李祥筑 張敬迎 李長(zhǎng)林 劉佳斌 王珺 劉鐘馨 于曉龍

摘 要 利用單分子自組裝膜（SAMs）技術(shù)，分別制備表面具有碳碳雙鍵、甲基、氨基及混合官能團(tuán)的表面膜層材料。研究表明：表面硅藻附著量是隨著時(shí)間變化而呈動(dòng)態(tài)變化，氨基的正電程度對(duì)舟形藻的附著有著重要影響。前H5內(nèi)氨基（0.4）的附著量最小，當(dāng)H12時(shí)氨基（0.4）附著量最大。材料表面的電負(fù)性和親疏水性共同影響硅藻的附著。甲基的附著強(qiáng)度最大，硅藻的附著強(qiáng)度與附著量并無(wú)直接關(guān)系。這不僅對(duì)探討硅藻細(xì)胞的附著行為有著意義，同時(shí)為研究應(yīng)用海洋生物防污提供一種有效的途徑。

關(guān)鍵詞 單分子自組裝膜；硅藻；附著；脫附；靜電作用

中圖分類(lèi)號(hào) R318.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

海域中并非靠陸生植物生存的動(dòng)物世界靠著海洋植物提供物質(zhì)能量作為基礎(chǔ)進(jìn)行生命活動(dòng)。高度分化的高等植物由于受到生存環(huán)境因素的限制不可能像在陸地上那樣遍布海洋中，作為海洋植物主要成分的藻類(lèi)，盡管是一群最簡(jiǎn)單、最古老的低等植物，它們的足跡卻可以在從熱帶到兩極的區(qū)域找到[1]。

硅藻作為海洋浮游植物中重要的一類(lèi)群體，不僅僅是為世界貢獻(xiàn)著20%左右的初級(jí)生產(chǎn)力[2-3]，且硅藻在海洋的物質(zhì)和能量循環(huán)過(guò)程（例如還海洋硅藻為海洋中固定有機(jī)碳占40%[4]）中有著不可替代的作用[5-6]；同時(shí)硅藻在仿生與合成、硅藻基因組學(xué)、污染與干擾等方面起著重要作用[7-8]。近年來(lái)，細(xì)胞行為的研究已成為生物和生物醫(yī)用材料研究的熱點(diǎn)。大量研究[9-12]已證實(shí)：細(xì)胞微環(huán)境中的細(xì)胞外基質(zhì)是影響細(xì)胞行為的重要原因。利用單分子自組裝膜技術(shù)形成具有單一化學(xué)基團(tuán)的材料表面探討對(duì)硅藻細(xì)胞生命活動(dòng)的影響具有重要意義：它不僅對(duì)硅藻細(xì)胞自身的行為研究具有重要意義，同時(shí)通過(guò)對(duì)硅藻細(xì)胞自身的行為影響也可以為海洋生態(tài)保護(hù)及海洋污損的研究提供有效途徑。

硅藻在固相表面的附著是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，其一般包括到達(dá)表面后著陸、初始附著、滑行、永久附著四個(gè)步驟[13]。Maureen等[14]首次通過(guò)高分辨率顯微鏡詳細(xì)觀察滸苔（Enteromopha）孢子的著陸與附著的情況并且引入動(dòng)力學(xué)方法定量分析細(xì)胞附著。目前研究表明[15-19]對(duì)硅藻附著影響的因素有材料表面接觸角、粗糙度、表面能等。Li等[20-21]在研究材料表面能對(duì)硅藻的附著影響時(shí)，認(rèn)為表面為羧基的材料與帶有負(fù)電的硅藻胞外分泌物（extracellular polymeric substances，EPS）有一定的靜電排斥作用，同時(shí)通過(guò)制備磷酸膽堿聚合物膜帶有一定的正電性研究對(duì)硅藻的附著影響，認(rèn)為這種正電性有利于硅藻的附著及提高附著強(qiáng)度，但對(duì)電負(fù)性影響硅藻的附著程度并未進(jìn)一步探討，且目前在對(duì)于材料表面電負(fù)性對(duì)硅藻附著及隨時(shí)間的影響研究較少。因此設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)制備出具有不同程度電負(fù)性的材料表面對(duì)硅藻的附著進(jìn)行研究便有了重要意義。本實(shí)驗(yàn)利用SAMs制備出表面能夠具有系列梯度的正電的材料表面探討硅藻附著情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 化學(xué)試劑 （3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES，-NH2，98%）、三甲氧基（丙基）硅烷（PTS，-CH3，97%）、三乙氧基乙烯基硅烷（TVS，-C=C-，97%）為Sigma公司產(chǎn)品，環(huán)己烷為Fluka公司產(chǎn)品，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 植物材料 舟形藻（Navicula vilaplanii，Lange-Bertalot，1990）取自海南大學(xué)海洋學(xué)院。舟形藻（Navicula V.）采用F/2培養(yǎng)基培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為（2 500±500）lx，光照與黑暗時(shí)間比例為14 h ∶ 10 h。

1.2 方法

1.2.1 單分子自組裝膜制備 分別配制尾基為氨基、甲基、碳碳雙鍵的硅烷聯(lián)環(huán)己烷溶液（V有機(jī)硅烷 ∶ V聯(lián)環(huán)己烷=5 ∶ 100）。制備尾基為氨基、甲基及碳碳雙鍵的具體實(shí)驗(yàn)方法和步驟可參考相關(guān)文獻(xiàn)[22-23]。分別配置甲基和氨基混合官能團(tuán)硅烷溶液（V甲基 ∶ V氨基=0.2、0.4、0.6、0.8）。甲基和氨基的混合官能團(tuán)制備具體過(guò)程見(jiàn)參考文獻(xiàn)[15]。將表面官能團(tuán)化后的玻璃片分別用丙酮、無(wú)水酒精、去離子水依次清洗并在氮?dú)鈿夥障赂稍铩?/p>

1.2.2 硅藻細(xì)胞附著與分析 分別將上述接枝后的玻璃片和空白玻璃片分別放置在7個(gè)硅藻培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。等待24 h后分別于1、3、5、7、10、12 h取出玻璃片在光學(xué)顯微鏡（E-100，Nikon）下進(jìn)行隨機(jī)拍照8張并且觀察計(jì)數(shù)。

1.2.3 硅藻脫附實(shí)驗(yàn) 模擬水流裝置：將1個(gè)100 mL的燒杯裝滿蒸餾水，然后將攪拌機(jī)轉(zhuǎn)子放入燒杯底部，并調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)數(shù)至200 r/min，形成水流的模擬環(huán)境，將玻璃片樣本在液面上層浸沒(méi)5 min。分別將接枝尾端為碳碳雙鍵、甲基、氨基及空白玻璃片放置在硅藻培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3 h，然后取出玻璃片在光學(xué)顯微鏡下分別觀察計(jì)數(shù)在培養(yǎng)后的玻片及在模擬水流環(huán)境沖壓后的玻片樣本。

1.2.4 接觸角測(cè)試及紅外光譜測(cè)試 分別將制備的表面為碳碳雙鍵、氨基和甲基以及空白玻片進(jìn)行接觸角（HARKE-SPCA，北京哈科）測(cè)試，其數(shù)據(jù)處理用內(nèi)置圖像分析軟件，每組樣本用去離子水滴定重復(fù)測(cè)試3次。將制備的表面含有碳碳雙鍵、甲基和氨基的玻片進(jìn)行傅里葉紅外光譜（Perkin Elmer，USA）測(cè)試。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)都是以兩因子試驗(yàn)方差分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 接觸角測(cè)試結(jié)果

以上幾種化學(xué)官能團(tuán)的玻片接觸角測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。表1中的接觸角數(shù)據(jù)，碳碳雙鍵的疏水性最強(qiáng)，甲基次之，而空白組和氨基的表面接觸角較小，親水性較強(qiáng)?；旌辖M官能團(tuán)的接觸角介于氨基和甲基之間。

2.2 紅外光譜測(cè)試

由化學(xué)官能團(tuán)的紅外圖譜圖1可看出，在1 100 cm-1處有較為明顯的特征峰，而此處峰值正是Si-O-Si鍵的特征峰。同時(shí)可以分別在2 960 cm-1和2 870 cm-1附近找到甲基的特征峰；在1 591 cm-1附近的氨基特征峰；在1 643 cm-1和911 cm-1附近有明顯的碳碳雙鍵的特征峰，說(shuō)明化學(xué)基團(tuán)都成功與基底連接。

2.3 幾種化學(xué)官能團(tuán)的附著情況

不同官能團(tuán)的硅藻附著量見(jiàn)圖2。由圖2可看出，氨基的附著量最大，而空白組次之，然后碳碳雙鍵的數(shù)量多于甲基組的附著量。其光學(xué)顯微鏡圖見(jiàn)圖3。氨基的附著量遠(yuǎn)大于甲基和碳碳雙鍵的附著量，除了因?yàn)榘被挠H水性有利于硅藻附著外，和空白組對(duì)比，氨基的接觸角大于空白組說(shuō)明還有其它因素在影響硅藻的附著。

2.4 不同正電程度材料表面的附著情況

不同官能團(tuán)的硅藻表面附著情況見(jiàn)圖4。由圖4可看出，在H1氨基官能團(tuán)上附著的硅藻最少，而甲基和空白組上的數(shù)量相差不大，混合官能團(tuán)上的數(shù)量較多，但是在混合氨基（0.4）處明顯較少。H3后氨基玻璃片上數(shù)量最多，除了混合氨基（0.4）依然最少，其他玻璃片上附著量相差不大。從H5到H7，氨基和甲基及空白組的硅藻附著數(shù)量較多，混合組上的數(shù)量比較少。而從H10到H12，甲基上附著量都較少，而含有氨基的組附著量整體上較多。

硅藻附著量隨著時(shí)間變化見(jiàn)圖5。在圖5中，每種化學(xué)基團(tuán)的附著量都會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而變化。以H1附著量為基準(zhǔn)，除了氨基組（0.4），其他組的變化趨勢(shì)基本上是先減少，特別是在H3到H5小時(shí)之間較為明顯，之后的時(shí)間段特別是H10到H12小時(shí)硅藻的附著量變化趨勢(shì)減小，由此說(shuō)明舟形的附著量是個(gè)隨時(shí)間動(dòng)態(tài)變化的過(guò)程。同時(shí)在前H5內(nèi)，舟形藻附著量的最小值在H1和H3及H5時(shí)刻都出現(xiàn)在氨基組（0.4），這說(shuō)明影響舟形藻附著還有其他因素，這其中可能與材料表面能和硅藻的生命活動(dòng)相關(guān)[24-27]，值得進(jìn)一步深入研究。

2.5 幾種化學(xué)官能團(tuán)的脫附情況

對(duì)于硅藻的附著強(qiáng)度情況，從圖6可以計(jì)算出，甲基上的脫附率最高達(dá)到13.5%，空白組為12.1%，而氨基為9.2%，碳碳雙鍵為8.33%。硅藻的附著強(qiáng)度在甲基與空白組的差距并不大，而在氨基上明顯降低，硅藻在親水性材料表面的附著強(qiáng)度高于疏水性表面，這與Callow[19]觀察結(jié)果一樣，這可能不僅是由于極性化學(xué)官能團(tuán)氨基的正電在硅藻附著中的靜電吸引，同時(shí)可能由于硅藻的EPS含有帶有極性分子使得其在材料表面具有更大的接觸作用面積[16]，即加強(qiáng)了硅藻與材料表面的相互作用從而增強(qiáng)附著強(qiáng)度。同時(shí)根據(jù)結(jié)果可以得到硅藻的附著量與附著強(qiáng)度并無(wú)直接關(guān)系。

3討論與結(jié)論

3.1 不同正電程度化學(xué)基團(tuán)對(duì)硅藻附著的影響

雖然前人利用SAMs技術(shù)制備具有特定物理化學(xué)性質(zhì)的材料表面研究對(duì)硅藻的附著影響，但是多從材料親疏水性、摩擦系數(shù)、表面能等因素探討對(duì)硅藻附著的影響。很少有從材料表面所帶的正電性及帶電程度來(lái)研究對(duì)硅藻附著的影響。材料表面所帶的電性主要是通過(guò)與硅藻EPS的糖類(lèi)及蛋白質(zhì)相互作用從而影響硅藻的附著過(guò)程。硅藻的附著過(guò)程同時(shí)伴隨著硅藻的生命活動(dòng)，正是由于硅藻的生命活動(dòng)影響著硅藻EPS的分泌及其含量，從而引起硅藻附著的變化。在實(shí)際水域環(huán)境中，硅藻的EPS中糖類(lèi)及蛋白質(zhì)含量的相對(duì)變化對(duì)于硅藻附著情況有緊密聯(lián)系。

在圖4中，H1甲基和氨基（0.2）的附著量明顯多于氨基組的附著量，這種現(xiàn)象與Finlay等[15]人的結(jié)果保持一致，這主要是因?yàn)樵诠柙甯街跗谑杷饔肹19]。但是在這期間氨基（0.2）的組中數(shù)量最多，這說(shuō)明了氨基的在硅藻附著中也起了一定作用，理論上應(yīng)該隨著氨基的含量增高附著量遞減，但是結(jié)果表明氨基（0.2）組附著量最多，而在氨基（0.4）時(shí)最少。這說(shuō)明在硅藻附著初期，雖然在硅藻的附著過(guò)程初期疏水性占著主導(dǎo)作用，但是材料表面的正電性對(duì)硅藻附著量仍有重要影響，這可能是由于硅藻分泌的胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS）中含有較多的含有羥基的酸性多糖帶有一定的負(fù)電性，靜電吸引導(dǎo)致氨基（0.2）處的附著量最多，但隨著氨基含量增多，正電性增強(qiáng)，硅藻附著量并未呈逐漸增強(qiáng)，此時(shí)是由于材料正電程度過(guò)高會(huì)影響硅藻細(xì)胞選擇附著位點(diǎn)。H3中氨基組的附著量又明顯多于甲基組及其混合組，說(shuō)明此時(shí)氨基的所帶的正電性有利于舟形藻的附著。H5中同樣有相似的現(xiàn)象，但是附著量組最小的組氨基（0.4）與最大組的差距逐漸減小，說(shuō)明正電性對(duì)舟形藻的附著影響程度開(kāi)始減弱，此時(shí)是由于材料表面親疏水性及電負(fù)性共同調(diào)節(jié)硅藻附著導(dǎo)致。H12時(shí)氨基組不再是最大附著量，氨基（0.4）成為附著量量最大組，但是氨基組和甲基組的附著量差距并不大，而此時(shí)甲基組與氨基（0.2）的差異也不大，這可能是由于氨基組（0.4）具有特定的表面能，從而有利于舟形藻的附著。

3.2 時(shí)間對(duì)硅藻附著的影響

前人在研究硅藻附著情況，基本上是選取某一個(gè)時(shí)間段，并未做較為連續(xù)時(shí)間段的硅藻附著情況。硅藻附著時(shí)間因素主要是由于硅藻的EPS的含量及成分會(huì)隨著時(shí)間變化而變化，而這些與硅藻附著有著不可分割的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果同樣說(shuō)明了硅藻附著量會(huì)因?yàn)闀r(shí)間變化而變化。硅藻脫附影響因素研究目前較多集中在材料表面親疏水性，對(duì)于其他因素的研究仍需深入探討。

氨基的正電程度對(duì)舟形藻的附著有著重要影響。前H5內(nèi)氨基（0.4）的附著量最小，當(dāng)H12時(shí)氨基（0.4）附著量最大。材料表面的電負(fù)性和親疏水性共同影響硅藻的附著。甲基的附著強(qiáng)度最大，硅藻的附著量與附著強(qiáng)度并沒(méi)有直接關(guān)聯(lián)。這項(xiàng)工作對(duì)研究海洋生物防污中將有積極作用。

致 謝 本研究承蒙海南大學(xué)海洋學(xué)院及熱帶島嶼資源先進(jìn)材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供技術(shù)支持，在此表示感謝！

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責(zé)任編輯：葉慶亮