不同以及同一花粉囊中不同小孢子分裂的進(jìn)程也不一致（圖版Ⅰ-25；圖版Ⅱ-21；圖版Ⅲ-21），一張制片上往往能觀察到3～5個(gè)分裂相，在殘波煙草的小孢子減數(shù)分裂過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，同一視野中出現(xiàn)了減數(shù)第二次分裂間期的小孢子母細(xì)胞和已經(jīng)發(fā)育成熟的花粉粒；小孢子發(fā)育不同步還包括同一細(xì)胞中染色體步調(diào)不一致，如在殘波煙草減數(shù)第二次分裂中后期同一細(xì)胞中2組染色體步調(diào)不一致（圖版Ⅲ-15）。

3 討論

3.1 3種煙草小孢子發(fā)育的異同及其意義

本研究通過(guò)對(duì)3種煙草小孢子發(fā)生發(fā)育過(guò)程的觀察發(fā)現(xiàn)：3種煙草小孢子的發(fā)生均從孢原細(xì)胞開始，經(jīng)過(guò)造孢細(xì)胞、小孢子母細(xì)胞、四分體、小孢子和單核花粉粒等發(fā)育階段，最后形成二核花粉。胞質(zhì)分裂為同時(shí)型，小孢子四分體排列有十字交叉型、正四面體型和左右對(duì)稱型，成熟的花粉粒包含一個(gè)較大的營(yíng)養(yǎng)核和一個(gè)較小的生殖核。這與Sunderland[12]對(duì)芍藥屬、大麥屬、煙草屬和曼陀羅屬等植物的觀察并提出了二型花粉的假設(shè)基本一致。也符合Palmer C E[13]早在煙草花藥培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)第1次分裂為不對(duì)稱的觀點(diǎn)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)論初步表明3種煙草具有較高的同源性。

3.2 小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂的異常與小孢子的育性

3種煙草小孢子發(fā)生發(fā)育過(guò)程類似且發(fā)育過(guò)程基本正常，少數(shù)細(xì)胞中出現(xiàn)了染色體橋、染色體滯后、微核和染色體不同步現(xiàn)象，但這些異常現(xiàn)象不影響3種煙草正常的生殖繁育過(guò)程。

栽培煙草K326的小孢子發(fā)育過(guò)程中觀察到染色體橋，染色體橋在染色體移向兩極進(jìn)入子細(xì)胞時(shí)被拉斷，斷片不能進(jìn)入子細(xì)胞的核內(nèi)，在分裂的后期可能形成微核導(dǎo)致小孢子不育。殘波煙草小孢子發(fā)育四分體時(shí)期少數(shù)細(xì)胞中有微核出現(xiàn)，這部分細(xì)胞通常有較密集的核固縮，無(wú)法進(jìn)行正常的有絲分裂，導(dǎo)致細(xì)胞早期凋亡，形成不可育的配子。有研究表明生活污水中的有機(jī)物及各種毒害成分誘發(fā)蠶豆微核率顯著增加[14]。推測(cè)殘波煙草小孢子發(fā)生發(fā)育過(guò)程較其他兩個(gè)種小孢子發(fā)育更易受外界環(huán)境條件影響。

3種煙草均在不同比率的細(xì)胞中觀察到滯后染色體，滯后染色體成因可能是由于雜種起源的植物物種，根據(jù)兩親本的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近而表現(xiàn)出不同的異質(zhì)性，引起染色體間同源性表現(xiàn)差異，導(dǎo)致減數(shù)分裂過(guò)程表現(xiàn)出異常[15]；另外，外界環(huán)境的改變也會(huì)導(dǎo)致滯后染色體的產(chǎn)生，有研究表明在pH與Al的作用下，細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)滯后染色體導(dǎo)致減數(shù)分裂畸變效應(yīng)[16]。染色體落后會(huì)使所形成的二分體染色體數(shù)目不相等或不能形成正常的四分體，以致這部分煙草小孢子母細(xì)胞在早期或雙核前期發(fā)生敗育現(xiàn)象，這與楊弘遠(yuǎn)[17]認(rèn)為雙子葉植物小孢子敗育大都偏早的觀點(diǎn)一致。

3種煙草小孢子均出現(xiàn)減數(shù)分裂高度不同步現(xiàn)象，推斷其原因可能是由于減數(shù)分裂進(jìn)入前期Ι、中期Ι時(shí)，花粉母細(xì)胞的初始細(xì)胞壁便完全消失，同時(shí)形成胼胝質(zhì)壁使細(xì)胞間的聯(lián)系消失，并且胼胝質(zhì)壁的形成也不同步，結(jié)果每個(gè)小孢子母細(xì)胞在孤立的環(huán)境中進(jìn)行減數(shù)分裂，細(xì)胞的個(gè)體差異得到充分體現(xiàn)。這是花藥內(nèi)部發(fā)育協(xié)調(diào)性差異的表現(xiàn)，是一種比較原始的特性[18]。這種特性可以延長(zhǎng)花期，增加兩性功能相互作用的時(shí)間，對(duì)于其物種的繁衍具有重要的意義[15]，但也可能導(dǎo)致小孢子發(fā)育異常。

針對(duì)小孢子雄核發(fā)生發(fā)育的細(xì)胞生物學(xué)研究對(duì)煙草生殖生物和遺傳育種具有重要的指導(dǎo)意義，但今后還應(yīng)該從生理學(xué)和遺傳學(xué)等角度，考慮基因型[19]、絨氈層[20]、低溫[21]等很多內(nèi)外因素對(duì)小孢子發(fā)生發(fā)育的影響，以更全面科學(xué)的指導(dǎo)煙草的栽培育種實(shí)踐。

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