陳紅梅，趙雪冰，劉德華

(清華大學(xué) 化工系 應(yīng)用化學(xué)研究所，北京 100084)

木質(zhì)纖維素是一種產(chǎn)量豐富、來源廣泛、廉價 的可再生資源。近些年來，由于化石資源短缺和溫室氣體排放量大幅增加，木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化生產(chǎn)燃料和化學(xué)品受到世界各國的廣泛關(guān)注［1］。但由于木質(zhì)纖維素本身結(jié)構(gòu)復(fù)雜，特別是半纖維素和木質(zhì)素限制了纖維素的酶催化水解性能。因此，木質(zhì)纖維素原料往往需要經(jīng)過預(yù)處理以破壞其抗生物降解屏障從而提高纖維素酶對纖維素的可及性［2］。木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化的預(yù)處理方法有多種，常用的包括稀酸預(yù)處理、蒸汽爆破(或超臨界CO2爆破)、熱水預(yù)處理、氨纖維素爆破、氨水循環(huán)滲透和石灰預(yù)處理等［3-4］。有機溶劑預(yù)處理是采用有機溶劑或其水溶液在添加或不添加催化劑的條件下對木質(zhì)纖維素原料進行預(yù)處理的方法。在有機溶劑預(yù)處理過程中，由于木質(zhì)素和半纖維素的脫除，原料孔隙率增加，從而提高了纖維素與纖維素酶的可接觸面積［5］。有機溶劑預(yù)處理一方面可以有效提高纖維素的酶解性能，另一方面在預(yù)處理過程中可水解半纖維素、溶解木質(zhì)素，因而是一種分級預(yù)處理，有利于實現(xiàn)原料的分級加工利用［1］。

乙醇預(yù)處理是目前研究較多的有機溶劑預(yù)處理方法［6-8］。乙醇具有低毒、揮發(fā)性大、易回收利用的特點。目前，將乙醇作為溶劑處理木質(zhì)纖維素原料研究較多的是自催化乙醇處理法和酸催化乙醇處理法［9-12］。自催化乙醇處理法通常是指除乙醇外，不添加任何化學(xué)藥品作催化劑，而依賴于預(yù)處理過程中釋放的有機酸(主要是乙酸)來提供所需酸度的乙醇處理法，反應(yīng)溫度通常為180～210℃。酸催化乙醇處理法是向體系中添加外源有機酸或無機酸作為催化劑，從而促進脫木素作用和半纖維素水解，加入酸性催化劑可降低反應(yīng)溫度和壓力［12］。

為分析和比較乙醇預(yù)處理后麥稈的纖維素酶解特性，筆者分別在最優(yōu)條件下對麥稈進行H2SO4催化和自催化乙醇處理，比較這2種乙醇法處理后麥稈的主要化學(xué)組成、纖維素酶解性能和半同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇特性，并進一步獲得物料衡算數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要原料和試劑

實驗所用的小麥秸稈產(chǎn)自山東省，風(fēng)干后待用。將其破碎成＜2 cm的片段。采用美國國家可再生能源實驗室的方法測定［13］其主要化學(xué)組成:葡聚糖33.1%，木聚糖22.8%，酸溶木素2.21%，酸不溶木素 22.1%。乙醇、H2SO4、CaCO3、醋酸鈉、吐溫等試劑均為市售分析純。高效液相色譜(HPLC)用標(biāo)準(zhǔn)品，包括葡萄糖、木糖、纖維二糖、阿拉伯糖、糠醛、甲酸、乙酸、乙醇等購自Sigma-Aldrich上海分公司。纖維素酶為諾維信公司生產(chǎn)的Cellic? CTec2。

1.2 主要儀器和設(shè)備

預(yù)處理反應(yīng)器為天舟海泰(北京)科技有限公司的TFCF5-5型5 L不銹鋼高壓反應(yīng)釜。液相色譜儀為日本島津公司的HPLC系統(tǒng)，色譜柱為Bio-Rad公司的Aminex HPX-87H(300 mm× 7.8mm)填充柱，檢測器為島津公司RID-10A差示折光檢測器。流動相為5 mmol/L稀H2SO4，流速為0.8 mL/min，柱溫為65℃。紫外分光光度計為上海天美科學(xué)儀器有限公司的UI-VIS 85系列紫外/可見分光光度計。

1.3 實驗方法

1.3.1 自催化乙醇處理

自催化乙醇是在筆者所在實驗室之前優(yōu)化后的條件下進行的。150 g麥稈置于高壓反應(yīng)釜中，加入1 500 mL體積分數(shù)65%的乙醇水溶液，在300 r/min下進行預(yù)處理。預(yù)處理溫度為220℃，保溫20 min。反應(yīng)結(jié)束后冷卻到40℃以下，離心，收集液體，固體用相同濃度的乙醇溶液以10∶1(mL/g)液固比洗滌，再離心，收集液體，將固體進行減壓蒸發(fā)，回收乙醇。所得固體保存在自封袋中，放入4℃冰箱保存待用。

1.3.2 酸催化乙醇處理

H2SO4催化的乙醇預(yù)處理過程與自催化過程類似，不同的是乙醇質(zhì)量分數(shù)60%，且在預(yù)處理過程中添加30 mmol/L H2SO4作為催化劑，并在190℃下保溫1 h［5］。其他過程與自催化乙醇預(yù)處理相同。

1.3.3 酶解實驗

預(yù)處理后固體的酶解在50 mL三角瓶、pH 4.8的醋酸緩沖溶液、50℃和150 r/min條件下進行。固體含量為10%或15%(10%和15%分別指100 mL液體中所含絕干固體質(zhì)量為10 g和15 g)。纖維素酶用量為20 FPU(按1 g固體計)。間歇取樣，測定液相中纖維二糖、葡萄糖和木糖的濃度。預(yù)處理后的纖維素酶解性能以液相中單糖濃度以及酶解聚糖轉(zhuǎn)化率來描述。

酶解葡聚糖轉(zhuǎn)化率的定義為酶解過程中轉(zhuǎn)化為葡萄糖和纖維二糖的聚糖百分率:

式中:ρg、ρc分別為葡萄糖、纖維二糖質(zhì)量濃度，g/L;xg表示預(yù)處理后試樣中葡聚糖含量;1.1是葡聚糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖的轉(zhuǎn)化系數(shù);ρl，s為初始固體質(zhì)量濃度，g/L。

1.3.4 半同步糖化發(fā)酵實驗

預(yù)處理后固體的半同步糖化發(fā)酵(hSSF)在50 mL三角瓶中進行。將預(yù)處理后的纖維素固體(固體含量為10%)置于發(fā)酵培養(yǎng)基中，121℃下滅菌20 min，再用濃度為1 mol/L的NaOH溶液將液相pH調(diào)至5.0～5.5，加入纖維素酶液(1 g固體纖維素酶用量為20 FPU)，進行預(yù)水解24 h(水解條件為50℃、130 r/min)，隨后按10%的接種量接入釀酒酵母(Saccharomices cerevisiae CICC 31014)種子液，進行乙醇發(fā)酵。發(fā)酵溫度為37℃，搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)處理后固體主要化學(xué)組成

H2SO4催化和自催化乙醇處理后的麥稈的主要化學(xué)組成如表1所示。

表1 H2SO4催化和自催化乙醇預(yù)處理固體主要化學(xué)組成比較Table 1 Main chemical compositions of wheat straw pretreated by sulfuric acid-catalyzed(SAC)and auto-catalyzed(AC)ethanol organosolv processes%

由表1可知:自催化乙醇處理的固體回收率為50.5%，而酸催化乙醇法處理的固體回收率相對較低，為42.1%。與自催化乙醇處理相比，酸催化處理的試樣葡聚糖含量更高，而木聚糖和木素含量都更低，特別是木聚糖含量顯著減少，木聚糖水解率超過90%。自催化乙醇預(yù)處理過程中木聚糖水解率僅為61.2%。這是因為H2SO4催化乙醇預(yù)處理過程中，添加外源無機酸促進了半纖維素水解。從木素含量來看，H2SO4催化的乙醇預(yù)處理后，總木素含量下降至10.5%，相應(yīng)的木素脫除率為81.8%;自催化乙醇預(yù)處理后總木素含量為13.5%，相應(yīng)的木素脫除率為71.9%。添加無機酸有利于木素的脫除，這是由于酸濃度較高的情況下更容易使半纖維素和木素之間以及木素分子內(nèi)的連接鍵斷裂，形成更多的木素碎片［10-11，14-15］。

2.2 纖維素的酶解性能

H2SO4催化和自催化乙醇預(yù)處理麥稈在10%和15%固體含量及添加不同濃度表面活性劑條件下的酶解時間曲線如圖1和圖2所示。由圖1和圖2可以看出，24 h之后葡聚糖酶解轉(zhuǎn)化率無明顯增加。H2SO4催化乙醇處理麥稈在2種固體含量下葡聚糖的最終轉(zhuǎn)化率均為70%左右，而葡萄糖質(zhì)量濃度分別為55和78 g/L。對自催化乙醇預(yù)處理的麥稈葡聚糖轉(zhuǎn)化率最高可達80%，相應(yīng)葡萄糖質(zhì)量濃度分別為 50.2 和 79.2 g/L。

圖1 H2SO4催化乙醇預(yù)處理麥稈的酶解Fig.1 Enzymatic hydrolysis of wheat straw pretreated by sulfuric acid-catalyzed(SAC)ethanol organosolv process

添加表面活性劑吐溫20和吐溫80對于2種預(yù)處理后固體的酶解性能具有不同的影響。對于H2SO4催化乙醇預(yù)處理的固體，添加表面活性劑不但未能促進纖維素的酶解，反而一定程度上抑制了酶解過程。特別是在10%固體含量的條件下，這種抑制作用更為明顯。而對于自催化乙醇預(yù)處理，吐溫20和吐溫80對于纖維素的酶解具有明顯的促進作用。例如，當(dāng)添加0.5 g/L吐溫20時，在10%和15%固體含量下，酶解24 h時，葡聚糖轉(zhuǎn)化率可分別由未添加時的74.3%提高至81.0%及62.2%提高至75.0%。表面活性劑對于H2SO4催化和自催化乙醇預(yù)處理后的固體酶解性能具有不同影響作用的現(xiàn)象可能與H2SO4催化和自催化預(yù)處理后固體的木素含量及結(jié)構(gòu)有關(guān)。已有的研究表明，表面活性劑提高預(yù)處理后纖維素酶解性能主要是通過降低木素對纖維素酶的無效吸附來實現(xiàn)的［12-13，16-17］。底物中木素表面有一定數(shù)量的位點，既可與表面活性劑結(jié)合，又可與纖維素酶結(jié)合。當(dāng)表面活性劑用量達到一定程度時，這些位點全部吸附表面活性劑，從而阻止木素對纖維素酶的無效吸附，使纖維素酶水解速度和得率提高。進一步提高表面活性劑用量反而抑制酶活，降低酶解性能［14，18］。H2SO4催化乙醇處理過后的固體中木素含量較低，能與表面活性劑結(jié)合的位點數(shù)量有限，因此即使添加少量的表面活性劑(例如0.5 g/L)，亦能使木素的結(jié)合位點飽和，且表現(xiàn)出對酶催化過程的抑制作用。特別是，當(dāng)固體含量較低時，未與木素結(jié)合的表面活性劑更多，對酶活的抑制作用更強烈，導(dǎo)致葡聚糖轉(zhuǎn)化率明顯降低。同種表面活性劑中，高濃度的表面活性劑比低濃度條件下的葡聚糖轉(zhuǎn)化率稍低也驗證了這一點。而自催化預(yù)處理后固體的木素含量較高，因此，表面活性劑對酶解表現(xiàn)為促進作用。此外，表面活性劑的作用還可能與木素結(jié)構(gòu)有關(guān)。H2SO4催化預(yù)處理過程中由于酸濃度較高，更容易發(fā)生木素的縮聚反應(yīng)，因而會降低木素分子中酚羥基的含量。而文獻報道，酚羥基是木素?zé)o效吸附纖維素酶的一個主要官能團［15，19］。因此，木素官能團結(jié)構(gòu)的變化可能是表面活性劑對H2SO4催化和自催化預(yù)處理后固體具有不同影響的主要原因之一。具體的機制還需進一步研究。

圖2 自催化乙醇處理麥稈的酶解Fig.2 Enzymatic hydrolysis of wheat straw pretreated by auto-catalyzed(AC)ethanol organosolv process

H2SO4催化和自催化乙醇預(yù)處理麥稈亦有文獻報道。Wildschut等［5］在相同條件下對麥稈進行H2SO4催化乙醇預(yù)處理，酶解聚糖轉(zhuǎn)化率可達89.4%，但其酶解實驗的固體含量為3%，最終葡萄糖與纖維二糖總質(zhì)量濃度為22.1 g/L。而本文中，預(yù)處理后酶解葡萄糖最高質(zhì)量濃度可達80.3 g/L(15%固體含量，未添加表面活性劑)。對于自催化乙醇預(yù)處理，Huijgen等［14］在60%乙醇、200 ℃、保溫60 min、固液比1∶10(g/mL)的條件下對麥稈進行預(yù)處理，所得纖維素固體的酶解葡聚糖(酶解固體含量為3%，其余條件和本文的相同)轉(zhuǎn)化率僅為52%左右。而本文中，麥稈通過自催化乙醇預(yù)處理后，最高葡聚糖轉(zhuǎn)化率高于80%(10%、15%固體含量)。可見，筆者所采用的自催化乙醇預(yù)處理可以有效提高麥稈纖維素的酶解性能。

2.3 半同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇

H2SO4催化乙醇處理麥稈半同步糖化發(fā)酵(hSSF)過程中乙醇濃度和葡萄糖濃度的變化如圖3所示。從圖3中可以看出，表面活性劑的添加對最終乙醇濃度并無顯著影響。在預(yù)水解過程中(前24 h)，葡萄糖濃度迅速增加，接種培養(yǎng)8 h后葡萄糖很快被消耗，相應(yīng)的乙醇濃度迅速增加。接種培養(yǎng)12 h后乙醇濃度達到最大，此后乙醇濃度開始下降。這種現(xiàn)象可能是因為葡萄糖的產(chǎn)生速率不及其消耗速率，酵母菌在饑餓狀態(tài)下開始反耗產(chǎn)生的乙醇，也可能是由于隨著發(fā)酵過程進行，乙醇逐步揮發(fā)造成的。從圖3中可知，發(fā)酵過程中乙醇質(zhì)量濃度最高達到25 g/L左右，相當(dāng)于62.2%的理論得率。

圖3 H2SO4催化乙醇預(yù)處理麥稈半同步糖化發(fā)酵過程中乙醇和葡萄糖質(zhì)量濃度的變化Fig.3 Ethanol and glucose concentration changes during hSSF of wheat straw pretreated by sulfuric acidcatalyzed(SAC)ethanol organosolv process

自催化乙醇處理麥稈hSSF過程中乙醇濃度和葡萄糖濃度的變化如圖4所示。從圖4中可以看出，表面活性劑的添加對乙醇的產(chǎn)生有較好的促進作用，不僅提高了最終乙醇濃度，而且減小了酵母菌對乙醇的反耗。在接種培養(yǎng)8 h之內(nèi)，表面活性劑對乙醇產(chǎn)生的作用不明顯，因為預(yù)水解過程產(chǎn)生了大量葡萄糖，使得該時間段內(nèi)葡萄糖濃度較高，足夠供酵母消耗產(chǎn)生乙醇。接種培養(yǎng)8 h后，乙醇濃度增長速度緩慢，接種培養(yǎng)24 h后乙醇濃度達到最大。未添加表面活性劑的對照組乙醇質(zhì)量濃度最高為 20.1 g/L(接種培養(yǎng) 24 h后)，相當(dāng)于57.2%的理論得率;而添加表面活性劑的實驗組乙醇質(zhì)量濃度最高可達22.4 g/L(添加5 g/L吐溫80，培養(yǎng)24 h)，相當(dāng)于65.4%的理論得率，比對照組提高了11.4%。與H2SO4催化的預(yù)處理相比，自催化預(yù)處理可獲得類似的乙醇濃度和得率。

2.4 物料衡算

圖4 自催化乙醇預(yù)處理麥稈半同步糖化發(fā)酵過程中乙醇和葡萄糖質(zhì)量濃度的變化Fig.4 Ethanol and glucose concentration changes during hSSF of wheat straw pretreated by autocatalyzed(AC)ethanol organosolv process

進一步分析H2SO4催化和自催化乙醇處理麥稈的物料衡算，結(jié)果如圖5、圖6所示。從圖5和圖6可知:大部分葡聚糖以固體形式回收，并在后續(xù)酶解過程中轉(zhuǎn)化為葡萄糖。H2SO4催化乙醇處理葡聚糖回收率為91.0%，自催化乙醇處理葡聚糖回收率為95.4%。H2SO4催化的預(yù)處理過程中，90.3%的木聚糖被水解，81.8%的木素被脫除;而自催化預(yù)處理過程中，木聚糖水解率為61.2%，木素脫除率為71.9%。從液相中的糖濃度來看，2種預(yù)處理過程中木糖濃度均很低，這可能是由于預(yù)處理在較為劇烈的條件下進行，木糖發(fā)生了顯著降解。從圖5和圖6還可知:100 g麥稈原料通過酸催化乙醇預(yù)處理，最終能得到10.4 g乙醇，乙醇得率為理論得率的56%;而通過自催化乙醇預(yù)處理，最終能得到11.6 g乙醇，乙醇得率為理論得率的62.5%。由此可見，二者具有類似的乙醇得率。但H2SO4催化過程添加了外源無機酸，會一定程度上增加設(shè)備腐蝕性，且H2SO4需要中和處理。而自催化預(yù)處理需要更高的溫度，因而要求設(shè)備具有更高的耐壓性。因此，需要進一步結(jié)合后續(xù)產(chǎn)品分離以及設(shè)備投資等分析，來比較二者的經(jīng)濟性。

3 結(jié)論

通過比較H2SO4催化、自催化乙醇處理后麥稈固體的主要化學(xué)組成、酶解性能、半同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇特性和物料衡算結(jié)果，可以得到以下結(jié)論:①乙醇預(yù)處理能夠以固體形式回收大部分葡聚糖，H2SO4催化處理的葡聚糖回收率為91.0%左右，自催化乙醇處理的葡聚糖回收率為 95.4%。②H2SO4催化乙醇預(yù)處理可更多地水解半纖維素和脫除木素。③添加非離子表面活性劑吐溫20和吐溫80，對于H2SO4催化乙醇處理后麥稈的酶解和半同步糖化發(fā)酵生產(chǎn)乙醇無明顯促進作用。而對于自催化乙醇處理后的麥稈的酶解和半同步糖化發(fā)酵具有顯著的促進作用，最高酶解葡聚糖轉(zhuǎn)化率可從72.7%提高到85.0%;最高乙醇濃度比未添加表面活性劑時提高了11.4%。④物料衡算結(jié)果表明，H2SO4催化的乙醇預(yù)處理和自催化乙醇預(yù)處理的麥稈半同步糖化發(fā)酵的乙醇得率分別為10.4和11.6 g(按100 g原料計)。

圖5 H2SO4催化乙醇處理麥稈過程中的物料衡算Fig.5 Mass balance analysis of sulfuric acid-catalyzed(SAC)ethanol organosolv processe

圖6 自催化乙醇預(yù)處理處理麥稈過程中的物料衡算Fig.6 Mass balance analysis of auto-catalyzed(AC)ethanol organosolv processe

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