李永青 趙祥忠 張合亮

LI Yong－qing 1 ZH AO Xiang－zhong 2 ZHANG He－liang 2

姜雙雙1 楊曉宙

JIANG Shuang－shuang 1 YANG Xiao－zhou 1

（1.國(guó)家海產(chǎn)貝類工程技術(shù)研究中心，山東 威海 264200；2.齊魯工業(yè)大學(xué)，山東 濟(jì)南 250353）

（1.National Marine Shellfish Engineering Technology Research Center，Weihai，Shandong 264200，China；2.Qilu University of Technology，Jinan，Shandong 250353，China）

中國(guó)每年貝類的產(chǎn)量在1 200萬(wàn)t左右，其加工下腳料占貝肉總量的25%以上［1］。目前，貝類下腳料除小部分被用作食品加工外，大部分用于飼料生產(chǎn)，資源浪費(fèi)嚴(yán)重。這些貝類加工下腳料主要由貝類裙邊、性腺和內(nèi)臟團(tuán)等組成，營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成比例合理，活性成分含量也較多，可用于生產(chǎn)功能性的貝類寡肽產(chǎn)品［2］。目前，貝類下腳料的研究主要以生產(chǎn)貝類蛋白質(zhì)粉和氨基酸為主，如汪濤等［3，4］研究了扇貝邊的酶解技術(shù)，并利用貝類廢棄物制造了水解動(dòng)物蛋白；遲玉森等［5］研究了扇貝裙邊酶解中溫度對(duì)氨基氮的影響和抑臭工藝的確定；紀(jì)蓓等［6］研究了扇貝邊酶法水解工藝的優(yōu)化；李愛(ài)芬等［7］研究了扇貝邊蛋白資源酶法水解條件的優(yōu)化；于利君等［8］研究了羅非魚(yú)蛋白制備寡肽酶解條件的優(yōu)化；張文芬等［9］研究了鳙魚(yú)肉可溶性蛋白酶解條件優(yōu)化；徐律等［10］選用胰蛋白酶將菲律賓蛤仔酶解制備了具有抗前列腺癌PC－3細(xì)胞的寡肽。但未見(jiàn)利用扇貝邊和鮑魚(yú)邊制備貝類寡肽的研究報(bào)道。諾維信堿性蛋白酶是一種高效堿性內(nèi)切蛋白酶，能快速?gòu)氐姿飧鞣N蛋白質(zhì)，尤其適合于水產(chǎn)下腳料、酵母精等行業(yè)的蛋白水解過(guò)程。而諾維信風(fēng)味蛋白酶可以有效去除蛋白鏈上的疏水基團(tuán)，能最大限度的避免蛋白水解過(guò)程中苦味肽的產(chǎn)生，適合水解產(chǎn)物用于食品或食品配料時(shí)使用。本研究擬以貝類下腳料為原料，選用酶法制備分子量在1～10 k D的貝類寡肽，以期為貝類寡肽的工業(yè)化生產(chǎn)提供有力的理論支持和技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

貝類裙邊（扇貝邊、鮑魚(yú)邊）：威海長(zhǎng)青海洋科技股份有限公司；

乙醇、甲醛：分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；

氫氧化鈉、硼酸：分析純，天津市博迪化工有限公司；

硫酸：分析純，深圳市多源化工有限公司；

硫酸鉀：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司

堿性蛋白酶（alcalase 2.4 L FG）：5萬(wàn) U／g，諾維信公司；

風(fēng)味蛋白酶（novozyme flavourzyme）：1萬(wàn) U／g，諾維信公司；

超微粉碎機(jī)：WK－10型，山東省青州市精誠(chéng)醫(yī)藥裝備制造有限公司；

真空冷凍升華干燥機(jī)：LGJ－0.5型，上海昨非實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；

超濾膜過(guò)濾機(jī)：UF－500L／H型，無(wú)錫市超濾膜設(shè)備廠；

納濾過(guò)濾機(jī)：NF1812型，無(wú)錫市超濾膜設(shè)備廠；

噴霧干燥機(jī)：SP－1500型，上海達(dá)程實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 測(cè)定方法

（1）蛋白質(zhì)：凱氏定氮法。

（2）游離氨基酸：甲醛滴定法。

（3）貝類寡肽含量：首先用凱氏定氮法測(cè)定酶解前溶液中蛋白質(zhì)的百分含量，再用甲醛滴定法測(cè)定酶解液中游離氨基酸的百分含量，則溶液中貝類寡肽的百分含量：

式中：

m——貝類寡肽的百分含量，%；

M——酶解前溶液中蛋白質(zhì)的百分含量，%；

M1——酶解液中游離氨基酸的百分含量，%。

（4）貝類寡肽得率：首先用凱氏定氮法測(cè)定酶解前溶液中蛋白質(zhì)的百分含量，再用甲醛滴定法測(cè)定酶解液中游離氨基酸的百分含量，則溶液中貝類寡肽的得率：

式中：

R——貝類寡肽得率，%；

M——酶解前溶液中蛋白質(zhì)的百分含量，%；

M1——酶解液中游離氨基酸的百分含量，%。

1.2.2 貝類寡肽生產(chǎn)工藝

1.2.3 前處理工藝對(duì)酶解效果的影響 稱取重量相等的3份貝類裙邊，分別采用組織搗碎機(jī)打漿處理、凍干后粉碎處理和熱風(fēng)烘干后直接粉碎處理，各配制成10 g／100 m L的溶液，調(diào)整p H為8.0，各加入300 U／g的堿性蛋白酶，在55℃下酶解60 min，然后測(cè)定貝類寡肽的得率，并用300目濾網(wǎng)過(guò)濾酶解液，觀察過(guò)濾效果。

1.2.4 復(fù)合酶協(xié)同酶解工藝條件優(yōu)化 選用諾維信堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行貝類裙邊的酶解試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定貝類寡肽得率確定最佳用酶。進(jìn)行底物濃度、加酶量、p H值、酶解溫度和酶解時(shí)間單因素試驗(yàn)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝和參數(shù)。

（1）蛋白酶種類的確定：分別進(jìn)行單一酶酶解和協(xié)同酶解（復(fù)合添加量1∶1）試驗(yàn)。單一酶解：分別配制12 g／100 m L的貝類裙邊溶液，添加堿性蛋白酶的一組調(diào)節(jié)p H至8.0（添加風(fēng)味蛋白酶的一組調(diào)節(jié)p H 為7.0），加入500 U／g的堿性蛋白酶（風(fēng)味蛋白酶），控制55℃酶解60 min，測(cè)定貝類寡肽含量；協(xié)同酶解操作條件同上，需注意調(diào)節(jié)p H為7.5，復(fù)合酶添加量500 U／g（堿性蛋白酶∶風(fēng)味蛋白酶＝1∶1），最后測(cè)定貝類寡肽含量。

（2）貝類裙邊溶液濃度對(duì)寡肽含量的影響：分別配制6，8，10，12，14，16 g／100 m L的貝類裙邊溶液，用0.5 mol／L的NaOH溶液調(diào)節(jié)p H值至7.5，加入500 U／g的復(fù)合酶，控溫55℃酶解60 min，測(cè)定貝類寡肽含量。

（3）加酶量對(duì)貝類寡肽得率的影響：分別在12 g／100 m L的貝類裙邊溶液中加入200，300，400，500，600，700，800 U／g的復(fù)合酶，調(diào)整p H 為7.5，控溫55℃酶解60 min，測(cè)定貝類寡肽含量。

（4）p H值對(duì)貝類寡肽得率的影響：用0.1 mo L／L的鹽酸溶液和NaOH溶液調(diào)整濃度為12 g／100 m L貝類裙邊溶液的p H 分別為 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，分別加入500 U／g的復(fù)合酶，控溫55℃酶解60 min，測(cè)定貝類寡肽含量。

（5）酶解溫度對(duì)貝類寡肽得率的影響：配制12 g／100 m L的 貝類 裙 邊 溶液，調(diào) 節(jié) p H 至7.5，加 入500 U／g的復(fù)合酶，分別控制酶解溫度為45，50，55，60，65℃，酶解60 min，測(cè)定貝類寡肽含量。

（6）酶解時(shí)間對(duì)貝類寡肽得率的影響：配制12 g／100 m L的貝邊粉溶液，調(diào)p H至7.5，加入500 U／g的酶，控溫55℃，酶解時(shí)間分別為30，40，50，60，70，80 min，測(cè)定貝類寡肽含量。

1.2.5 貝類寡肽純化的研究 酶解后的溶液中含有未降解的大分子蛋白質(zhì)、多肽、寡肽、氨基酸和水等，為提高寡肽產(chǎn)品的純度，分別采用微濾、超濾聯(lián)用技術(shù)除去酶解液中的蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸和水，收集1～10 kD的濾液，噴霧干燥后得到粉末狀貝類寡肽產(chǎn)品。

試驗(yàn)中首先選用陶瓷微濾膜（200 nm）對(duì)酶解液過(guò)濾，除去大分子的蛋白質(zhì)，過(guò)濾條件為溫度30℃，過(guò)濾壓力0.05 MPa；濾過(guò)液再分別經(jīng)截留分子量為50，10，1 k D的聚砜超 濾 膜 依 次 過(guò) 濾，超 濾 膜 壓 力 依 次 為 0.05，0.10，0.15 MPa。其中，50 k D的超濾膜可以將小分子的蛋白和部分多肽分離出去，同時(shí)減輕10 kD超濾膜的壓力，1 k D的聚砜膜除去的是絕大部分氨基酸和水分，收集10 k D與1 kD之間的濾液。

過(guò)濾后的酶解液先經(jīng)過(guò)微濾再進(jìn)行分級(jí)超濾處理，截取中間截濾液，然后噴霧干燥制備貝類寡肽產(chǎn)品。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理工藝對(duì)酶解效果的影響

由表1可知，凍干粉碎后貝類裙邊的酶解徹底，寡肽得率高，比打漿法寡肽得率多2.06%，提高了91.1%，熱風(fēng)烘干后粉碎次之，這是因?yàn)樨愵惾惯呌绕涫秦愵惾惯叺慕M織結(jié)構(gòu)非常致密，常規(guī)的高速組織搗碎機(jī)和熱風(fēng)干燥后粉碎難以將貝類裙邊打成均勻的細(xì)漿狀，由于打漿處理后的貝類下腳料組織大小不勻，導(dǎo)致較大的裙邊組織在酶解過(guò)程中難以水解，而細(xì)小的組織卻會(huì)因酶解時(shí)間的延長(zhǎng)導(dǎo)致寡肽進(jìn)一步降解為游離氨基酸。

表1 前處理工藝對(duì)酶解效率的影響Table 1 The influence of different treatment on enzymatic hydrolysis efficiency

真空冷凍干燥的凍結(jié)過(guò)程中在貝類肌肉細(xì)胞和組織之間可形成許多細(xì)小的冰晶，這些冰晶在升華階段可直接汽化，在貝肉組織中形成許多氣孔，使貝肉組織容易粉碎，粉碎后的顆粒也變得蓬松，溶解速度快，酶解效果好；貝類裙邊凍干后水分含量可以降低到5%左右，此時(shí)貝類裙邊的韌性由于水分較低而消失，脆性增強(qiáng)，適宜于粉碎處理。

因此，貝類裙邊酶解前采用真空冷凍干燥后再粉碎處理，有利于酶解的進(jìn)行，可有效提高酶解效率。

2.2 復(fù)合酶協(xié)同酶解工藝條件優(yōu)化

2.2.1 蛋白酶種類的確定 由表2可知，堿性蛋白酶的酶解效果最好，寡肽得率最高，酶解液苦味較重；風(fēng)味蛋白酶的酶解效果一般，酶解液中苦味最不明顯；堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶按1∶1的比例協(xié)同酶解效果較好，寡肽得率也較高，而且酶解液的苦味也明顯減輕?？紤]到貝類寡肽產(chǎn)品的食用適口性問(wèn)題，因此，確定最佳降解用酶為堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶協(xié)同使用，兩者復(fù)合使用比例為1∶1。

2.2.2 貝類裙邊溶液濃度對(duì)寡肽得率的影響 由圖1可知，隨貝類裙邊溶液濃度的不斷增加，貝類寡肽得率逐漸提高，當(dāng)濃度接近12 g／100 m L時(shí)，上升趨勢(shì)趨于平緩，繼續(xù)增加溶液濃度，寡肽得率稍微出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這說(shuō)明當(dāng)下腳料溶液濃度超過(guò)最適底物濃度后，酶濃度相對(duì)變稀，而且過(guò)多的裙邊會(huì)限制酶的運(yùn)動(dòng)，降低了酶解反應(yīng)。因此，將12 g／100 m L作為最佳貝類裙邊溶液濃度。

圖1 酶解反應(yīng)中底物濃度對(duì)貝類寡肽得率的影響Figure 1 The effect of the concentration of substance on shellfish oligopeptide yield

2.2.3 加酶量對(duì)貝類寡肽得率的影響 由圖2可知，隨加酶量的不斷增加，貝類寡肽得率逐漸提高，當(dāng)濃度接近500 U／g時(shí)，寡肽得率接近最高值，繼續(xù)增加酶量，寡肽得率反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)。這是因?yàn)槌^(guò)最佳酶用量后，過(guò)量的酶會(huì)將寡肽進(jìn)一步降解為氨基酸，導(dǎo)致溶液中寡肽含量降低。因此，確定500 U／g作為貝類裙邊最佳加酶量。

圖2 加酶量對(duì)貝類寡肽得率的影響Figure 2 The effect of enzyme concentration on shellfish oligopeptide yield

表2 不同蛋白酶酶解貝類裙邊效果Table 2 Enzymatic hydrolysis of shellfish skirt by different protease

2.2.4 p H值對(duì)貝類寡肽得率的影響 由圖3可知，p H值對(duì)貝類寡肽得率的影響較大，寡肽得率先隨p H值的增大逐漸升高，p H值7.5時(shí)接近最高值，p H值繼續(xù)增大，寡肽得率反而下降。這是因?yàn)槊糠N酶制劑都有其最適的酸堿環(huán)境，低于或高于其最適p H，酶活性都會(huì)迅速降低。因此，確定貝類裙邊酶解最佳p H為7.5。

圖3 酶解反應(yīng)p H值對(duì)貝類寡肽得率的影響Figure 3 The effect of p H on shellfish oligopeptide yield

2.2.5 酶解溫度對(duì)貝類寡肽得率的影響 由圖4可知，復(fù)合蛋白酶在55℃的條件下酶解反應(yīng)最好，寡肽得率最高，說(shuō)明此條件時(shí)酶活力最大，較低和較高的溫度都不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，超過(guò)最適溫度后復(fù)合酶活力失活比較迅速。因此確定復(fù)合蛋白酶酶解貝類裙邊的最適宜溫度為55℃。

圖4 酶解溫度對(duì)貝類寡肽的影響Figure 4 The effect of temperature on shellfish oligopeptide yield

圖5 酶解時(shí)間對(duì)貝類寡肽得率的影響Figure 5 The effect of time on shellfish oligopeptide yield

2.2.6 酶解時(shí)間對(duì)貝類寡肽得率的影響 由圖5可知，酶解時(shí)間對(duì)貝類寡肽得率的影響較大，寡肽得率先隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，60 min時(shí)接近最高值，繼續(xù)延長(zhǎng)酶解時(shí)間，寡肽得率反而有所下降。這是由于過(guò)度酶解會(huì)導(dǎo)致部分貝類寡肽進(jìn)一步降解為氨基酸，因此，確定貝類裙邊最佳酶解時(shí)間為60 min。

2.3 正交試驗(yàn)確定最佳酶解工藝

綜合以上5個(gè)因素的分析，選取對(duì)貝類寡肽得率影響較大的加酶量、酶解p H、酶解溫度和酶解時(shí)間進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3、4。

表3 正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 The factors and levels graph of experiment

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 4 The statistic analysis of orthogonal experiment

由表4可知，四因素對(duì)寡肽得率影響的順序是A＞C＞B＞D，最佳組合為 A2B2C3D2。由于試驗(yàn)組中沒(méi)有A2B2C3D2組合，因此以A2B2C3D2、A2B2C3D3和A2B2C2D23組進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)（n＝3），結(jié)果A2B2C2D2組的寡肽得率最高，達(dá)到8.43%，因此，確定最佳的酶解條件為：堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶按1∶1的比例復(fù)合使用，添加量500 U／g，貝類裙邊溶液濃度12 g／100 m L，p H值7.5，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間60 min，此時(shí)貝類寡肽得率為8.43%。

2.4 貝類寡肽產(chǎn)品的純化

試驗(yàn)過(guò)程中采用不同的微濾膜、超濾膜等純化處理方式，酶解液中截留分子量、蛋白質(zhì)、游離氨基酸和貝類寡肽含量見(jiàn)表5。

表5 不同膜純化對(duì)酶解液中各成分的影響Table 5 The effect of different membrane on purification of enzymolysis liquid components

收集分子量在1～10 kD的濾液并噴霧干燥，噴霧干燥條件進(jìn)風(fēng)溫度170.0℃、熱空氣流量35.0 m3／h、壓縮空氣流量480.0 L／h、出風(fēng)溫度75～80℃，得到顏色微黃的粉末狀貝類寡肽產(chǎn)品，并測(cè)得貝類寡肽得率為5.16%，其蛋白質(zhì)含量為94.6%，寡肽含量86.8%。

3 結(jié)論

在貝類裙邊水解過(guò)程中，貝邊經(jīng)真空冷凍干燥后粉碎處理，有助于酶解反應(yīng)的進(jìn)行；諾維信中性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶按1∶1的比例復(fù)合后協(xié)同作用既可以快速降解貝類蛋白質(zhì)，又能有效降低酶解液的苦味，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)得出了貝邊最佳酶解參數(shù)為：復(fù)合酶添加量500 U／g，貝類裙邊溶液濃度12 g／100 m L，p H值7.5，酶解溫度55℃，酶解時(shí)間60 min；酶解液經(jīng)過(guò)濾和噴霧干燥后制得了粉末狀的貝類寡肽產(chǎn)品。

本試驗(yàn)未對(duì)制得的分子量在1～10 kD的貝類寡肽的功效進(jìn)行研究，以期后續(xù)研究。

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