林 曦，阮 征，何 鵬，姚子龍，張 余，尹慶水

兔模型鈦基納米棒成骨生物學性能的初步實驗研究

林 曦，阮 征，何 鵬，姚子龍，張 余，尹慶水

目的初步分析納米表面修飾的鈦棒與兔模型骨界面的愈合情況，探討鈦基納米棒的成骨生物學性能。方法場發(fā)射掃描電鏡（FESEM）觀察納米鈦棒的表面形態(tài)，能量分散譜（EDS）分析樣品表面的元素組成。在新西蘭大白兔左右側(cè)脛骨近端隨機植入鈦棒和納米鈦棒2種材料，分別于術后4、12周取材后進行Micro-CT影像學評估和力學測試，對比分析2種材料骨-材料界面結(jié)合強度及破壞載荷的差異。結(jié)果FESEM證實納米棒結(jié)構(gòu)（100nm Ti），EDS分析顯示納米鈦棒表面由100%Ti元素組成。材料植入?yún)^(qū)域未見組織壞死、化膿，植入材料移位、脫落等現(xiàn)象。Micro-CT影像學結(jié)果提示，100 nm Ti植入4、12周后骨-材料界面結(jié)合強度均較Ti組優(yōu)異；生物力學測試結(jié)果表明，材料植入4、12周100nm Ti表面的破壞載荷均明顯高于Ti組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論100 nm Ti可提高兔模型骨-材料界面的結(jié)合強度，促進骨愈合率。

納米結(jié)構(gòu)；鈦；骨愈合；生物力學；兔

鈦（Ti）及鈦合金具有耐磨性好、抗腐蝕性強、力學性能和生物相容性好等特點，是一種理想的關節(jié)植入材料[1]。但作為生物惰性材料，鈦金屬生物活性差，缺乏骨誘導作用，假體周圍可能形成纖維組織包裹，引起骨溶解[2-3]，進而導致假體松動。人們試圖通過假體表面設計，賦予鈦及鈦合金生物活性，達到促進骨生長、提高骨-材料界面強度和骨融合率、延長假體壽命的目的。通過前期細胞學研究，我們發(fā)現(xiàn)Ti表面進行納米棒結(jié)構(gòu)修飾后體外生物相容性良好，其中100 nm Ti表面具有促進間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）早期黏附、增殖、成骨分化和礦化等作用[4]，但其植入動物體后的生物相容性及材料-骨界面結(jié)合程度如何，目前尚不明確。本研究于新西蘭大白兔脛骨近端植入具有100 nm Ti表面的鈦棒，并與傳統(tǒng)鈦棒進行對比，分析其在Micro-CT影像學評估和力學測試結(jié)果等方面的差異，初步了解納米表面修飾鈦棒與骨界面的愈合情況及其成骨生物學性能。

1 材料和方法

1.1 植入材料和表征

材料規(guī)格：圓柱形鈦棒（Ti，光滑表面，3 mm ×8 mm），圓柱形納米鈦棒（Nano Ti，納米棒表面，3 mm×8 mm）。對納米鈦棒予以表面噴金后。采用Nova Nano SEM 430場發(fā)射掃描電子顯微鏡（field emission scanning electron microscopy，F(xiàn)ESEM，德國，ZEISS公司）觀察2種材料的表面微細形態(tài)，并采用EMAX能量分散譜（energy dispersive spectroscopy，EDS）儀（日本，HORIBA公司）分析樣品表面元素組成。

1.2 實驗動物

健康新西蘭兔18只[廣東省實驗動物中心，動物質(zhì)量合格證號（44007600000252）]。體重2.3～3.0 kg，雌雄各半。

1.3 手術步驟

3%戊巴比妥（50 mg/kg）耳緣靜脈麻醉，仰臥位固定動物，2%利多卡因于兔脛骨近端局部麻醉（圖1A）。手術區(qū)域剃毛、碘酒消毒，嚴格按照無菌技術操作，從皮膚、筋膜、肌肉、骨膜逐層進入脛骨近端內(nèi)側(cè)。植入位置用直徑3 mm的鉆頭鉆孔（圖1B），鹽水沖洗降溫。兩組圓柱形材料（Ti和100 nm Ti）隨機植入兔左右下肢，每只動物均植入2個3 mm×8 mm圓柱體材料（圖1C），左右側(cè)各一，材料僅穿透單側(cè)皮質(zhì)。材料置入固定后逐層縫合。

1.4 術后處理

術后口服青霉素40 000U/d，共3 d。分別于術后4、12周耳靜脈空氣注入處死。

1.5 Micro-CT檢測

術后4、12周各取4只新西蘭兔，處死后去除軟組織，清洗取出的股骨，將其切成只余有植入物的小段，于內(nèi)固定系統(tǒng)中干燥存放，以植入材料周圍的松質(zhì)骨區(qū)域，沿種植體軸向半徑1.5 mm的圓圈為興趣區(qū)域進行Micro-CT斷層掃描（掃描模式：Fast模式；像素：40×40 mm；層厚：80 mm）。

1.6 材料-骨界面結(jié)合強度的生物力學測試

術后4、12周各取5只新西蘭兔，處死后立即取下脛骨（圖1D），用磨鉆暴露骨髓腔另一端，使用BOSE3520生物力學測試機（美國，BOSE公司）進行推出實驗。距離植入材料上下各1 cm處將脛骨垂直截成小段，修理好的組織塊置入大小合適的磨具中，將測試機器壓力軸（采用直徑同植入材料一致的3 mm金屬棒）對準材料中心，以0.5 mm/min的速度垂直加力，記錄最大推出載荷，以此測試材料-骨界面的結(jié)合強度。

1.7 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x-±s）表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗和配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 手術過程圖片 1A局部麻醉 1B暴露脛骨干骺端并鉆孔 1C材料植入 1D術后4周取出脛骨

2 結(jié)果

2.1 材料的表征

圖2為鈦基納米棒的FESEM形態(tài)，可觀察到鈦表面制備出納米突起，即“納米棒”結(jié)構(gòu)；采用EDS分析100 nm Ti表面和Ti表面的元素組成及元素比例，結(jié)果提示鈦納米棒表面組成相同，均為100%Ti元素（圖3）。

2.2 術后一般情況

材料植入新西蘭兔脛骨后，所有動物術后活動及進食正常，手術切口愈合良好，未出現(xiàn)傷口感染及炎癥、毒性反應。術后4、12周取材，材料植入?yún)^(qū)域未見組織壞死、化膿等情況，植入材料與骨界面之間結(jié)合良好，未見植入材料脫出、松動等現(xiàn)象。

2.3 Micro-CT斷層掃描

圖4顯示Ti和100 nm Ti材料植入術后4、12周Micro-CT橫斷圖像。植入動物體內(nèi)4周，Ti組材料與骨界面之間存在可見間隙（圖4A），12周骨-材料界面結(jié)合程度較術后4周明顯改善（圖4B）；100 nm Ti組植入4周材料與骨界面結(jié)合強度（圖5A）優(yōu)于Ti組，12周骨-材料界面結(jié)合緊密，未見間隙（圖5B）。

2.5 生物力學測試

表1為Ti和100 nm Ti材料植入新西蘭兔脛骨4、12周的生物力學測試結(jié)果。植入4周時，100 nm Ti組材料的破壞載荷明顯高于Ti組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示100 nm Ti表面更利于材料-骨界面的骨整合。植入12周，兩組材料的破壞載荷均較4周明顯增加（P＜0.05），但100 nm Ti組仍明顯高于Ti組（P＜0.05）。

圖2 100nm Ti表面場發(fā)射掃描電鏡圖片 圖3能量分散譜分析100 nm Ti表面元素

圖4 Ti材料植入體內(nèi)術后Micro CT斷層掃描 4A術后4周 4B術后12周 圖5 100 nm Ti材料植入體內(nèi)術后Micro CT斷層掃描 5A術后4周 5B術后12周

表1 Ti、100 nm Ti材料植入兔體內(nèi)4、12周材料-骨界面的破壞載荷（±s，N，n=5）

組別Ti 100 nm Ti t值P值4周29.7±1.9 48.8±2.6－13.286 0.000 12周71.3±4.1 108.9±6.4－11.026 0.000 t值－20.710－19.341 P值0.000 0.000 ----

3 討論

材料表面的拓撲結(jié)構(gòu)或理化特性與細胞黏附關系密切，骨組織中未成熟骨和成熟骨的平均無機顆粒分別為10～50 nm和20～50 nm（直徑2～5 nm）[5]，Ⅰ型膠原、細胞外基質(zhì)蛋白和骨碎屑等也在納米級大小[5-6]，因此可以推斷，納米級別的材料表面可能會更好地被骨細胞、組織所識別，起到促進細胞黏附、增殖和分化的作用，有望成為一種理想的植入材料。

3.1 Micro-CT觀察材料-骨的結(jié)合程度

材料植入動物體后其表面與骨面之間不可避免地存在一定間隙，這個間隙愈合的過程也就是材料-骨界面愈合的過程，只有骨組織與材料之間的界面發(fā)生直接而又牢固的接觸，才被視為成功的骨結(jié)合[7-9]。作為一種新型的分子影像學技術，Micro-CT適于觀測材料周圍骨組織的骨體積、骨小梁厚度、骨面積、骨連接密度、骨小梁分離度等[10]，Van Oossterwyck等[11]對種植體植入羊體內(nèi)的實驗結(jié)果表明，Micro-CT與組織學分析相似；但Butz等[12]卻認為，Micro-CT對骨組織相關參數(shù)的測量可能受鄰近種植體金屬偽影的影響。本研究在掃描過程中同樣發(fā)現(xiàn)鈦金屬有少量偽影，考慮到偽影對材料周圍骨體積、骨小梁厚度等指標準確性的影響，未對這些參數(shù)進行分析，而是選擇直接觀察橫斷面的材料-骨結(jié)合度。本研究發(fā)現(xiàn)，100 nm Ti材料植入后4周材料與骨界面結(jié)合較Ti好；12周后骨-材料界面結(jié)合緊密，未見縫隙。這與生物力學測試的結(jié)果是相互吻合的。

3.2 生物力學測試材料-骨界面的破壞載荷

與組織形態(tài)分析比較，生物力學測試能夠更直觀敏感地判斷植入材料的穩(wěn)定性，有效評估材料的力學性能[13-14]。對于葉狀或圓柱狀植入材料，通常采用拔除實驗或推出實驗[15]。本推出實驗研究結(jié)果表明，Ti和100 nm Ti材料植入兔體內(nèi)4、12周，100 nm Ti組破壞載荷均明顯高于Ti組，提示納米表面可能使骨長入微孔，形成微鎖[16]，促進材料-骨界面的骨整合，起到加速骨生長、提高骨融合率、加強骨-材料界面強度的作用。研究還顯示，植入12周后兩組材料的破壞載荷均較4周明顯提升，原因可能是由于植入材料4周時處于材料-骨界面愈合早期，炎癥、纖維結(jié)締組織等[17]導致骨-材料界面結(jié)合力不強；植入12周后材料-骨界面有新骨形成，破壞載荷較4周時大大提高。

傳統(tǒng)的拋光鈦表面缺乏生物活性，容易與骨界面形成纖維組織，導致假體松動。Xia等[18]對納米和微米結(jié)構(gòu)表面進行體內(nèi)外實驗研究，結(jié)果提示納米表面堿性磷酸酶活性更強；納米表面培養(yǎng)成骨細胞后Cbfal、骨鈣素骨保護素及Ⅰ型膠原表達明顯上升；納米鈦還可促進其表面細胞的生長；此外，由于和顆粒之間的結(jié)合點增多[19]，因此骨更易長入納米表面，材料-骨界面的骨整合更為緊密，骨-材料界面的強度進一步提高。動物實驗結(jié)果還表明，將鈦螺釘修飾納米表面植入鼠模型，骨融合較普通鈦螺釘更好，皮膚感染概率降低[20]；而經(jīng)過表面修飾（如二氧化鈦噴吵處理[21]）的納米表面植入體內(nèi)后骨融合程度更高，骨形成更多。生物安全性方面，Popat等[22]將納米管材料植入大鼠皮下4周后進行組織分析，結(jié)果證實納米管表面具有良好的生物相容性；本研究中無一例發(fā)生局部紅腫、滲出、切口感染，無毒性反應發(fā)生。

[1]Durmus NG,Webster TJ.Nanostructured titanium:the ideal materialforimproving orthopedic implantefficacy?[J]. Nanomedicine,2012,7(6):791-793.

[2]Dowson D.New joints for the Millennium:wear control in total replacement hip joints[J].Proc Inst Mech Eng,2001, 215(4):325-358.

[3] Kaplan FS,Hayes WC,Keaveny TM,et al.Form and function of bone[G]//Simon SP.Orthopedic Basic Science. Columbus:American Academy of Orthopaedic Surgery,1994: 127-184.

[4]Lin X,Zhong ML,Li M,Yin QS,et al.Effects of different lengths of Ti nanorods topography on mesenchymal stem cell growth and proliferation[J].J Nanosci Nanotech(已錄用 doi: 10.1166/jnn.2014.9275).

[5]Kaplan FS,Hayes WC,Keaveny TM,et al.Biomaterials[G]// Simon SP.Orthopedic Basic Science.Columbus:American Academy of Orthopedic Surgeons,1994:460-478.

[6]Ruppel ME,Miller LM,Burr DB.The effect of the microscopic and nanoscale structure on bone fragility [J]. Osteoporos Int,2008,19(9):1251-1265.

[7]Br?nemark PI.Osseointegration and its experimental background[J].J Prosthet Dent,1983,50(3):399-410.

[8]Osborn JF,Newesely H.Dynamic aspects of implant-bone interface: dental implants: materials and systems [M]. Munich:Verlag,1980,111-123.

[9] Franchi M,Orsini E,Trire A,et al.Osteogenesis and morphology of the peri-implant bone facing dental implants [J].Sci World J,2004.4:1083-1095.

[10]Rebaudi A,KollerB,Laib A,etal.Microcomputed tomographic analysis of the peri-implant bone[J].Int J Periodontics Restorative Dent,2004,24(4):316-325.

[11]Van Oossterwyck H,Duyck J,Vander Sloten J,et al.Use of microfocus computerized tomography as a new technique for characterizing bone tissue around oral implants[J].J Oral Implantol,2000,26(1):5-12.

[12]Butz F,Ogawa T,Chang TL,et al.Three-dimensional bone-implantintegration profiling using micro-computed tomography[J].Int J Oral Maxillofac Implants,2006,21(5): 687-695.

[13]Rüger M,Gensior TJ,Herren C,et al.The removal of Al2O3 particles from grit-blasted titanium implant surfaces:effects on biocompatibility,osseointegration and interface strength in vivo[J].Acta Biomater,2010,6(7):2852-2861.

[14]Castellani C,Lindtner RA,Hausbrandt P,et al.Bone-implant interface strength and osseointegration:biodegradable magnesium alloy versus standard titanium control[J]. Acta Biomater,2011,7(1):432-440.

[15]Beer A,Gahleitner A,Holm A,et al.Correlation of insertion torques with bone mineral density from dental quantitative CT in the mandible[J].Clin Oral Implants Res,2003,14(5): 616-620.

[16]Otsuki B,Takemoto M,Fujibayashi S,et al.Pore throat size and connectivity determine bone and tissue ingrowth into porous implants:three-dimensional micro-CT based structural analyses of porous bioactive titanium implants [J]. Biomaterials,2006,27(35):5892-5900.

[17]Natali AN,Carniel EL,Pavan PG.Investigation of viscoelastoplastic response ofbone tissue in oral implants press fit process[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2009, 91(2):868-875.

[18]Xia L,Feng B,Wang P,et al.In vitro and in vivo studies of surface-structured implants for bone formation [J].Int J Nanomedicine,2012,7:4873-4881.

[19]Webster TJ,Ejiofor JU.Increased osteoblast adhesion on nanophase metals:Ti,Ti6Al4,and CoCrMo[J].Biomaterials, 2004,25(19):4731-4739.

[20]Puckett SD,Lee PP,Ciombor DM,et al.Nanotextured titanium surfacges for enhancing skin growth on transcutaneous osseointegrated devices[J].Acta Biomater,2010,6(6):2352-2362.

[21]Bjursten LM,Rasmusson L,Oh S,et al.Titanium dioxide nanotubes enhance bone bonding in vivo[J].J Biomed Mater Res A,2010,92(3):1218-1224.

[22]Popat KC,Leoni L,Grimes CA,et al.Influence of engineered titania nanotubularsurfaceson bone cells[J]. Biomaterials,2007,28(21):3188-3197.

Preliminary experimental study on osteogenesis biological effects of the Ti nanorod in rabbit models

LIN Xi,RUAN Zheng,HE Peng,YAO Zilong,ZHANG Yu,YIN Qingshui.Hospital of Orthopaedics, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command,Guangzhou,Guangdong 510010,China

YIN Qingshui,E-mail:gz_yqs@126.com

ObjectiveTo analyze the osseointegration at Ti nanorod material-bone interface,and to explore osteogenesis biological effect of nanostructure Ti rod.Methods Field emission scanning electron microscopy (FESEM)was employed to observe the morphology of Ti nanorod surface,energy dispersive spectroscopy(EDS) was applied to analyze the elements of the materials.Ti rod and Ti nanorod samples were randomly implanted into either side of tibia of New Zealand white rabbits.After 4,12 weeks,Micro-CT and push-out test were applied to compare the differences of osseointegration at the material-tibia interface as well as damage load between 2 materials.Results FESEM showed 100 nm Ti surface were acquired and EDS showed nanorod were composed of Ti element only.No tissue necrosis or wound infection were observed and no loosening or pull-outof implants had happened.Four weeks and 12 weeks after implanting,Micro-CT showed osseointegration density in 100 nm Ti group was better than that in Ti group;damage load in 100 nm Ti group was also higher than the result in Ti group,there was statistical difference between two groups(P＜0.05).Conclusion 100 nm Ti could improve the osseointegration density at the bone-material interface,and subsequently enhance bone healing rate in rabbit models.

Nanostructures;Titanium;Bone healing;Biomechanics;Rabbits

R356.1，R318.1

A

1674-666X（2014）02-0105-06

2014-01-05；

2014-02-01）

（本文編輯：白朝暉）

10.3969/j.issn.1674-666X.2014.02.008

國家重點基礎研究發(fā)展計劃（973計劃）課題子項目（2012CB619106）

510010廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院骨科醫(yī)院

尹慶水，E-mail：gz_yqs@126.com