李然 田兆豐 張飛云

摘要[目的]研究擬南芥中Fibrillarin基因的克隆、表達(dá)及純化，并探索其與ak6蛋白的相互作用。[方法]利用pGEX6P1與Fibrillarin基因構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，運(yùn)用同樣方法構(gòu)建PET28aak6原核表達(dá)質(zhì)粒，獲得Hisak6融合蛋白，并運(yùn)用體外pull down技術(shù)驗(yàn)證二者的相互作用。[結(jié)果]在溫度為37 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間為16～20 h、IPTG濃度為0.5 mmol/L時(shí)，fibrillarin蛋白的純化濃度最高。試驗(yàn)成功獲得了符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA，并獲得了與預(yù)期片段大小相符的清晰的目的條帶；pulldown試驗(yàn)結(jié)果表明，擬南芥中fibrillarin蛋白與ak6蛋白具有相互作用。[結(jié)論]擬南芥ak6突變體植株可能由于ak6的缺失影響了rRNA前體的加工，從而抑制核糖體的合成，進(jìn)而阻礙擬南芥莖的生長，使植株表現(xiàn)明顯的矮小癥狀。

關(guān)鍵詞擬南芥；fibrillarin蛋白；ak6

中圖分類號(hào)Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）01-00020-04

基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31071075）。

作者簡介李然（1988- ），女，河北承德人，碩士研究生，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，Email：lran1988@163.com。*通訊作者，副教授，碩士生導(dǎo)師，從事植物分子生物學(xué)和植物分子病毒學(xué)研究，Email：feiyun39@126.com。

收稿日期20131209隨著人類基因組計(jì)劃的完成和后基因組時(shí)代的到來，對(duì)人體內(nèi)一些結(jié)構(gòu)和功能未知蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)成為一個(gè)熱點(diǎn)，因?yàn)橥ㄟ^對(duì)這些蛋白質(zhì)的研究可以使人類更進(jìn)一步地認(rèn)識(shí)自己，從而為人類一些相關(guān)疾病的預(yù)防和治療提供重要的理論基礎(chǔ)。

核糖體RNA，即rRNA，是最多的一類RNA，占RNA總量的82%左右，其也是3類RNA（tRNA、mRNA和rRNA）中相對(duì)分子質(zhì)量最大的一類RNA，能與蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體。其功能是作為mRNA的支架，使mRNA分子在其上展開，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的合成，單獨(dú)存在時(shí)不執(zhí)行此功能。rRNA可與多種蛋白質(zhì)結(jié)合形成核糖體，作為蛋白質(zhì)生物合成的“裝配機(jī)”。研究幫忙，擬南芥fibrillarin蛋白是核小核糖核蛋白顆粒（snRNP）中的組分，結(jié)合于U3、U8、U13 snRNP的RNA，參與rRNA前體的第一步加工，從而調(diào)控蛋白質(zhì)的翻譯過程。擬南芥ak6突變體植株較擬南芥野生型植株明顯矮小。

腺苷酸激酶（Adenylate kinase，AK）是一種核苷酸單磷酸激酶（Nucleoside monophosphate kinases，NMPKs），廣泛存在于生物體中，能可逆地催化γ磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移（通常作用于ATP），將ATP和AMP反應(yīng)，生成2分子的ADP，以此來維持細(xì)胞內(nèi)的能量平衡[1]。因此，腺苷酸激酶在細(xì)胞的新陳代謝以及DNA和RNA的合成中扮演著重要的角色。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并深入研究了其前5種亞型（AK1～AK5）。研究表明，這些酶在核苷酸的合成中起著重要的作用，在各種細(xì)胞代謝過程中都是必需的[11-12]。由于腺苷酸激酶涉及細(xì)胞中核苷酸的合成與代謝，所以對(duì)治療用的核苷和核苷類似物的化療藥物進(jìn)行活化及代謝也是必需的。ak6是Hui Ren（2004）等在人體腎上腺中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)定位于細(xì)胞核的新型腺苷酸激酶[7]。目前，AK6基因已在大多數(shù)動(dòng)物如人類、果蠅、線蟲以及酵母中有了較深入的研究，但在植物中鮮有報(bào)道，課題小組前期的研究表明，aak6-/aak6-突變體植株與野生型植株相比，突變體植株表現(xiàn)明顯的矮小狀況[13-14]。

fibrillarin蛋白參與rRNA前體的加工過程，影響植株的能量代謝，推測可能影響擬南芥的生長狀況。筆者構(gòu)建了fibrillarin蛋白的表達(dá)載體，并對(duì)其進(jìn)行表達(dá)、純化，然后用體外pull-down、SDS-PAGE和western blot檢測技術(shù)，探究擬南芥中fibrillarin蛋白與ak6蛋白是否存在相互作用，以期找到突變體植株矮小的原因。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和質(zhì)粒。pET28a載體、pGEX6P1載體、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α與TOP10、BL21（DE3），均為實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑。Trizol，購自美國TELTEST Inc；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Fermerters公司；高保真PCR試劑盒、隨機(jī)引物和TA cloning 試劑盒，均購自全式金公司；各種構(gòu)建載體所需工具酶（如限制性內(nèi)切酶、TapDNA聚合酶、T4連接酶等），均購自Takala公司；質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，購自QINGEN公司。

1.2方法

1.2.1RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及檢測。以生長4周左右的擬南芥（未抽薹）的葉片為材料，用Trizol法提取總RNA，并用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2Fibrillarin基因的擴(kuò)增。根據(jù)GenBank中ig52490序列利用PrimerPremier5.0設(shè)計(jì)引物，上游BamH1 酶切位點(diǎn)，下游加入EcoR1酶切位點(diǎn)，引物序列為：

以制備好的擬南芥cDNA為模板，擴(kuò)增體系為50 μl。反應(yīng)程序：預(yù)變性：94 ℃，5 min；變性：94 ℃，30 s；退火：58 ℃，40 s；延伸：72 ℃，1 min；30個(gè)循環(huán)后，72 ℃，5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取出4 μl進(jìn)行電泳，檢測是否擴(kuò)增出目的片段，檢測到目的片段后用膠回收試劑盒進(jìn)行回收。

1.2.3原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定。將純化后的PCR產(chǎn)物和pGEX6P1分別用限制性內(nèi)切酶BamH1和EcoR1進(jìn)行雙酶切，膠純化回收以后將PCR產(chǎn)物與pGEX6P1線性片段連接，16 ℃連接過夜，連接體系如表1所示。

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃活化1 h后涂LB AMP抗性平板，置37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)。轉(zhuǎn)化后，用抗生素篩選后的單克隆進(jìn)行如下程序檢測：菌落PCR篩選-酶切檢驗(yàn)-測序，最終找出正確的重組克隆。

1.2.4重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)和純化。將測序結(jié)果正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)菌株，將表達(dá)檢測成功的樣本接種到200 ml含50 μg/ml氨芐霉素的LB培養(yǎng)基中，于37 ℃，200 r/min過夜培養(yǎng)，然后以1∶20接種到大瓶LB培養(yǎng)基中，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm為0.6，然后加入0.5 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，于16 ℃培養(yǎng) 16 h；然后于8 679 r/min，10 min低溫離心，棄掉上清；用5.0 ml PBS懸浮沉淀，超聲破碎，在4 ℃，14 000 r/min 離心30 min，收集上清，上清和沉淀分別留少許樣進(jìn)行SDSPAGE檢測。在上清中加入適量GST beads，于4 ℃旋轉(zhuǎn)令其吸附蛋白2.5 h；于4 340 r/min，3 min離心棄上清；加入至少50 ml的PBS溶液，輕搖至beads懸浮于溶液中，于4 340 r/min，離心3 min，棄上清；重復(fù)用PBS洗beads 2次；加入1.0 ml的GST Elution Buffer，輕搖10 min；于4 340 r/min，離心3 min，收集上清；重復(fù)用 GST Elution Buffer洗2次，收集上清進(jìn)行SDSPAGE檢測，進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測。

1.2.5ak6蛋白的制備。采用“1.2.4”中方法獲得表達(dá)的擬南芥。

1.2.6體外pulldown尋找與fibrillarin相互作用的蛋白及免疫檢測。用200 μl的GST beads和1.0 ml的GSTfibrillarin蛋白在4 ℃混合，將過表達(dá)的HISAK6蛋白混合液加入經(jīng)處理的GST beads中，在4 ℃旋轉(zhuǎn)混合孵育10 h，用冰冷的細(xì)胞裂解液重復(fù)洗滌3次，然后采用SDSPAGE方法對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測。將跑好的膠在冰浴中轉(zhuǎn)PVDF膜1 h，再將膜從電轉(zhuǎn)槽中取出，依次用去離子水和PBST稍加漂洗，然后浸沒于封閉液（脫脂牛奶）中，于4 ℃緩慢搖蕩1 h；然后加一抗（AK6單抗），4 ℃搖動(dòng)孵育12 h過夜；用PBST洗膜3次，每次5 min；之后加入羊抗鼠二抗，用PBST再洗膜3次，每次15 min；最后進(jìn)行自顯影。

2結(jié)果與分析

2.1總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄用Trizol從擬南芥的葉片中提取RNA，根據(jù)檢測的濃度利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，保存在-20 ℃?zhèn)溆?，結(jié)果表明成功獲得了符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA（圖1）。

2.4.1ak6引物。

2.4.2載體構(gòu)建和重組蛋白的表達(dá)純化。成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28aak6獲得ak6蛋白，其中載體pET28a中帶有HIS標(biāo)簽，用ak6的單克隆抗體作為后續(xù)pulldown試驗(yàn)中進(jìn)行western blot檢測所以的一抗，鑒定ak6蛋白，從而證明擬南芥中fibrillarin蛋白與ak6蛋白具有相互作用。

2.5核糖體組成蛋白fibrillarin與ak6相互作用將純化后的HISak6融合蛋白和GST fibrillarin融合蛋白及pGEX6P1蛋白同時(shí)加入到GST beads中，4 ℃共同孵育10 h，經(jīng)離心收集洗脫復(fù)合物和洗滌后，取膠，在冰浴中轉(zhuǎn)PVDF膜2 h，再加入ak6單克隆抗體過夜，洗脫，加二抗，最后進(jìn)行自顯影，結(jié)果如圖5所示，證明二者存在相互作用。

試驗(yàn)選取擬南芥作為研究對(duì)象，構(gòu)建了fibrillarin蛋白的表達(dá)載體，通過對(duì)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、IPTG濃度等條件的摸索，發(fā)現(xiàn)在溫度為37 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間為16～20 h、IPTG濃度為0.5 mmol/L時(shí)，fibrillarin蛋白的純化濃度最高。

生物體進(jìn)行一系列的生命活動(dòng)需要化學(xué)能，而這些化學(xué)能的獲得絕大部分是來自于ATP。ATP是一種高能化合物，通過一系列的代謝過程，例如糖酵解、三羧酸循環(huán)以及氧化磷酸化來產(chǎn)生。ATP的能量轉(zhuǎn)移使得動(dòng)植物的各種重要生命活動(dòng)有了能量來源，如肌肉收縮、神經(jīng)信號(hào)的傳導(dǎo)、主動(dòng)運(yùn)輸?shù)?，保持著生物體生命活動(dòng)的正常進(jìn)行。利用ATP轉(zhuǎn)移走一個(gè)磷酸基團(tuán)生成ADP，然后ADP再獲得一個(gè)磷酸基團(tuán)生成ATP，以此完成ATP的利用循環(huán)。換言之，這種以ATP為中介物的生成與再利用循環(huán)是生物體能量流動(dòng)的核心，并以此維持著生物體的各項(xiàng)生命活動(dòng)。

ak6是腺苷酸激酶的一種，根據(jù)前人研究，除酵母外，人類、線蟲、果蠅中的ak6的同源蛋白都具有激酶活性[9-10]，能使所有類型的NTPs和dNTPs充當(dāng)磷酸供體，為細(xì)胞代謝提供能量。課題組為探索缺失ak6的突變體植株與野生型相比長勢(shì)矮小的原因，通過體外試驗(yàn)尋找與ak6蛋白具有相互作用的功能蛋白。由于在進(jìn)行pulldown試驗(yàn)時(shí)加入的是GST beads，那么在收集的上清液蛋白中，只可能存在帶有GST標(biāo)簽的蛋白以及與其發(fā)生相互作用的蛋白，westblot檢測時(shí)加入ak6抗體，使HISAK6融合蛋白與之結(jié)合，結(jié)果表明抗體是與ak6結(jié)合而不是與GST標(biāo)簽結(jié)合，從而證明擬南芥中fibrillarin蛋白與ak6蛋白發(fā)生了特異性結(jié)合，二者存在相互作用。fibrillarin蛋白在生物體內(nèi)參與rRNA前體的加工，那么可以推測，突變體植株長勢(shì)矮小，可能是由于ak6的缺失，導(dǎo)致fibrillarin蛋白與其無法融合，影響了rRNA的合成，使核糖體的合成發(fā)生障礙，影響細(xì)胞能量代謝，從而使植株長勢(shì)矮小。但這僅是推測，結(jié)論還有待進(jìn)一步考證。

試驗(yàn)成功構(gòu)建了帶有GST標(biāo)簽的擬南芥中fibrillarin蛋白的表達(dá)載體，在原核生物大腸桿菌中對(duì)重組蛋白進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，純化后得到了fibrillarin蛋白；通過體外pulldown試驗(yàn)證明，擬南芥中的fibrillarin蛋白與ak6蛋白具有相互作用。

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