豐金玉等

摘 要：以‘桃源大葉茶1芽2葉為材料，研究多酚氧化酶、過氧化物酶和β-葡萄糖苷酶在工夫紅茶加工工藝中的動態(tài)變化，分析加工葉水分含量對3種酶酶活性的影響，以期為高香高茶黃素紅茶的加工提供參考。結(jié)果表明，隨著萎凋時間延長，3種酶酶活性均呈現(xiàn)不同程度的增加，萎凋14 h后，多酚氧化酶酶活性達到鮮葉的2.9倍，過氧化物酶酶活性達到鮮葉的3.5倍，β-葡萄糖苷酶活性達到鮮葉的2.1倍，在揉捻、發(fā)酵、干燥工藝中，3種酶活性不同程度地下降。根據(jù)研究結(jié)果可推斷，β-葡萄糖苷酶對紅茶香氣品質(zhì)的影響主要表現(xiàn)在萎凋過程及發(fā)酵早期，多酚氧化酶、過氧化物酶對紅茶滋味品質(zhì)的影響主要集中在發(fā)酵工藝，可依據(jù)萎凋葉中3種酶的活性變化程度及失水情況，確定萎凋適度的標準，依據(jù)發(fā)酵葉中的多酚氧化酶與過氧化物酶的比值變化情況，確定發(fā)酵適度的標準。

關鍵詞：茶葉加工；紅茶；多酚氧化酶；過氧化物酶；β-葡萄糖苷酶

中圖分類號：S571.1 文獻標志碼：A 論文編號：2014-0292

Activity Changes of Polyphenol Oxidase， Peroxidase and β-Glycosidase in Black Tea Processing

Feng Jinyu1， Liu Kunyan1， Qin Yu1， Xiong Shuo1， Deng Yanli1， Gong Zhihua1， Xiao Wenjun1，2

（1Hunan Agricultural University， Changsha 410128， Hunan， China；

2Changsha Herun Tea Industry Technology Ltd， Changsha 410128， Hunan， China）

Abstract： By using one bud two leaves of ‘Taiyuan big leaf species in the summer as materials， the dynamic activity changes of polyphenol oxidase， peroxidase and β-glycosidase in processing black tea and the effect of water moisture of processing leaves on the enzyme was studied in order to provide reference for processing high incense and high theaflavins black tea. The results showed that with the extension of withering time， the activity of the three enzymes increased differently， after 14 hours withering， polyphenol oxidase activity increased 2.9 times， peroxidase activity increased 3.5 times， and β-glycosidase activity increased 2.1 times. In rolling， fermentation， drying process， the activity of three kind enzymes decreased differently. According to the results， it could be inferred that β-glycosidase affected aroma quality of black tea mainly in the process of fermentation and early withering， polyphenol oxidase， peroxidase affected the taste quality of black tea mainly in the process of fermentation. According to the degree of activity change the three kind enzyme and the condition of water loss in the withering leaves， the appropriate criteria black tea processing could be determined， and the appropriate criteria of fermentation also could be determined according to the ratio changes of polyphenol oxidase and peroxidase.

Key words： Tea Processing； Black Tea； Polyphenol Oxidase； Peroxidase； β-Glycosidase

0 引言

多酚氧化酶（PPO）、過氧化物酶（POD）和β-葡萄糖苷酶是紅茶加工中影響紅茶色、香、味品質(zhì)形成的3種關鍵酶[1-2]，其中，PPO主要影響茶黃素的酶促合成，POD主要影響茶黃素的酶促過氧化，β-葡萄糖苷酶則主要影響糖苷類香氣物質(zhì)的釋放，因而如何科學調(diào)控3種酶的活性并加工高香高茶黃素紅茶，是紅茶加工化學和品質(zhì)化學的重點。Bokuchava等[3]、竹尾忠一等[4-5]研究表明，PPO、POD在茶鮮葉的萎凋、揉捻工藝中，活性逐漸增加，且揉捻葉酶活性高達茶鮮葉酶活性的2～3倍。阮宇成等[6]通過紅碎茶加工中PPO活性及同工酶的變化研究，得到了類似的結(jié)果。劉莉華等[7]對祁門傳統(tǒng)功夫紅茶和紅碎茶加工中β-葡萄糖苷酶的活性變化進行比較研究，認為β-葡萄糖苷酶在加工紅碎茶的萎凋結(jié)束時酶活最高，以后持續(xù)下降，而在加工功夫紅茶的揉捻階段酶活最高。王沁[8]、陳向東[9]、宛曉春[10]等研究表明，β-葡萄糖苷酶適宜于酸性介質(zhì)。Takao等[11-12]研究顯示，β-葡萄糖苷酶可將結(jié)合態(tài)萜烯醇類和芳樟醇類轉(zhuǎn)化為游離態(tài)。可見，相關研究主要集中于影響紅茶滋味品質(zhì)或香氣品質(zhì)中某一類酶及其在萎凋、揉捻工藝中的動態(tài)變化，而對同時研究影響紅茶滋味品質(zhì)與香氣品質(zhì)的多酶類，及其在紅茶加工的發(fā)酵關鍵工藝與干燥工藝的酶活性變化，則鮮見報道。筆者以適制紅茶的‘桃源大葉茶1芽2葉為原料，研究了PPO、POD和β-葡萄糖苷酶在工夫紅茶各加工工藝中的動態(tài)活性變化，分析加工葉水分含量對各酶酶活性的影響，以期為高香高茶黃素紅茶的加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 ‘桃源大葉茶1芽2葉新梢，采自湖南農(nóng)業(yè)大學長安教學實習基地。

1.1.2 試劑 PVPP（不溶性聚乙烯吡咯烷酮），pH 7.0的檸檬酸磷酸緩沖液，0.3%愈創(chuàng)木酚，0.3%過氧化氫，pH 5.6的磷酸檸檬酸緩沖液，0.1%脯氨酸，1%鄰苯二酚，6 mol/L尿素，pH 6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液， 10 mol/L PNPG（對硝基苯-β-D-葡萄糖苷），1 mol/L Na2CO3。

1.2 主要儀器設備

H-2050R臺式高速冷凍離心機（長沙市八方科學儀器有限公司），SB-3200DTD超聲波清洗機（寧波新藝生物科技股份有限公司），HH.W21-600A數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋（金壇市金城國勝試驗儀器廠），UV-2000紫外可見光分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司），DHG.9246A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏試驗設備有限公司），6CR-40茶葉揉捻機（浙江上洋機械有限公司），272-1型干濕球濕度計（上海華辰醫(yī)用儀表廠）。

1.3 方法

1.3.1 工夫紅茶加工 采摘‘桃源大葉茶1芽2葉新梢，薄攤于25～28℃（空調(diào)控制）下萎凋14 h左右，隔4、6、4 h分別取樣1次；萎凋葉在揉捻機上揉捻60 min，在 30 min時取樣1次；揉捻葉攤放于竹盤，上蓋濕潤的紗布，在30℃、90%相對濕度條件下發(fā)酵，隔1、1.5、1 h各取樣1次；發(fā)酵葉置于恒溫干燥箱中于110℃下烘至7成干，取樣1次，攤涼，再在80℃下烘至足干，隔0.5、1.5 h分別取樣1次。

取樣編號：1（萎凋0 h），2（萎凋4 h），3（萎凋10 h），4（萎凋14 h），5（揉捻，發(fā)酵0 h），6（發(fā)酵1 h），7（發(fā)酵2.5 h），8（發(fā)酵3.5 h，干燥0 h），9（干燥1 h），10（干燥1.5 h），11（干燥2.5 h）。取樣后，各樣品迅速用錫箔紙包裹并標號，置于液氮罐中進行低溫處理1～2 min，然后取出保存于-40℃低溫冰箱中，備用。

1.3.2 PPO酶液制備及活性測定 在參照王偉偉等[13]方法的基礎上稍作改動：將1.25 g樣品加0.75 g PVPP、適量石英砂和適量pH 5.6的磷酸檸檬酸緩沖液，冰浴研磨成漿，定容，浸提12 h；4000 r/15 min離心，上清液定容至25 mL，即酶液。取酶液1 mL加入反應混合液3 mL（反應混合液按pH 5.6檸檬酸磷酸緩沖液：0.1%脯氨酸：1%鄰苯二酚=10：2：3），37℃恒溫水浴保溫 10 min，立即加入6 mol/L尿素溶液3 mL終止反應，460 nm波長處用10 mm比色皿比色，空白混合液中用pH 5.6的緩沖液代替鄰苯二酚，酶活以每克樣每分鐘E460增加0.1為1個活力單位。

1.3.3 POD酶液制備及活性測定 在參照王偉偉等方法的基礎上稍作改動：將1.25 g樣品加 0.75 g PVPP、適量石英砂和適量pH 7.0的檸檬酸磷酸緩沖液，冰浴研磨成漿，定容，浸提12 h；4000 r/15 min離心，上清液定容至25 mL，即酶液。試管中加入0.3%愈創(chuàng)木酚 1 mL，緩沖液1.5 mL，酶液0.5 mL，搖勻后加0.3%過氧化氫1 mL，用水代替愈創(chuàng)木酚做空白，在35℃恒溫水浴保溫4 min，立即取出，然后用10 mm比色皿于 470 nm波長處測光密度，從反應開始5 min時立即讀數(shù)，酶活以每克樣每分鐘E470增加0.1為1個活力單位。

1.3.4 β-葡萄糖苷酶酶液制備及活性測定 在參照王迎春等[14]方法的基礎上稍作改動：稱取茶鮮葉2.5 g，加等量PVPP 2.5 g，0.1 mol/L pH 6.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液20 mL，冰上研磨成糊狀；10000 r/min，4℃離心5 min；上清液移至另一離心管中，14000 r/min，4℃離心10 min；上清液移用緩沖液定容至一定體積（100 mL），搖勻，4℃貯存?zhèn)溆?。在試管中依次加?.6 mL pH 6.0的緩沖液、0.2 mL 10 mol/L PNPG、稀釋后酶液0.2 mL；將試管置于恒溫水浴中，37℃溫水浴30 min，加入 2.0 mL 1 mol/L Na2CO3終止反應；用緩沖液代替酶液做空白，405 nm測吸光度值，酶活以每克樣每分鐘E405增加0.1為1個活力單位。

1.3.5 加工葉含水量測定 參照國家標準（GB 8304—2002）茶 水分測定[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅茶加工中PPO與POD活性的動態(tài)變化

圖1顯示，PPO在萎凋期間活性隨萎凋時間的延長而增加，萎凋結(jié)束時PPO活性增加至5.59 0.1△OD/（g·min），達到鮮葉PPO活性的2.9倍；經(jīng)揉捻工序后，由于細胞的破損，酶促氧化開始，酶活性開始呈下降趨勢，相比萎凋工序降幅達37%；發(fā)酵過程中PPO活性降幅雖沒有揉捻工序大，但是由于PPO催化氧化鄰苯二酚、兒茶素等形成鄰醌，鄰醌等物質(zhì)反過來又抑制PPO的活性，使得PPO活性出現(xiàn)明顯的下降，酶活性從揉捻時的3.52 0.1△OD/（g·min）降至發(fā)酵完成時的1.30 0.1△OD/（g·min）；干燥工藝的前1 h內(nèi)，酶活性下降59%，干燥工藝后，紅茶中的酶活性仍有0.26 0.1△OD/（g·min）。

由圖1亦可知，萎凋期間POD活性逐步增強，特別是在萎凋后期，達到鮮葉POD酶活性的3.5倍，增幅最大；萎凋葉一經(jīng)揉捻，葉細胞破損，底物與酶蛋白大量接觸，酶活性大幅下降，揉捻后，酶活性降至萎凋葉的80%左右；發(fā)酵過程中，酶活性持續(xù)下降趨勢，茶黃素的過氧化開始，逐步向茶紅素、茶褐素方向發(fā)展，且發(fā)酵前期酶活性下降速度較后期快；干燥后POD活性受高溫影響，活性鈍化，從發(fā)酵完成時的7.68 0.1△OD/（g·min）降低到干燥結(jié)束時的1.32 0.1△OD/（g·min）。

2.2 紅茶加工中β-葡萄糖苷酶活性的動態(tài)變化

圖2表明，萎凋期間，由于細胞失水，β-葡萄糖苷酶及其作用底物的相對濃度升高，酶活性不斷增加，萎凋14 h后，β-葡萄糖苷酶活性達32.42 0.1△OD/（g·min），達鮮葉β-葡萄糖苷酶活性的2.1倍；揉捻過程中，茶葉組織細胞破損，底物和酶開始接觸并發(fā)生酶促反應，揉捻結(jié)束時酶活性降低了19%，從萎凋后的最大值32.42 0.1△OD/（g·min）降低到26.38 0.1△OD/（g·min）；經(jīng)過3.5 h發(fā)酵，β-葡萄糖苷活性從揉捻后的26.38 0.1△OD/（g·min）降到20.78 0.1△OD/（g·min）；干燥過程中β-葡萄糖苷酶活性明顯下降，降幅達91%。

2.3 紅茶加工中水分含量的動態(tài)變化

圖3以及結(jié)合圖1～2表明，萎凋0～4 h內(nèi)，水分含量下降，細胞液濃度升高，酶活性呈現(xiàn)升高趨勢，在萎凋4～10 h過程中，水分持續(xù)降低，但3種酶的活性變化不大，直到水分含量降至63.2%后，酶活性快速增加，故生產(chǎn)中可在萎凋前期加快水分散失速度，在縮短萎凋時間的同時實現(xiàn)酶活性的快速增加。萎凋14 h時，各種酶的活性均達到最大值，生產(chǎn)中可以根據(jù)酶活性變化情況指導萎凋適度的標準。毛火干燥對PPO和POD的失活作用較明顯，分別降至萎凋葉的10%和28%左右。足火后，毛茶中的PPO、POD和β-葡萄糖苷酶活性仍有殘余，分別為5%、8%及0.6%。因此，為了防止過度發(fā)酵，在發(fā)酵工藝過程中，也可根據(jù)3種酶的活性變化或其比值變化情況，來判別發(fā)酵適度的標準，并在干燥前期用適當高溫最大限度地鈍化酶活性。

3 結(jié)論

紅茶加工過程中，隨著萎凋時間的延長，PPO、POD和β-葡萄糖苷酶3種酶酶活性均呈現(xiàn)不同程度的增加，萎凋14 h后，PPO酶活性達到鮮葉的2.9倍，POD酶活性達到鮮葉的3.5倍，β-葡萄糖苷酶活性達到鮮葉的2.1倍，這可能與茶鮮葉內(nèi)含成分降解為酸性物質(zhì)以及水分的散失有關，如糖類物質(zhì)降解成有機酸、酯型兒茶素降解生成沒食子酸、原果膠生成果膠酸、葉綠素水解為葉綠酸等，從而使得萎凋葉逐步向酸性轉(zhuǎn)化，pH逐步與酶的最適pH相適應；同時，隨著萎凋葉的逐步失水，酶的相對濃度升高，進而導致酶活的增加。從本研究結(jié)果來看，β-葡萄糖苷酶對紅茶香氣的影響主要表現(xiàn)在萎凋過程及發(fā)酵早期。此外，在紅茶發(fā)酵的前2.5 h內(nèi)，PPO的活性降低速率較POD慢，PPO下降25%，POD下降到33%，說明在發(fā)酵前期，PPO起主導作用，主要以酶促合成茶黃素為主，而在發(fā)酵后期，POD起主導作用，主要以酶促合成茶紅素、茶褐素為主。因此，可根據(jù)萎凋葉中3種酶的活性變化程度以及萎凋葉的失水情況，確定紅茶加工中萎凋適度的標準，然后根據(jù)發(fā)酵過程中的POD與PPO的比值變化情況，確定發(fā)酵適度的標準。

4 討論

綜上所述，紅茶加工過程中PPO、POD和β-葡萄糖苷酶3個酶的活性都是呈現(xiàn)低-高-低的變化趨勢。萎凋過程中，隨著萎凋時間的的延長，酶活性均出現(xiàn)不同程度的提高。早在20世紀50年代末期，Avouchable等就曾研究指出，紅茶制造的萎凋過程中，PPO、POD、過氧化氫酶、脫氫酶等活性均有所增高。竹尾忠一認為鮮葉中的PPO活性在萎凋時逐漸增加，輕萎凋和重萎凋葉的PPO活性在揉捻時均快速增加，高達鮮葉的2～3倍，酶活性在揉捻后隨同發(fā)酵過程而降低。阮宇成等研究了紅碎茶制造中PPO活性及同工酶的變化，得到了類似的結(jié)果，并且，竹尾忠一還通過抑制劑試驗發(fā)現(xiàn)，PPO在萎凋時活性增加是新的酶蛋白形成的結(jié)果。有人也對萎凋期間PPO各組分活性的變化進行了研究。而Perea和Willinghearted則未觀察到萎凋階段PPO活性的增加。Mullah等的試驗結(jié)果表明，萎凋過程中PPO活性隨著葉子失水而逐漸降低，當以適當方式補充水分后，酶活性又得以恢復。肖偉祥、葉慶生也得到了類似的研究結(jié)果，所以，究竟何種結(jié)果正確至今尚無定論。前人研究表明，紅茶的香氣主要產(chǎn)生于發(fā)酵過程，從本研究結(jié)果看，揉捻后β-葡萄糖苷酶活性的急劇下降，從萎凋后的32.42 0.1△OD/（g·min）降到揉捻后的26.38 0.1△OD/（g·min），顯然會嚴重影響它在香氣形成中的作用。從這里也可以看出，β-葡萄糖苷酶對紅茶香氣形成的作用主要表現(xiàn)在萎凋過程及發(fā)酵早期，而發(fā)酵中的香氣大量產(chǎn)生則與多酚類的氧化作用有關，萎凋中酶活性的提高與葉組織內(nèi)部酸化有關。由于糖類物質(zhì)降解成有機酸，酯型兒茶素酯解生成沒食子酸，原果膠生成果膠酸，葉綠素水解有葉綠酸的形成等，使萎凋葉逐步向酸性轉(zhuǎn)化，pH從鮮葉的近乎中性降低到與三大酶酶的最適pH相適應，使酶的活性增加。此外，隨葉子的逐步失水，酶及其作用物的相對濃度升高，結(jié)合態(tài)的酶部分可轉(zhuǎn)化為游離態(tài)。萎凋中氧化酶活性的提高則為揉捻開始以后的發(fā)酵工序準備了良好的發(fā)酵條件。在揉捻過程中，茶葉組織損傷和細胞破損，膜透性增加，化學成分和酶得到混合，各種化學反應得以實現(xiàn)。在紅茶發(fā)酵過程中，多酚類物質(zhì)與酶接觸引起酶活性的迅速下降，同時PPO和POD也催化兒茶素迅速氧化聚合成茶黃素、茶紅素和高聚類物質(zhì)。發(fā)酵后期由于酶活性降低、底物減少和產(chǎn)物積累，使發(fā)酵速度減慢。兒茶素氧化形成的中間產(chǎn)物釀類和茶黃素也對酶有較強的變性作用。所以茶黃素積累到一定量以后，反過來抑制了催化其合成的酶活性，而限制本身量的積累。與萎凋葉相比，在發(fā)酵期間PPO和POD活性持續(xù)下降，但PPO的活性降低較POD快，PPO活性由3.52 0.1△OD/（g·min）下降到1.30 0.1△OD/（g·min），下降63%，POD活性由12.87 0.1△OD/（g·min）]下降到7.68 0.1△OD/（g·min）]，下降40%。這主要是由于發(fā)酵葉中有機酸的增加，pH降至5.0以下，使PPO喪失了最適pH條件，而POD的活性因酸度適宜而下降緩慢，使得PPO與POD的活性比值下降，POD逐漸居于主導地位，并對茶多酚氧化產(chǎn)物的形成和積累產(chǎn)生一定的影響。高溫能使酶產(chǎn)生不可逆熱變性，但在較低溫度下，溫度如升高，反而會促進酶的催化。所以在紅茶干燥時采用先毛火再足火的干燥方式。毛火干燥對PPO和POD的失活作用較明顯，分別降至萎凋葉的10%和28%左右。足火干燥后，毛茶中的PPO、POD和β-葡萄糖苷酶活性仍有殘余，分別為5%、8%及0.6%。這主要是高分子量、熱穩(wěn)定性強的PPO1、POD2和POD3，即在發(fā)酵過程中起主要作用的并在成茶中殘余的均是那些熱穩(wěn)定性好，對多酚敏感性差的高分子酶蛋白組分。施和森認為，發(fā)酵中形成的揮發(fā)性物質(zhì)經(jīng)烘干后只剩下20%～25%。因此，如何在紅茶干燥過程中的某一最佳時段采取某些適當措施既能使某些熱化學、分解反應順利進行以產(chǎn)生出更多芳香物，又能使前期發(fā)酵葉中的大部分芳香物，尤其是對決定其香氣的香葉醇等幾種主要芳香物，盡量保留下來具有重要的研究價值。

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