劉新亮，潘仲樂，龐鈞予，邢 丹，趙舒婷

（黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局，哈爾濱 150001）

沙門氏菌是重要的腸道致病菌，在分類學(xué)上屬于腸桿菌科沙門氏菌屬，根據(jù)抗原成分的不同分成2 000多個(gè)血清型，目前我國已發(fā)現(xiàn)的血清型有216個(gè)[1]。沙門氏菌屬于人畜共患病原菌，極易污染食品、水產(chǎn)品和水源，是引起食物中毒的常見致病菌，也是引起腹瀉的重要病原菌之一[2]。目前沙門氏菌的檢測方法主要有國標(biāo)法、免疫磁珠法、乳膠凝集試驗(yàn)法、基因探針法和PCR法等[3]。國標(biāo)法要經(jīng)過增菌、分離培養(yǎng)、生化實(shí)驗(yàn)、血清學(xué)實(shí)驗(yàn)等，過程繁瑣，操作復(fù)雜、耗時(shí)長；免疫磁珠法和乳膠凝集試驗(yàn)法可對大量樣品進(jìn)行篩選，但較易出現(xiàn)假陽性；基因探針法和PCR法投入較大，且不能區(qū)分死活細(xì)胞，假陽性的發(fā)生率很高。因此，傳統(tǒng)方法在一定程度上很難滿足對食品中沙門氏菌進(jìn)行快速、準(zhǔn)確檢測的需要。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，出現(xiàn)了許多經(jīng)過國際權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)可，有較高靈敏度和特異性的檢測儀器和試劑。本文采用全自動熒光酶免疫分析儀（miniVIDAS）、全自動微生物鑒定儀（VITEK 2 Compact）和沙門氏菌顯色培養(yǎng)基對食品和水產(chǎn)品中的沙門氏菌進(jìn)行檢測，并與傳統(tǒng)方法進(jìn)行比較，探索出快速檢驗(yàn)方法在食品檢驗(yàn)中應(yīng)用的可行之路[4-5]。

1 材料與方法

1.1 檢測樣品來源

樣本為黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局同食品藥品監(jiān)督管理局共同無菌采集的豆制品、水產(chǎn)品200份以及黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局工商管理局共同無菌采集的糕點(diǎn)、辣椒醬、飲料、巧克力、葡萄酒、餅干和速凍食品195份，共計(jì)395份，每份樣本均采用無菌包裝，質(zhì)量＞250 g，及時(shí)送實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。

1.2 儀器和試劑

全自動熒光酶免疫分析儀（miniVIDAS）、全自動微生物鑒定儀（VITEK 2 Compact）、電子比濁計(jì)、SX2肉湯、VIDASSLM沙門氏菌試劑條、VITEKGN測試卡、無菌鹽水（0.45%NaCl）由法國生物梅里埃（Biomerieux）公司生產(chǎn)[6-7]?？岂R嘉沙門氏菌顯色培養(yǎng)基購自鄭州博賽生物技術(shù)有限公司。緩沖蛋白胨水、TTB增菌液、SC增菌液、BS瓊脂、XLD瓊脂、HE瓊脂、三糖鐵瓊脂、尿素酶瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、賴氨酸脫羧酶試劑、賴氨酸脫羧酶對照試劑、氰化鉀培養(yǎng)基、靛基質(zhì)、甘露醇、山梨醇、ONPG、衛(wèi)矛醇、水楊苷、丙二酸鹽購自北京陸橋技術(shù)有限公司。沙門氏菌診斷血清（56種）購自成都生物制品廠。試驗(yàn)用參考菌株見表1。

表1 試驗(yàn)用參考菌株

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 檢測儀器與顯色培養(yǎng)基聯(lián)用法

按照mini VIDAS操作手冊，取樣品25 g加入緩沖蛋白胨水中進(jìn)行前增菌，36℃培養(yǎng)8～18 h后取0.1mL加入10mL SX2肉湯中，于41.5℃培養(yǎng)22～26 h進(jìn)行選擇性增菌，以無菌操作取SX2肉湯1mL，100℃水浴15min。取0.5mL滅活的SX2肉湯加入VIDASSLM試劑條的樣品孔中，根據(jù)VIDAS操作規(guī)程檢驗(yàn)，得出結(jié)果。取VIDAS檢驗(yàn)結(jié)果陽性者，選取相應(yīng)未經(jīng)加熱的SX2肉湯接種沙門氏菌顯色培養(yǎng)基，于36℃培養(yǎng)24 h。再挑取可疑菌落，按要求配置成濁度在0.5～0.62菌懸液，選擇GN鑒定卡，設(shè)定好相應(yīng)信息，放入VITEK 2 Compact儀器中，進(jìn)行填充、封口、掃描等程序后進(jìn)入孵育箱，培養(yǎng)4～7 h后自動進(jìn)行判讀[8]。

1.3.2 國標(biāo)法

按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4－2010進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測儀器與顯色培養(yǎng)基聯(lián)用法檢測結(jié)果的可靠性驗(yàn)證

將標(biāo)準(zhǔn)菌株接種于25mL營養(yǎng)肉湯中，36℃培養(yǎng)24 h活化，制成濃度約1～2×108cfu·mL-1的菌懸液，然后將其接種至225mL緩沖蛋白胨水中，打亂順序，標(biāo)注編號，分別按照聯(lián)用法和國標(biāo)法進(jìn)行分離鑒定[9]。聯(lián)用法與國標(biāo)法結(jié)果對比見表2。

從表2可以看出，聯(lián)用法對不同標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行檢測，可以準(zhǔn)確地分離鑒定出其中的沙門氏菌菌株，對非沙門氏菌采用全自動熒光酶免疫分析儀（miniVIDAS）進(jìn)行初篩，即可篩除。同時(shí)為驗(yàn)證本方法的可靠性，采用國標(biāo)法對同編號樣本進(jìn)行分離鑒定，然后將所有樣本用API20E、APISTAPH 25進(jìn)行鑒定，所得結(jié)果與聯(lián)用法完全一致。

2.2 檢測儀器與顯色培養(yǎng)基聯(lián)用法與國標(biāo)法同時(shí)檢測食品和水產(chǎn)品中沙門氏菌的結(jié)果比較

分別采用檢測儀器與顯色培養(yǎng)基聯(lián)用法和國標(biāo)法對糕點(diǎn)、辣椒醬、飲料、巧克力、葡萄酒、餅干、速凍食品、豆制品和水產(chǎn)品進(jìn)行檢測，聯(lián)用法與國標(biāo)法結(jié)果對比見表3。

從表3可以看出，采用聯(lián)用法對395份食品和水產(chǎn)品樣本中沙門氏菌進(jìn)行檢測，其中通過mini VIDAS篩選出陽性菌52株，采用沙門氏菌顯色培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩后，剩余20株，用VITEK 2Compact進(jìn)行鑒定后，證實(shí)其中18株為沙門氏菌，其余2株為弗氏檸檬酸桿菌和惡臭假單胞菌。而采用國標(biāo)法檢出陽性菌株18株，兩種方法的最終結(jié)果完全一致。

采用miniVIDAS對395份食品和水產(chǎn)品樣本進(jìn)行檢測，出現(xiàn)32例假陽性結(jié)果，采用顯色培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩和用VITEK 2 Compact進(jìn)行鑒定后排除，所有樣本沒有出現(xiàn)假陰性結(jié)果。由此證明，單獨(dú)采用VIDAS存在出現(xiàn)假陽性結(jié)果的可能，而結(jié)合顯色培養(yǎng)基后可減少出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，再用VITEK鑒定后既可不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，從而避免錯檢、漏檢的情況。且通過試驗(yàn)確定顯色培養(yǎng)基對VITEK 2 Compact的結(jié)果不存在影響[10]。林濤等研究只提到了用于水產(chǎn)品中國沙門氏菌的檢測，并沒有將此方法應(yīng)用到食品中[11]。本試驗(yàn)在對大量食品基材進(jìn)行對比后，得出與國標(biāo)法相同的檢測結(jié)果。故儀器聯(lián)用顯色培養(yǎng)基的方法可以同時(shí)應(yīng)用到食品和水產(chǎn)品這兩大類。

表2 聯(lián)用法與國標(biāo)法結(jié)果對比

表3 聯(lián)用法與國標(biāo)法結(jié)果對比

2.3 檢測儀器與顯色培養(yǎng)基聯(lián)用法的問題

本試驗(yàn)所采用方法的培養(yǎng)時(shí)間，緩沖蛋白胨水前增菌時(shí)間為8～18 h，SX2肉湯的選擇性增菌時(shí)間為22～26 h。方法允許的最快培養(yǎng)時(shí)間為30 h，但為防止漏檢，應(yīng)適當(dāng)延長增菌時(shí)間。在使用顯色培養(yǎng)基時(shí)，許多傷寒沙門氏菌可能在培養(yǎng)24～48 h才會出現(xiàn)紫色菌落。用VITEK鑒定沙門氏菌絕大部分只能鑒定到沙門氏菌屬，還需增加血清學(xué)實(shí)驗(yàn)才能進(jìn)一步分型[12]。只有雞沙門菌血清型、甲型副傷寒沙門菌血清型、傷寒沙門菌才能鑒定到種。林秋云等應(yīng)用全自動微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行病原菌鑒定時(shí)間平均為4～6 h，比傳統(tǒng)方法鑒定時(shí)間縮短，并能自動打印鑒定結(jié)果報(bào)告，兩種方法的鑒定符合率為100%，準(zhǔn)確性、可靠性和自動化程度優(yōu)于傳統(tǒng)鑒定方法[13]。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，與國標(biāo)法相比，聯(lián)用法具有明顯的時(shí)間優(yōu)勢，對于陰性樣品，miniVIDAS可在30～44 h出具檢測結(jié)果，而國標(biāo)法至少需要4 d；對于陽性樣品，經(jīng)mini VIDAS初篩后，再通過沙門氏顯色培養(yǎng)基的復(fù)篩以及VITEK的鑒定，也可在約30 h出具檢測結(jié)果，而國標(biāo)法至少需要9 d。通過聯(lián)用法，最快可在60 h出具檢測結(jié)果。

聯(lián)用檢測儀器與顯色培養(yǎng)基檢測食品和水產(chǎn)品中的沙門氏菌，可以充分發(fā)揮兩種檢測手段的優(yōu)越性：VIDAS具有靈敏度高，速度快，檢測能力強(qiáng)，一般上機(jī)幾十分鐘即可得到初篩結(jié)果，可以作為大批量樣品的篩查，有效地節(jié)約檢驗(yàn)時(shí)間，減少工作量。由于單獨(dú)采用VIDAS存在出現(xiàn)大量假陽性結(jié)果的可能，所以配合顯色培養(yǎng)基使用后就可大幅減少假陽性結(jié)果，再配以VITEK進(jìn)行鑒定，就能在保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提下，大幅節(jié)省檢測時(shí)間[14]。

[1]王秀茹.預(yù)防醫(yī)學(xué)微生物學(xué)及檢驗(yàn)技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1996.

[2]潘雪霞,朱敏,梅玲玲,等.食品中沙門菌污染狀況及耐藥性研究[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16（9）:1 103-1 104.

[3]張潔梅.食品微生物檢驗(yàn)技術(shù)的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代食品科技,2005,21（2）:221-222.

[4]寇運(yùn)同,張明玉,韓青,等.熒光酶標(biāo)分析系統(tǒng)快速檢測食品中的沙門氏菌[J].中國動物檢疫,2000,17（9）:39-40.

[5]王瑤,徐英春,謝秀麗,等.全自動微生物鑒定藥敏分析儀對臨床相關(guān)細(xì)菌藥敏測定能力的評估[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2007,30（9）:1 052-1 055.

[6]陶鳳蓉,宣天芝,張秀珍.全自動熒光酶免疫分析儀檢測沙眼衣原體臨床應(yīng)用評價(jià)[J].中華醫(yī)學(xué)感染學(xué)雜志,2005,15（7）:835-836.

[7]楊毓環(huán),陳偉偉.VITEK全自動微生物檢測系統(tǒng)原理及其應(yīng)用[J].海峽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志,2000,6（3）:38-39.

[8]劉俊華,黃愈玲,李秀珍.全自動細(xì)菌分析儀系統(tǒng)在檢測引起食物中毒病原菌的應(yīng)用[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2002,12（5）:554-555.

[9]ZimbroM J,Power DAD,Manual BB L.Manualofmicrobiological culturemedia[M].Mary land:Becton,Dickson and Company,2003.

[10]李皇,張耀平,梁林慧.洋蔥伯克霍爾德菌在幾種腸道選擇性培養(yǎng)基上的生長比較及對VITEK鑒定的影響[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2009（1）:98-100.

[11]林濤,蘭敏,黃偉,等.熒光酶免疫分析儀-微生物鑒定儀在水產(chǎn)品沙門氏菌檢測中的應(yīng)用[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2008,34（8）:133-136.

[12]梁景濤,陳淑玲,余淑冰.微生物鑒定系統(tǒng)在食物中毒病原菌檢測中的應(yīng)用[J].華南預(yù)防醫(yī)學(xué),2004,30（8）:32-33.

[13]林秋云,尹映華.全自動微生物分析系統(tǒng)在微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用[J].中國熱帶醫(yī)學(xué),2006,6（8）:1 477-1 1 478,1 520.

[14]黎昊雁,王瑋,施偉良,等.使用VITEK檢測化妝品中的綠膿桿菌[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,15（1）:100-101.