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      荔枝古樹胚性愈傷組織Fe—SOD成員基因克隆及生物信息學(xué)分析

      2014-04-29 11:18:25練從龍等
      熱帶作物學(xué)報(bào) 2014年1期
      關(guān)鍵詞:生物信息學(xué)分析克隆

      練從龍等

      摘 要 為了解Fe-SOD在荔枝古樹胚性愈傷組織保存中的分子機(jī)制,選擇荔枝古樹“宋荔”花藥誘導(dǎo)而來的胚性愈傷組織為試驗(yàn)材料,采用同源克隆和RACE方法,獲得荔枝Fe-SOD的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本和基因組序列,并對(duì)該基因組的內(nèi)含子進(jìn)行分析??寺~@得長1 285 bp含有完整開放閱讀框的荔枝Fe-SOD核酸序列,其編碼1個(gè)含有250個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),將該序列命名為LcFe-SOD7a。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明:該蛋白為穩(wěn)定的、親水的、含跨膜結(jié)構(gòu)域的偏酸性蛋白質(zhì),定位于微體(過氧化物酶體)和細(xì)胞質(zhì),具有多樣的磷酸化位點(diǎn)。LcFe-SOD7a基因組序列長2 284 bp,含7個(gè)內(nèi)含子,其中第4個(gè)內(nèi)含子較長,達(dá)920 bp。同時(shí)還得到其中的1條內(nèi)含子駐留型可變剪接基因,該可變剪接基因提前終止,僅編碼207個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),將該可變剪接基因命名為LcFe-SOD7b。

      關(guān)鍵詞 荔枝古樹;胚性愈傷組織;Fe-SOD;克?。豢勺兗艚?;生物信息學(xué)分析

      中圖分類號(hào) S667.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

      Cloning and Bioinformatics Analysis of Fe-SOD

      Gene from Embryogenic Callus of

      an Ancient Litchi Tree

      LIAN Conglong, LAI Zhongxiong*, LU Bingguo, LIN Yuling, FENG Xin

      Institute of Horticultural Biotechnology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China

      Abstract Two different mRNA transcripts and their genomic sequence of Fe-Superoxide dismutase gene were obtained with homologous and RACE from embryogenic callus of an ancient litchi tree‘Songli, and the bioinformatics were analyzed to illustrate its role in the process of in vitro reservation. The full length of LcFe-SOD cDNA was about 1 285 bp,containing a 753-nucleotides-long open reading frame(ORF)which encoding a protein of 250 amino acid residues, named as LcFe-SOD7a. Bioinformatics analysis showed that the protein encoded by LcFe-SOD7a with transmembrane helices was hydrophilic, stable and acidic protein, mainly located in the microbody(peroxisome)and cytoplasm, and had a variety of phosphorylation sites. The genomic sequence of LcFe-SOD7a with a length of 2 284 bp was consisted of seven introns, with the fourth intron 920 bp, the longest. Meanwhile, an intron kept alternative splicing gene, named LcFe-SOD7b, which encoding a protein of 207 amino acid residues was obtained, which causing protein encoding terminated in advance.

      Key words An ancient litchi tree; Embryogenic callus; Fe-SOD; Cloning; Alternative splicing; Bioinformatics

      doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.01.013

      超氧化物歧化酶(SOD)是一種廣泛存在于生物體中的金屬酶,具有防御氧毒性、清除體內(nèi)氧自由基等作用,在植物抗氧化、抗逆等方面起著關(guān)鍵的作用[1]。該酶分為Fe-SOD、Mn-SOD和Cu/Zn-SOD三種類型。各類型在生物體中都發(fā)揮著重要的作用,相互協(xié)調(diào)又各有分工。對(duì)SOD的轉(zhuǎn)基因煙草[2]、擬南芥[3]、苜蓿[4]、土豆[5]、水稻[6]等研究結(jié)果表明:葉綠體SOD的過量表達(dá),提高了它們抗氧化脅迫的能力。以往的研究結(jié)果表明,在轉(zhuǎn)SOD基因植株中的SOD過量表達(dá)能不同程度的提高植物抗氧化脅迫能力。其中,F(xiàn)e-SOD的研究相對(duì)較少,McKersie曾報(bào)道在紫花苜蓿中過量表達(dá)Fe-SOD可以增強(qiáng)其對(duì)嚴(yán)寒冬季的耐受力[7];郁萬文等[8]研究發(fā)現(xiàn)梯度低溫處理能夠誘導(dǎo)銀杏總的SOD活性升高,而在4 ℃低溫處理中,銀杏Mn-SOD和Fe-SOD表達(dá)量都有大幅度提高,說明銀杏中Mn-SOD和Fe-SOD參與了銀杏對(duì)低溫脅迫的適應(yīng);Fe-SOD在煙草和玉米葉綠體中的過量表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因煙草和玉米對(duì)質(zhì)膜的光系統(tǒng)II的保護(hù)作用和對(duì)除草劑引起的氧化脅迫的耐受性,但它們對(duì)冷害和鹽脅迫的耐受性并沒有提高[9-10]。

      荔枝(Litchi chinesis Sonn.)原產(chǎn)我國,屬于無患子科(Sapindaceae)荔枝屬(Litchi),是亞熱帶常綠喬木果樹,為嶺南四大佳果之一,具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。古樹的價(jià)值重大,包括文化、經(jīng)濟(jì)和科學(xué)研究等,被譽(yù)為“活化石”,是極其寶貴的植物種質(zhì)資源[11]?!八卫蟆弊鳛榍甑睦笾艠?,是一道特異的自然、園林和人文景觀,具有較高的研究意義。其歷經(jīng)千百年的歷史滄桑,長時(shí)間復(fù)雜的氣候考驗(yàn),不僅表現(xiàn)了強(qiáng)大的生存適應(yīng)能力,代表著荔枝的長期演化過程,擁有其長久的生存機(jī)制。SOD基因家族在植物的整個(gè)生命歷程中作為抗氧化系統(tǒng)的第一道防線,是維持植物生長過程中活性氧的代謝平衡的基礎(chǔ),防止其衰老而歷經(jīng)千年,在荔枝古樹的生長過程中是否擁有其自身獨(dú)特的作用機(jī)理有待研究,許珊珊[12]對(duì)本品種進(jìn)行了SOD基因的克隆與表達(dá)研究,獲得SOD家族的12個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄本,其中9個(gè)Fe-SOD,1個(gè)Mn-SOD和2個(gè)Cu/Zn-SOD。本研究在前期工作基礎(chǔ)上,選擇荔枝古樹“宋荔”花藥誘導(dǎo)而來的胚性愈傷組織為試驗(yàn)材料,采用同源克隆和RACE方法,對(duì)荔枝古樹SOD基因家族中剩余的Fe-SOD成員進(jìn)行了克隆和生物信息學(xué)分析,這為了解Fe-SOD在荔枝古樹胚性愈傷組織保存中的分子機(jī)制,以及進(jìn)一步完善、全面研究Fe-SOD基因在荔枝古樹中的時(shí)空表達(dá)特性、探索其調(diào)控途徑、作用的分子機(jī)理和轉(zhuǎn)基因的抗逆性奠定基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 材料

      采自福州西禪寺的“宋荔”花藥誘導(dǎo)而來并每隔20 d繼代培養(yǎng)的胚性愈傷組織,由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所保存。

      1.2 方法

      1.2.1 總RNA和DNA的提取及模板的合成 采用Tripure Isolation Reagent(Roche)和改良CTAB法[13]分別提取總RNA和DNA,并分別經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)質(zhì)量和純度。采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)試劑盒及AP作為接頭引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈用于保守區(qū)及3′ RACE擴(kuò)增。而Clontech的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit合成5′ RACE的模板。

      1.2.2 引物的設(shè)計(jì)合成 檢索GenBank上登錄的與荔枝親緣關(guān)系較近物種的Fe-SOD的同源序列,設(shè)計(jì)簡并引物擴(kuò)增保守區(qū)。根據(jù)保守區(qū)的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)3′ RACE和5′ RACE的兩條正向和兩條反向基因特異引物分別與3′端的通用引物AUAP和5′端的通用引物UPM擴(kuò)增其3′端和5′端。將所獲得的序列片段進(jìn)行拼接,并根據(jù)相近物種的Fe-SOD基因組序列設(shè)計(jì)ORF框驗(yàn)證及該基因的基因組序列引物。本研究所用引物設(shè)計(jì)及序列分析都采用DNAMAN6.0軟件完成,設(shè)計(jì)好的引物均委托華大基因公司合成。本研究中使用的引物見表1。

      1.2.3 目的片段擴(kuò)增 基因及基因組序列擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為:模板1 μL(5 ng/μL);上、下游引物各1 μL(10 μmol/L);DreamTaq Green PCR Master Mix(2×)12.5 μL;加ddH2O至總體積25 μL。

      PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性45 s,退火30 s(各退火溫度見表1),72 ℃延伸按1 min/kb計(jì)算,共35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min,10 ℃保存。

      1.2.4 目的片段的回收、克隆和測(cè)序 通過瓊脂糖(1%)電泳檢測(cè)基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,割膠回收目的片段。連接pMD18-T,并轉(zhuǎn)化DH5a,挑取陽性克隆子菌液檢測(cè)合格后送華大基因公司測(cè)序。

      1.2.5 LcFe-SOD的生物信息學(xué)分析 首先使用GSDS軟件及DNAMAN6.0軟件對(duì)基因組序列進(jìn)行內(nèi)含子及可變剪接分析。其次,利用ExPASy Protparam預(yù)測(cè)其基本理化性質(zhì);SignalP 4.1 Server和PSORT預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)信號(hào)肽與亞細(xì)胞定位情況;蛋白質(zhì)跨膜區(qū)段的預(yù)測(cè)使用EMBnet TMpred程序;以NCBI-CDS預(yù)測(cè)分析保守結(jié)構(gòu)域;EMBnet COILS用來預(yù)測(cè)蛋白卷曲螺旋結(jié)構(gòu);蛋白質(zhì)二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)使用PredictProtein、PSIPRED和SWISS-MODEL在線軟件;NetPhos 2.0對(duì)蛋白磷酸化位點(diǎn)及分布進(jìn)行預(yù)測(cè);PredictProtein預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)具體的功能位點(diǎn);分子系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建使用MEGA5.02軟件(Neighbor-Joining,鄰位相連法,NJ)。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 荔枝古樹胚性愈傷組織Fe-SOD cDNA全長的擴(kuò)增及測(cè)序

      LcFe-SOD基因保守區(qū)擴(kuò)增電泳檢測(cè)結(jié)果得到約600 bp的特異性條帶(圖1-A-1),與預(yù)期目的條帶大小相符,測(cè)序?yàn)?15 bp。并將測(cè)序得到的序列在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中在線進(jìn)行Blast,顯示與其它物種的Fe-SOD基因有高度的同源性,其中同龍眼中的DlFSD1b基因僅個(gè)別堿基差別。初步推斷它們是荔枝LcFe-SOD基因的保守序列。

      LcFe-SOD的3′端擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果得到約500 bp的特異性條帶(圖1-B-3),與預(yù)期目的條帶大小相符,測(cè)序?yàn)?90 bp。測(cè)序結(jié)果和軟件分析結(jié)果表明:所得3′ RACE序列與保守區(qū)序列有90 bp的重復(fù)片段,并經(jīng)NCBI上Blast表明,所得序列為荔枝LcFe-SOD基因的3′端序列。

      LcFe-SOD的5' RACE的擴(kuò)增產(chǎn)物為約400 bp的條帶(圖1-B-5),與預(yù)期目的條帶大小相符,測(cè)序?yàn)?01 bp。測(cè)序和軟件分析結(jié)果表明:所得序列與保守區(qū)序列有120 bp的重復(fù)片段。并經(jīng)NCBI上Blast表明,所得序列為荔枝LcFe-SOD基因的5′端序列。

      將實(shí)驗(yàn)獲得LcFe-SOD基因的5′ RACE序列、保守區(qū)序列和3′ RACE序列進(jìn)行拼接。設(shè)計(jì)相應(yīng)ORF驗(yàn)證引物,擴(kuò)增所得電泳條帶如圖1-C-6,測(cè)序得到長達(dá)857 bp,與拼接所得序列一致。因此,獲得該基因全長1 285 bp,包含146 bp的5′ UTR,753 bp的ORF及386 bp的3′ UTR(含poly A),將所得序列全長翻譯得該序列由250個(gè)氨基酸組成。在線進(jìn)行Blast分析表明所得片段為荔枝LcFe-SOD的基因序列,命名為LcFe-SOD7a(GenBank登入號(hào):KC492109)。

      2.2 荔枝古樹胚性愈傷組織LcFe-SOD7a基因組序列擴(kuò)增及內(nèi)含子分析

      荔枝古樹胚性愈傷組織LcFe-SOD7a基因組序列的PCR擴(kuò)增圖像顯示約2 200 bp處得1特異性條帶(圖1-D-8)。測(cè)序得LcFe-SOD7a基因組全長2 284 bp,將該擴(kuò)增序列與ORF的cDNA序列進(jìn)行比對(duì),結(jié)果顯示除了內(nèi)含子序列外,其它序列完全一致。DNAMEN比對(duì)和GSDS軟件分析表明,發(fā)現(xiàn)該基因由7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子組成,其內(nèi)含子剪接位點(diǎn)符合真核生物GT-AG規(guī)則,所得序列結(jié)構(gòu)如圖2。外顯子的長度依次為72、66、192、172、74、27、24、126 bp,平均長度為94 bp;內(nèi)含子的長度個(gè)別波動(dòng)相對(duì)較大,分別為80、83、91、920、71、101、81 bp,平均長度為204 bp,其最長達(dá)920 bp,占該基因組長度的40.28%。將荔枝LcFe-SOD7a的基因組與相應(yīng)的龍眼基因組比較發(fā)現(xiàn),其同源性高達(dá)88.00%。

      2.3 荔枝胚性愈傷組織LcFe-SOD7a基因可變剪接獲得與分析

      在對(duì)LcFe-SOD7a基因ORF驗(yàn)證的過程中,挑取單克隆子進(jìn)行菌液PCR鑒定,發(fā)現(xiàn)其中1個(gè)單克隆子條帶上存在差異(圖1-C-6),將兩管菌液分別測(cè)序。測(cè)序得1條長857 bp的序列,其序列與拼接的序列完全符合,而另一條長928 bp的序列。將兩條基因比對(duì),發(fā)現(xiàn)后者僅在中間多出71 bp,其它堿基序列完全相同。將兩者和基因組序列比對(duì),所得的928 bp序列插入了完整的第5個(gè)內(nèi)含子,從而多出71 bp,為LcFe-SOD7a基因的1條可變剪接基因,屬內(nèi)含子駐留型[14-15]。將該可變剪接序列進(jìn)行翻譯,其序列有完整的編碼框,相對(duì)于LcFe-SOD7a的編碼序列,其終止密碼子提早出現(xiàn),產(chǎn)生了一個(gè)與原蛋白質(zhì)有很大部分重疊的新的蛋白質(zhì)。將該可變剪接基因命名為LcFe-SOD7b(GenBank登入號(hào):KC492110)。這和龍眼的DlFSD1b基因[15]類似。

      2.4 荔枝胚性愈傷組織LcFe-SOD7a、LcFe-SOD7b基因的生物信息學(xué)分析

      2.4.1 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析 對(duì)荔枝胚性愈傷組織LcFe-SOD7a、LcFe-SOD7b基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進(jìn)行分析,初步了解該蛋白的生理生化特性,為探討其功能和作用的分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。首先,利用ExPASy ProtParam工具預(yù)測(cè)結(jié)果表明,LcFe-SOD7a蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為28 967.1,總原子數(shù)為4 053,分子式為C1 331H2 002N344O368S8;該蛋白由19種氨基酸組成,其中以亮氨酸(Leu)含量最豐富,比例達(dá)到11.6%,其次是賴氨酸(Lys)占7.2%;該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為33.88;總平均疏水性為-0.435;所帶負(fù)電的氨基酸(Asp+Glu)和正電的氨基酸(Arg+Lys)數(shù)分別為31和28個(gè),理論等電點(diǎn)為6.25;說明該蛋白是穩(wěn)定的、親水的偏酸性蛋白質(zhì)。

      進(jìn)一步使用在線SignalP 4.1軟件和亞細(xì)胞定位分析表明,LcFe-SOD7a基因編碼的蛋白質(zhì)不屬于分泌蛋白,沒有典型的信導(dǎo)肽,定位于微體(過氧化物酶體)的可能性是0.640、細(xì)胞質(zhì)的可能性是0.450,這和同源物種龍眼的結(jié)論[15]完全一致。最后,對(duì) LcFe-SOD7a蛋白的跨膜區(qū)進(jìn)行的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示該蛋白含3個(gè)跨膜螺旋,由外到內(nèi)的跨膜結(jié)構(gòu)只有1個(gè),長達(dá)18個(gè)氨基酸,位于第151~168個(gè)殘基之間,分值為931;而另兩個(gè)是由內(nèi)到外的跨膜結(jié)構(gòu),分別位于第151~169和215~231個(gè)殘基之間,第1個(gè)分值為660,其中第2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)不顯著,分值僅34;分值比較分析,推測(cè)荔枝LcFe-SOD7a蛋白屬跨膜蛋白,其跨膜模型屬于N 末端朝外的由外到內(nèi)進(jìn)行跨膜的可能性很大。綜合上述分析,推測(cè)荔枝Lc-SOD7a蛋白主要存在于微體(過氧化物酶體)和細(xì)胞質(zhì)上,通過由外到內(nèi)的跨膜運(yùn)動(dòng),在荔枝古樹的胚性愈傷組織離體保存中發(fā)揮著生物學(xué)功能。

      LcFe-SOD7b蛋白理化性質(zhì)預(yù)測(cè)表明:該蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為39.40,總平均疏水性為-0.440,帶正、負(fù)電的氨基酸數(shù)分別為22和26個(gè),理論等電點(diǎn)為5.97,說明該蛋白也是穩(wěn)定的、親水的酸性蛋白質(zhì)。定位于微體(過氧化物酶體)和細(xì)胞質(zhì)的可能性分別為0.640和0.450,與LcFe-SOD7a一致,說明該基因的定位信號(hào)位點(diǎn)位于該基因的前半部??缒し治霰砻?,存在2個(gè)跨膜螺旋,跨膜模型也是傾向于N 末端朝外的由外到內(nèi)進(jìn)行跨膜。綜上分析,兩蛋白的理化性質(zhì)相近,推測(cè)兩者行使相同的生理生化作用,相輔相成,共同調(diào)控著荔枝古樹胚性愈傷組織的離體保存。

      2.4.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特征分析 蛋白結(jié)構(gòu)與其發(fā)揮的功能密切相關(guān)。首先,通過NCBI-CDS在線分析LcFe-SOD7a保守結(jié)構(gòu)域,該蛋白含有SOD_Fe_C和SOD_Fe_N兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,以上兩結(jié)構(gòu)域同屬PLN02622多結(jié)構(gòu)域(圖3)。EMBnet COILS顯示,僅在參數(shù)window=14的情況下,LcFe-SOD蛋白在氨基酸序列約165~185之間有形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的可能性。通過PredictProtein在線軟件分析其蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果表明該蛋白不含普通的二級(jí)結(jié)構(gòu),無NORS區(qū)域,主要由51.2%的螺旋(Helix),6.8%的Strand,42%的環(huán)(Loop)構(gòu)成。PSIPRED也表明LcFe-SOD7a蛋白的結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、β折疊和無規(guī)則卷曲組成,其中β折疊和無規(guī)則卷曲分布在整個(gè)氨基酸序列中。同時(shí)利用軟件SWISS-MODEL對(duì)荔枝LcFe-SOD7a進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè),結(jié)果如圖4-A。

      LcFe-SOD7b的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析表明:也含有SOD_Fe_C和SOD_Fe_N兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,無NORS區(qū)域,主要由45.4%的螺旋(Helix),10.6%的Strand,44%的環(huán)(Loop)構(gòu)成,三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4-B。從圖中也可以看出LcFe-SOD7a結(jié)構(gòu)與LcFe-SOD7b無明顯差異,LcFe-SOD7a僅比LcFe-SOD7b多出部分結(jié)構(gòu)。因此推測(cè)該可變剪接基因與原基因有著相同的功能,共同調(diào)控,協(xié)調(diào)發(fā)揮該基因的應(yīng)有功能。

      2.4.3 氨基酸序列翻譯后的磷酸化修飾預(yù)測(cè) 蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后最常見和最重要的一種修飾方式,生物體內(nèi)的許多生命活動(dòng)都有參與和調(diào)控。通過蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化,調(diào)控信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)、細(xì)胞周期等諸多細(xì)胞過程[16]。采用在線軟件NetPhoS 2.0和PredictProtein分析LcFe-SOD7a蛋白潛在的磷酸化位點(diǎn),有助于了解荔枝LcFe-SOD7a蛋白在翻譯后水平上調(diào)控方式。 對(duì)荔枝LcFe-SOD7a基因編碼蛋白通過NetPhoS 2.0預(yù)測(cè)顯示其存在12個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn),如圖5所示,分布于整條多肽鏈中。絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)數(shù)分別是3、2和7。上述結(jié)果表明,LcFe-SOD7a蛋白中磷酸化位點(diǎn)的存在對(duì)LcFe-SOD7a蛋白所發(fā)揮的功能可能是必須的,調(diào)控著荔枝古樹胚性愈傷組織的保存。

      進(jìn)一步通過PredictProtein對(duì)LcFe-SOD7a蛋白具體所含的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果表明,該蛋白含2個(gè)cAMP-和cGMP-dependent蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)(CAMP_PHOSPHO_SITE)、2個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)(PKC_Phospho_site)、2個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)(CK2_ Phospho_site)、2 個(gè)N-?;稽c(diǎn)(Myristyl)和兩個(gè)錳鐵超氧化物酶信號(hào)位點(diǎn)(SOD_MN)(圖3)。這些不同的位點(diǎn)可能賦予有不同的酶活性及蛋白結(jié)構(gòu),而荔枝LcFe-SOD7a蛋白的這些位點(diǎn)組合,從而協(xié)同作用產(chǎn)生不同的生物學(xué)功能,共同調(diào)控荔枝古樹胚性愈傷組織的生長保存。

      LcFe-SOD7b基因編碼蛋白比較分析,NetPhoS 2.0預(yù)測(cè)顯示荔枝存在9個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn),少了3個(gè)酪氨酸;PredictProtein顯示少了兩個(gè)錳鐵超氧化物酶信號(hào)位點(diǎn)(SOD_MN)。

      2.5 荔枝古樹胚性愈傷組織LcFe-SOD7a基因編碼的蛋白質(zhì)同源性和進(jìn)化分析

      同源序列比對(duì)結(jié)果顯示,LcFe-SOD7a翻譯的氨基酸序列與同源物種龍眼(Dimocarpus longan ADK70232)的同源性最高達(dá)96.4%;與模式植物擬南芥的相似性為71.86%;與藻類植物的萊茵衣藻、苔蘚類植物地錢、裸子植物銀杏及單子葉植物玉米相似性分別為43.6%、47.47%、48.63%、63.32%,從數(shù)據(jù)中也體現(xiàn)該基因的進(jìn)化符合經(jīng)典的植物進(jìn)化過程。

      對(duì)來自14條不同物種的Fe-SOD氨基酸序列采用Mega5.02近鄰相接法(Neighbor-Joming,NJ)做進(jìn)化樹分析,進(jìn)化樹中bootstrap值為數(shù)字代表,重復(fù)檢測(cè)1 000次。進(jìn)化樹如圖6所示,該14條序列分成兩個(gè)大分支。其中藻類、苔蘚類、蕨類和裸子植物為一大分支;被子植物為另一大分支。在被子植物中,單子葉植物和雙子葉植物各位一支。從該進(jìn)化樹上可以看出,該基因的進(jìn)化符合經(jīng)典的物種進(jìn)化過程。

      3 討論與結(jié)論

      3.1 生物信息學(xué)初步推測(cè)荔枝古樹胚性愈傷組織LcFe-SOD7a基因的潛在功能分析

      荔枝古樹在整個(gè)生長發(fā)育過程中歷經(jīng)千年必然受到各種逆境的影響,如臺(tái)風(fēng)、亞熱帶的異常高溫、輻射、鹽堿、病原菌侵染和人為破壞等,這些逆境因素均能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生大量的超氧化物陰離子自由基,而大量自由基的積累容易導(dǎo)致植物的早衰。但荔枝古樹卻歷經(jīng)千年而不衰,其內(nèi)部活性氧的生成和清除能夠千年地維持在動(dòng)態(tài)平衡之中,是值得研究的關(guān)鍵。這種動(dòng)態(tài)平衡的維持主要是通過超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)等酶或非酶類的胡蘿卜素(CAR)、抗壞血酸(ASA)和還原性谷胱甘肽(GSH)反應(yīng)進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)節(jié)的[17]。其中SOD作為抗氧化系統(tǒng)的第一道防線,必然起著不可替代的作用。對(duì)LcFe-SOD7a基因的生物信息學(xué)分析表明該基因編碼的蛋白是親水的、穩(wěn)定的、具有跨膜結(jié)構(gòu)域的偏酸性蛋白質(zhì)??缒さ鞍资墙閷?dǎo)細(xì)胞與外界之間的信號(hào)傳導(dǎo),處于細(xì)胞與外界的交界部位,并執(zhí)行很多重要的細(xì)胞生物學(xué)功能,例如,參與細(xì)胞膜內(nèi)外物質(zhì)交換、能量和信號(hào)的傳遞;構(gòu)成各種信號(hào)分子、激素和其他底物的受體;構(gòu)成各種離子跨膜的通道,把營養(yǎng)物質(zhì)和一些無機(jī)電解質(zhì)輸入細(xì)胞,而將有毒的或無用的代謝產(chǎn)物排出細(xì)胞等作用[18-19]。因此,跨膜結(jié)構(gòu)域的存在也為該蛋白行使以上功能提供可能。同時(shí)磷酸化位點(diǎn)分析表明,該蛋白存在一些蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn),而大量的研究表明,蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化過程普遍存在于生物體內(nèi),涉及到光合作用、糖代謝、生長發(fā)育、基因表達(dá)等多種生理過程[20-22],表明該蛋白可能在上述生理過程中發(fā)揮某種作用。因此,若要研究該基因的作用機(jī)理,還有待進(jìn)一步研究SOD酶活性變化、定量表達(dá)及功能驗(yàn)證等。

      3.2 荔枝古樹胚性愈傷組織LcFe-SOD7a基因的可變剪接現(xiàn)象及作用分析

      可變剪接被認(rèn)為是導(dǎo)致蛋白功能多樣性的重要原因之一,它使一個(gè)基因可編碼多個(gè)不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白產(chǎn)物[23]。同時(shí),也是產(chǎn)生基因組規(guī)模與生物復(fù)雜性之間的矛盾的根源之一[24]。已有實(shí)驗(yàn)研究表明,可變剪接在產(chǎn)生受體多樣性、控制調(diào)節(jié)生長發(fā)育等方面起決定性作用。在植物界的研究中普遍存在可變剪接現(xiàn)象,龍眼[15]、茄子[25]、番茄[26]、玉米[27]、擬南芥[28]和水稻[29]等都有報(bào)道。其中,在SOD基因家族中,可變剪接現(xiàn)象也普遍存在,林玉玲[15]首次對(duì)木本植物的SOD進(jìn)行了較完整的克隆研究,并對(duì)其可變剪接進(jìn)行了分析。本實(shí)驗(yàn)室湯燕姍[30]、朱偉玲[31]分別對(duì)桃和油柿的SOD研究中,發(fā)現(xiàn)Fe-SOD也都存在可變剪接。利用Z.mays EST數(shù)據(jù)庫分析顯示FSD和CSD基因存在大量變體序列,而這很可能是由于可變剪接或內(nèi)含子不同剪接效率造成的[32]。在楊樹中hipI-SODC1b基因和hipI-SODC1s基因是hipI-SODC1的2個(gè)變體,其中hipI-SODC1b比hipI-SODC1s多出的69 bp正是來自于hipI-SODC的第6個(gè)內(nèi)含子[33]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該基因研究中所得的一條可變剪接,插入了一個(gè)完整的內(nèi)含子,并使序列提前終止,可以翻譯完整的蛋白質(zhì),表現(xiàn)了該基因表達(dá)多樣的蛋白。對(duì)該可變剪切基因的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析表明,兩蛋白之間并未存在顯著差異,可以推測(cè)該可變剪接基因在荔枝古樹胚性愈傷組織離體保存過程中與原基因相互協(xié)調(diào),有著相似的作用機(jī)理。而許珊珊[12]對(duì)荔枝的Fe-SOD其它成員的可變剪接分析表明其可變剪接參與細(xì)胞活性氧的清除是通過影響信號(hào)傳遞和亞細(xì)胞定位來進(jìn)行的,進(jìn)而調(diào)控其保存中的生長發(fā)育。但本實(shí)驗(yàn)對(duì)該可變剪接蛋白質(zhì)是否發(fā)揮了其它的功能作用,以及其表達(dá)量等有待于進(jìn)一步研究。參考龍眼[15]中該成員基因的研究,共得到該基因的4條可變剪接基因,因此,在荔枝中該基因可能還存在其它的可變剪接現(xiàn)象,又或許正是這種可變剪接的差異對(duì)荔枝和龍眼的不同起著一定的影響。

      參考文獻(xiàn)

      [1] Bubliy O, Loeschcke V. Correlated responses to selection for stress resistance and longevity in a laboratory population of Drosophila melanogaster[J]. Journal of Evolutionary Biology, 2005, 18(4): 789-803.

      [2] Van Camp W, Capiau K, Van Montagu M, et al. Enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco plants overproducing Fe-superoxide dismutase in chloroplasts[J]. Plant physiology, 1996, 112(4): 1 703-1 714.

      [3] Tsugane K, Kobayashi K, Niwa Y, et al. A recessive Arabidopsis mutant that grows photoautotrophically under salt stress shows enhanced active oxygen detoxification[J]. The Plant Cell Online, 1999, 11(7): 1 195-1 206.

      [4] McKersie B D, Chen Y, de Beus M, et al. Superoxide dismutase enhances tolerance of freezing stress in transgenic alfalfa(Medicago sativa L.)[J]. Plant physiology, 1993, 103(4): 1 155-1 163.

      [5] Perl A, Perl-Treves R, Galili S, et al. Enhanced oxidative-stress defense in transgenic potato expressing tomato Cu, Zn superoxide dismutases[J]. TAG Theoretical and Applied Genetics, 1993, 85(5): 568-576.

      [6] Tanaka Y, Hibino T, Hayashi Y, et al. Salt tolerance of transgenic rice overexpressing yeast mitochondrial Mn-SOD in chloroplasts[J]. Plant Science, 1999, 148(2): 131-138.

      [7] McKersie B D, Murnaghan J, Jones K S, et al. Iron-superoxide dismutase expression in transgenic alfalfa increases winter survival without a detectable increase in photosynthetic oxidative stress tolerance[J]. Plant physiology, 2000, 122(4): 1 427-1 438.

      [8] 郁萬文, 曹福亮, 汪貴斌,等. 銀杏抗氧化酶系統(tǒng)對(duì)短期梯度變溫的響應(yīng)[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 30(2): 252-255.

      [9] Van Breusegem F, Slooten L, Stassart J M, et al. Overproduction of Arabidopsis thaliana FeSOD confers oxidative stress tolerance to transgenic maize[J]. Plant and cell physiology, 1999, 40(5): 515-523.

      [10] Van Camp W, Bowler C, Villarroel R, et al. Characterization of iron superoxide dismutase cDNAs from plants obtained by genetic complementation in Escherichia coli[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1990, 87(24): 9 903-9 907.

      [11] 賴鐘雄, 李煥苓. 古樹名木基因資源的挖掘與利用[J]. 國土綠化, 2007(5): 6-7.

      [12] 許珊珊. 福州荔枝古樹離體種質(zhì)保存及抗性基因SOD的克隆與表達(dá)[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2012.

      [13] 丁曉東, 呂柳新. 從頑拗植物荔枝中提取基因組DNA技術(shù)的研究[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào), 2000, 6(2): 142-145.

      [14] Werneke J M, Chatfield J M, Ogren W L. Alternative mRNA splicing generates the two ribulosebisphosphate carboxylase/ oxygenase activase polypeptides in spinach and Arabidopsis[J]. The Plant Cell Online, 1989, 1(8): 815-825.

      [15] 林玉玲. 龍眼體胚發(fā)生過程中SOD基因家族的克隆及表達(dá)調(diào)控研究[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2011.

      [16] 姜 錚, 王 芳, 何 湘, 等. 蛋白質(zhì)磷酸化修飾的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通訊, 2009(2): 233-237.

      [17] Gupta S D, Datta S. Antioxidant enzyme activities during in vitro morphogenesis of gladiolus and the effect of application of antioxidants on plant regeneration[J]. Biologia Plantarum, 2003, 47(2): 179-183.

      [18] Rinalducci S, Zolia L, Timperio A M. Photosynthetic membrane proteomics[J]. Plant molecules: basic and applied research, 2006, 5: 99.

      [19] Aldape M J, Elmer A M, Chao W S, et al. Identification and characterization of a sucrose transporter isolated from the developing cotyledons of soybean[J]. Archives of biochemistry and biophysics, 2003, 409(2): 243-250.

      [20] Gilbert C, Gaudry M, Naccache P H. Rapid priming of calcium mobilization and superoxide anion production in human neutrophils by substimulatory concentrations of phorbol esters: a novel role for protein kinase C and tyrosine phosphorylation in the up-modulation of signal transduction[J]. Cellular signalling, 1992, 4(5): 511-523.

      [21] Ahmed K, Davis A T, Wang H, et al. Significance of protein kinase CK2 nuclear signaling in neoplasia[J]. Journal of Cellular Biochemistry, 2000, 79(S35): 130-135.

      [22] Lin R, Hiscott J. A role for casein kinase II phosphorylation in the regulation of IRF-1 transcriptional activity[J]. Molecular and cellular biochemistry, 1999, 191(1-2): 169-180.

      [23] Roberts G C, Smith C W. Alternative splicing: combinatorial output from the genome[J]. Current opinion in chemical biology, 2002, 6(3): 375-383.

      [24] Harrison P M, Kumar A, Lang N, et al. A question of size: the eukaryotic proteome and the problems in defining it[J]. Nucleic acids research, 2002, 30(5): 1 083-1 090.

      [25] 羅 艷, 王 瑛. 茄子SmU2AF 65基因的可變剪接[J]. 遺傳, 2008, 30(11): 1 499-1 505.

      [26] 宋曉毅, 徐幼平, 張志新, 等. 8個(gè)番茄ACE全長cDNA序列的克隆和分析[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2009, 35(3): 249-254.

      [27] 王存芳, 李記園, 王茅雁. 玉米ZmCBL5-2基因的克隆及其轉(zhuǎn)化擬南芥[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2011, 32(1): 162-166.

      [28] Iida K, Seki M, Sakurai T, et al. Genome-wide analysis of alternative pre-mRNA splicing in Arabidopsis thaliana based on full-length cDNA sequences[J]. Nucleic acids research, 2004, 32(17): 5 096-5 103.

      [29] 康海岐, 申國安, 程在全, 等. 水稻ⅡB型拓?fù)洚悩?gòu)酶OsSpo11基因的cDNA克隆, 表達(dá)譜分析及其可變剪接的檢測(cè)[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2008, 47(1): 88-92.

      [30] 湯燕姍. 桃梨離體保存及桃SOD基因的克隆[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2012.

      [31] 朱偉玲. 福建柿子種質(zhì)資源離體保存及其試管苗葉片SOD基因克隆[D]. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué), 2012.

      [32] Katyshev A, Rogozin I, Konstantinov Yu M. identification of new superoxide dismutase transcripts in plants by est analysis: alternative polyadenylation and splicing events[J]. Computational structural and functional genomics and transcriptomics, 2006.

      [33] Srivastava V, Srivastava M K, Chibani K, et al. Alternative splicing studies of the reactive oxygen species gene network in Populus reveal two isoforms of high-isoelectric-point superoxide dismutase[J]. Plant physiology, 2009, 149(4): 1 848-1 859.

      責(zé)任編輯:沈德發(fā)

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