鐘耀華，錢遠(yuǎn)超，任美斌，汪天虹

(山東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 微生物技術(shù)國家重點實驗室，濟(jì)南 250100)

纖維素是植物在光合作用過程中利用太陽能和CO2形成的產(chǎn)物，是地球上生物量最大的可再生資源，年產(chǎn)量達(dá)7.2 ×1010t［1］。將纖維素材料降解為可發(fā)酵糖，然后轉(zhuǎn)化為乙醇(第二代生物乙醇)，已經(jīng)成為公認(rèn)的可替代化石燃料的可再生性能源途徑。纖維素是由葡萄糖單元以β-1，4-糖苷鍵連接起來的同質(zhì)高聚物。自然界中，纖維素生物質(zhì)的降解是由被稱為纖維素酶的多種酶類混合物共同完成的。包括真菌和細(xì)菌在內(nèi)的許多微生物可以降解纖維素和其他植物細(xì)胞壁纖維，其中絲狀真菌可以通過分泌大量纖維素酶來有效降解纖維素，是目前工業(yè)上用于纖維素酶生產(chǎn)的主要微生物來源［2］。

纖維素酶應(yīng)用廣泛，在工業(yè)酶市場中纖維素酶占據(jù)了重要的份額。在制漿造紙、紡織和食品及飼料工業(yè)中，纖維素酶占到了總酶需求量的75%。然而，在全世界總酶市場中，目前纖維素酶已占到了近20%的份額，隨著生物煉制特別是纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，這個比例將會大大增加［2］。生物煉制上的主要問題是酶的成本，為了使得纖維素乙醇燃料計劃能夠成功實行，纖維素酶的價格必須是合理的［3］。通常，纖維素酶的成本占到纖維素乙醇生產(chǎn)總成本的40% ～49%［4］。在過去的幾年中，纖維素酶生產(chǎn)的價格宣稱已降低了10倍，每生產(chǎn)3.78 L(1加侖)乙醇的纖維素酶價格在10～20美分(約0.6 ～1.2 元)［5］。在一個反應(yīng)器或工程微生物中實現(xiàn)產(chǎn)酶、糖化和發(fā)酵同時進(jìn)行(稱為統(tǒng)合生物加工，CBP)，可以進(jìn)一步降低成本生產(chǎn)“經(jīng)濟(jì)乙醇”，理論上纖維素酶成本可降低到約0.06元/L(4.2美分/加侖乙醇)［2］。但最近的估算并不樂觀，纖維素酶成本大約在0.714元/L(50美分/加侖)纖維素乙醇［6］。如何降低纖維素酶的生產(chǎn)成本已成為生物煉制產(chǎn)業(yè)尤其是纖維素乙醇產(chǎn)業(yè)中的一個重要瓶頸。

對木質(zhì)纖維素生物燃料生產(chǎn)的極大需求激發(fā)了纖維素酶研究的新一輪熱潮。由于在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和生物工程學(xué)上的技術(shù)進(jìn)步，整體上纖維素酶生物技術(shù)取得了顯著進(jìn)展。利用纖維素酶提高生物煉制的關(guān)鍵是尋找或構(gòu)建能夠高產(chǎn)高效纖維素酶的工業(yè)菌株。傳統(tǒng)突變篩選、原生質(zhì)體融合、蛋白質(zhì)工程(包括理性設(shè)計與定向進(jìn)化)以及建立纖維素酶檢測方法等方面都取得了良好的效果，也進(jìn)行了很好的綜述［7-8］。近年來，一些重要纖維素降解真菌，如Trichoderma reesei(瑞氏木霉，亦稱里氏木霉)［9］、Penicillium oxalicum(草酸青霉，原名斜臥青霉)［10］等基因組測序完成以及在開發(fā)降解纖維素的新酶組分和協(xié)同因子領(lǐng)域的進(jìn)展為改良菌株提供了新的可能方向。本文中筆者將在總結(jié)真菌纖維素酶及作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，討論系統(tǒng)生物學(xué)在新酶發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用，并著重探討提高絲狀真菌酶系效率和產(chǎn)量的改良策略。

1 生產(chǎn)纖維素酶的絲狀真菌

能合成分泌纖維素酶的真菌是廣泛存在的，包括子囊菌中的木霉(如T.reesei)和青霉(如P.oxalicum)等、擔(dān)子菌中的白腐真菌(如黃孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium)和褐腐真菌(如癩擬層孔菌Fomitopsis palustris)等以及一些在瘤胃動物消化道中的厭氧真菌(如根囊鞭菌 Orpinomyces sp.)［2］。在工業(yè)生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的是來自子囊菌的絲狀真菌類群。長期以來，木霉屬真菌(如 T.reesei、T.viride和T.longibrachiatum)被認(rèn)為是最有效和強(qiáng)大的結(jié)晶纖維素的降解菌［11］。其中，T.reesei突變株是目前許多酶制劑大公司進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)纖維素酶制劑的菌株［12］。由此，絕大多數(shù)纖維乙醇研究發(fā)展規(guī)劃關(guān)注在T.reesei纖維素酶上。隨著越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，Penicillium、Acremonium(頂孢霉)和 Chrysosporium(金孢子菌)等也可與T.reesei媲美，具有一些重要的特征，如蛋白產(chǎn)量高、比活力高等優(yōu)點［13］。

T.reesei的發(fā)現(xiàn)可以追溯到二戰(zhàn)時期。為了尋找軍用帆布快速腐爛的原因，最終分離并鑒定出T.viride QM 6a，隨后進(jìn)一步篩選出了高效纖維素水解能力的突變菌株QM9414、RUT C30等。為了紀(jì)念Reese在1940代發(fā)現(xiàn)該菌，1977年該菌被命名為T.reesei［1］。Mandels等［14］搜集和篩選了超過1 400種真菌，發(fā)現(xiàn)沒有1種真菌產(chǎn)纖維素酶能超過T.reesei。在工業(yè)發(fā)酵中，曲霉屬的 Aspergillus niger(黑曲霉)等常作產(chǎn)酶菌種［15］，盡管曲霉屬菌種具有編碼內(nèi)切葡聚糖酶和纖維二糖水解酶的基因，但是它們主要用來生產(chǎn)半纖維素酶和果膠酶，所以一般不作為纖維素酶的生產(chǎn)菌株。Humicola insolens(特異腐質(zhì)霉)是另一種纖維素酶工業(yè)生產(chǎn)菌株［11］，但該菌生產(chǎn)的纖維素酶不是用于纖維素糖化，而是用于制漿造紙和紡織品的處理等［16］。盡管H.insolens能夠高效降解結(jié)晶纖維素(超過50%)，但其水解效率很難與 T.reesei比較［11］。

青霉屬真菌可以作為T.reesei的替代菌株用于第二代生物乙醇的生產(chǎn)。青霉屬的纖維素酶制劑與T.reesei相比有一定的優(yōu)點，例如青霉屬的胞外纖維素酶系含有高β-葡萄糖苷酶活力，在等濾紙酶活力(FPU)條件下，降解木質(zhì)纖維素時產(chǎn)生的葡萄糖是 T.reesei的 1.5 ～3 倍［13］。即使在相同的β-葡萄糖苷酶用量和相同的纖維素酶活條件下，青霉屬的酶系也比T.reesei的要優(yōu)［17］。青霉屬高效水解的原因是有高比酶活的 GH7——纖維二糖水解酶(CBH I)。在相同蛋白量下與 Acidothermus cellulolyticus(嗜酸棲熱菌)內(nèi)切葡聚糖酶配合，P.verruculosum(疣孢青霉)的CBH I對玉米秸稈和微晶纖維素的轉(zhuǎn)化率是 T.reesei CBH I的1.3～1.5倍［18］。雖然沒有直接比較過青霉 P.occitanis和T.reesei的CBH I水解能力，但是 P.occitanis的 CBH I受天然纖維二糖的抑制比T.reesei的CBH I小得多，這可能是因為P.occitanis的CBH I具有少量的氫鍵和多變的活性位點［19］。

在木質(zhì)纖維素糖化過程中，A.cellulolyticus(解纖維頂孢霉)也有可能是 T.reesei的替代菌株。Ikeda等［20］研究發(fā)現(xiàn) A.cellulolyticus 發(fā)酵液水解廢紙和廢木屑效果要優(yōu)于2種T.reesei的商品酶——Genencor公司的 GC220和 HIB公司的 Cellulosin T2。日本明治制果(MeijiSeika)公司的A.cellulolyticus商品酶制劑在相同蛋白量下處理不同的木質(zhì)纖維素材料，葡萄糖得率都比Genencor公司的T.reesei商品酶Accellerase 1 000高，這可能是A.cellulolyticus對抑制物的敏感度比 T.reesei低［21］。為了尋找更好的纖維素酶來生產(chǎn)生物乙醇，研究者發(fā)現(xiàn)了許多新的高活力的纖維二糖水解酶。來自A.thermophilum(嗜 熱 頂 孢 霉 )、Chaetomium thermophilum(嗜熱毛殼菌)和 Thermoascus aurantiacus(嗜熱子囊菌)的重組GH7(纖維二糖水解酶)表現(xiàn)出比T.reesei CBH I更高的熱穩(wěn)定性(高4～10 ℃)和高比活力［22］。

金孢子菌Chrysosporium lucknowense的CBH Ia(Cel7A)和CBH IIb(Cel6B)在水解微晶纖維素120 h與T.reesei的CBH I具有相當(dāng)?shù)男Ч?，其中CBH Ia活力比TrCBH I稍低，而CBH IIb比TrCBH I效率高。當(dāng)將C.lucknowense的纖維素酶系進(jìn)行重新組合后獲得了比 T.reesei 2種商業(yè)酶 Celloviridin G20x和 BioAce具有更高的糖化效率［23］。向C.lucknowense纖維素酶系中添加無碳水化合物結(jié)合模塊(CBM)的 EG V(Cel45A)和 CBH 1b(Cel7B)可進(jìn)一步提高對預(yù)處理冷杉木材底物水解的協(xié)同作用［23］。從商品酶的角度比較，Dyadic公司的e酶制劑ArternaFuel C1(來源于C.lucknowens)具有與最新遺傳改良的T.reesei酶制劑Cellic?CTec或Accellerase 1000和1500相當(dāng)?shù)乃庑阅?參見http:∥dyadic.com/c1/)。

2 降解纖維素的酶類組成

纖維素酶采用保留機(jī)制或反轉(zhuǎn)機(jī)制2種不同的催化方式來水解纖維素中的β-1，4-糖苷鍵。例如，所有GH12纖維素酶采用保留機(jī)制水解糖苷鍵，而GH6纖維素酶采用反轉(zhuǎn)機(jī)制［24］。2種催化機(jī)制都利用2個起催化作用的羧基氨基酸殘基，并通過酸堿催化方式反應(yīng)。內(nèi)切纖維素酶(EG)水解纖維素鏈內(nèi)部的糖苷鍵，而外切纖維素酶(CBH)作用于鏈的兩端，產(chǎn)物主要是纖維二糖，然后進(jìn)一步被第三類酶β-葡萄糖苷酶(BGL)水解成葡萄糖。大多數(shù)纖維素酶具有一個小的獨(dú)立折疊的CBM，CBM通過一個彈性的連接區(qū)(linker)與催化結(jié)構(gòu)域(CD)連接。CBM負(fù)責(zé)將酶結(jié)合到結(jié)晶纖維素上，從而提高酶的活力。真菌纖維素降解酶的分類及主要特征總結(jié)在表1中。

2.1.1 內(nèi)切纖維酶

內(nèi)切纖維素酶(EC 3.2.1.4，內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶，EG)，也稱為羧甲基纖維素酶(CMCase)，它可利用人工底物羧甲基纖維素(CMC)來檢測內(nèi)切酶活力。EG通過攻擊纖維素中的無定形區(qū)來促進(jìn)纖維素的降解，這為纖維二糖水解酶提供新的自由末端從而加速水解。真菌EG通常具有比較寬的底物結(jié)合裂縫作為催化活性中心。大多數(shù)EG的最佳pH范圍為4.0 ～5.0、最佳溫度范圍為50 ～70 ℃(表1)。許多真菌產(chǎn)生多種EG［13］。例如，T.reesei產(chǎn)生至少6種EG(EG I/Cel7B、EG II/Cel5A、EG III/Cel12A、EG V/Cel45A、Cel74A 和 Cel5B)［1］，而 在 白 腐 真 菌P.chrysosporium中分離到3種 EG(EG28、EG34和EG44)［25］。另外，一些EG缺少CBM，而另一些具有CBM。例如，T.reesei的 EG I、EG II和 EG V 具有CBM，而 EG III則沒有 CBM 區(qū)［26］。

2.1.2 外切纖維素酶

纖維二糖水解酶(EC 3.2.1.91，纖維二糖水解酶，CBH)從纖維素末端水解 β-1，4-糖苷鍵，在結(jié)構(gòu)上利用延伸的環(huán)(loop)形成一個底物結(jié)合桶，(tunnel)將纖維素環(huán)繞起來。與EG類似，CBH的最佳pH范圍為4.0～5.0，但最佳溫度范圍比較寬，30～60℃。有的CBH作用于纖維素鏈的非還原端，而另一些是從還原端作用，這樣，在2種相反作用方式的酶之間可以提高協(xié)同效應(yīng)。例如，T.reesei具有2種CBH:作用于非還原端的CBH II/Cel6A和還原端的CBH I/Cel7A，從而產(chǎn)生了更有效的纖維素降解能力［11］。T.reesei的2種 CBH 分別在 C端和N段具有CBM［1］。CBH在降解纖維素時的一個重要特點是持續(xù)性降解，它可以沿著纖維素鏈前進(jìn)，不斷地釋放水解產(chǎn)物——纖維二糖。CBH的終產(chǎn)物纖維二糖起到競爭性抑制因子的作用，能夠限制體系內(nèi)酶對所有纖維素分子的降解［26］。

2.1.3 β-葡萄糖苷酶

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21，BGL)，將可溶性纖維二糖和纖維寡糖水解成葡萄糖，因此也會被葡萄糖競爭性抑制。根據(jù)氨基酸序列，BGL屬于GH1和GH3家族［1］。2個家族的BGL都利用保留機(jī)制水解β-1，4-糖苷鍵。BGL由于其結(jié)構(gòu)和定位上的差異，在纖維素降解酶中是變化最多的。一些BGL是相對分子質(zhì)量在3.5×104左右的簡單單體結(jié)構(gòu)(如側(cè)耳 Pleurotus ostreatus的 BGL［27］)，而另一些是相對分子質(zhì)量在1.5×105的二聚體結(jié)構(gòu)(如擲孢酵母 Sporobolomyces singularis的 BGL［28］)或者相對分子質(zhì)量超過4.5×105的三聚體結(jié)構(gòu)(如彩色豆馬勃Pisolithus tinctorius的 BGL)［29］。根據(jù)定位方式，BGL可分為3種類型，胞內(nèi)的、細(xì)胞壁相連的和胞外的，其最佳pH受定位方式的影響較大，最佳溫度范圍45～75℃。從T.reesei培養(yǎng)上清中分離了2種BGL(BGLI/Cel3A和BGLII/Cel1A)，但是它們主要與細(xì)胞壁相連［30］。

表1 絲狀真菌纖維素水解酶的類別及主要特征Table 1 The types of hydrolytic enzymes for cellulose degradation and the related features

2.1.4 降解纖維素的新酶組分與降解機(jī)制新模型

以上描述的3類降解纖維素的酶類都是水解酶，它們通過增加1個水分子水解葡萄糖苷鍵。尤其是外切酶CBH，對于持續(xù)性降解纖維素晶體部分可能是非常重要的。然而，纖維素是緊密包裹的晶體結(jié)構(gòu)，完全依靠這種持續(xù)性的糖苷水解酶的單鏈酶解，效率很慢，要進(jìn)行有效水解就需要相當(dāng)大的酶量，例如T.reesei的外切酶CBH I和CBH II就占到總分泌蛋白量的80%以上。自從半個世紀(jì)前研究纖維素酶開始，Reese就提出可能存在使得纖維素晶體底物更容易降解的其他因子［31］。幾年前，諾維信(Novozymes)公司為了鑒定與T.reesei酶系產(chǎn)生協(xié)同作用的新蛋白質(zhì)時，從太瑞斯梭殼孢霉(Thielavia terrestris)中分離并證實了GH61蛋白是產(chǎn)生協(xié)同作用的新纖維素酶組分［32］。大多數(shù)GH61沒有水解活性，然而一些GH61在二價金屬離子及還原劑存在時，可以顯著減少木質(zhì)纖維素生物素水解所需要的纖維素酶量，不僅可以提高纖維素轉(zhuǎn)化速率，而且對轉(zhuǎn)化效率也有極大地提高［32］。最開始這一類酶被CAZy數(shù)據(jù)庫(carbonhydrate-activity enzymes database)劃分為GH61家族，因為其中的一個成員具有微弱的內(nèi)切葡萄糖苷酶的活性。這些酶實際上具有多糖單加氧酶(polysaccharide monooxygenase，PMO)的活性，因此，這些酶并不是真正的糖苷水解酶。之所以仍然把它們歸在CAZy分類里，是因為它們可以極大地促進(jìn)傳統(tǒng)的纖維素酶對木質(zhì)纖維素的降解［33］。另外，GH61表達(dá)也是受到纖維素的誘導(dǎo)，與其他的纖維素酶的表達(dá)共同調(diào)控［34］。在有氧條件下，PMO作用于PASC才能生產(chǎn)被氧化的多糖。這一現(xiàn)象表明PMO是一個氧化酶。同時，PMO也是一個金屬酶，需要二價金屬離子才能發(fā)揮催化作用。用Cu2+依賴的氧化酶氧化降解纖維素的研究為纖維素降解機(jī)制提出了新的觀點。PMO氧化酶擁有平坦的底物結(jié)合位點，可以附著在纖維素底物平坦的結(jié)晶表面發(fā)揮氧化作用，在底物上產(chǎn)生一個切口，將纖維素的高度結(jié)晶區(qū)打開，從而為其他水解酶如CBH提供水解的靶點，從而起到了顯著的協(xié)同作用［35］。這些最新的研究成果提供了一種多糖單加氧酶輔助傳統(tǒng)纖維素水解酶共同降解纖維素機(jī)制的新模型(圖1)。

圖1 絲狀真菌纖維素酶系降解纖維素機(jī)制的新模型Fig.1 Novel mechanism of cellulose degradation by filamentous fungi

3 組學(xué)時代對絲狀真菌高效纖維素機(jī)制的探索和協(xié)同因子的發(fā)掘

T.reesei作為最具代表性的纖維素降解真菌，對其全基因組的測序為系統(tǒng)解析該菌降解纖維素的機(jī)制以及了解其降解性能優(yōu)缺點提供了契機(jī)［9］。在最初的大規(guī)模cDNA測序中，與纖維素酶同時高表達(dá)的2個編碼CIP I和CIP II的基因是新發(fā)現(xiàn)的含有CBD的蛋白，進(jìn)一步，CIP I被確定為葡糖醛酸酯酶(GE)［35］。全基因組測序后發(fā)現(xiàn)，T.reesei基因組比其他纖維素降解菌基因組具有更少的纖維素降解酶編碼基因，雖然在T.reesei基因組有8種(6種內(nèi)切葡聚糖酶，2種纖維二糖水解酶)編碼分屬不同糖苷水解酶家族的纖維素酶基因，但是，一般只表達(dá)4種主要的纖維素酶:CBH I(Cel7A)、CBH II(Cel6A)、EG I(Cel7B)和 EG II(Cel5A)，占總蛋白的90% ～95%［1］。同時，該基因組中不具有編碼纖維二糖脫氫酶(CDH)、內(nèi)切-β-1，4-半乳聚糖酶(GAL)、阿魏酸酯酶(FAE)、果膠裂解酶(PL)以及果膠酯酶(PE)等基因，這也為進(jìn)一步提高T.reesei降解木質(zhì)纖維素效率提供了改良的可能靶點。最近對另一種高效降解木質(zhì)纖維的Myceliophthora thermophila(嗜熱毀絲霉)的基因組測序發(fā)現(xiàn)，該菌基因組比T.reesei基因組含有更多的多糖單加氧酶(PMO，也稱為GH61蛋白)基因和結(jié)合CBM蛋白的基因［36］。另外，草酸青霉(原稱“斜臥青霉”)是山東大學(xué)篩選到的比T.reesei具有更高BGL活力且產(chǎn)酶周期短的絲狀真菌，基因組測序結(jié)果顯示，該菌比T.reesei具有數(shù)量更多、種類更豐富的木質(zhì)纖維素降解酶［37］。從上述基因組水平的分析可以發(fā)現(xiàn)，一種真菌并不能產(chǎn)生所有降解纖維素的酶類，這也為進(jìn)一步改良菌種提供了分子水平的依據(jù)。

從蛋白質(zhì)組水平上分析特定生長條件下絲狀真菌分泌酶類的整體情況，將會更加直觀地了解降解纖維素底物時的實際酶系組成和比例。對T.reesei分泌酶類的系列蛋白組學(xué)研究表明，該酶系組成中，CBH I和 CBH II占總蛋白量的50% ～80%，EG占到15% ～20%，而木葡聚糖酶(XG)含量為1% ～10%［38］。在不同底物上生長時，T.reesei的分泌酶類情況也不同，例如，以預(yù)處理玉米秸稈(PCS)為底物時，主要分泌蛋白為CBH、木葡聚糖酶(XG)和EG;而以CMC為底物時，分泌酶類主要是CBH、EG、淀粉酶(AMY)和 阿拉伯呋喃糖苷酶(ABF)［38］。草酸青霉在纖維素和麩皮培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，分泌的主要酶類是 AMY、CBH、果膠酶(PEC)、PMO、EG 和 XYN［37］。粗糙脈孢菌 N.crassa在纖維素上生長時，也分泌大量多糖單加氧酶［39］。這些蛋白組分析結(jié)果為設(shè)計高效纖維素酶系復(fù)合物提供了重要的酶譜數(shù)據(jù)參考。

借助蛋白組分析來篩選不同纖維素降解酶系之間的協(xié)調(diào)因子是一個具有良好前景的策略。上述T.reesei酶系協(xié)調(diào)因子GH6蛋白的鑒定，是基于這一蛋白的特定協(xié)調(diào)效應(yīng)來進(jìn)行的逐級組分分離。當(dāng)不同菌株之間多組分協(xié)同或不同酶類間協(xié)同作用時，蛋白組學(xué)分析手段就是一個有效的選擇。最近一些研究表明，許多植物致病菌如 Fusarium verticillioides(鐮刀霉)、Ustilago maydis(玉米黑粉菌)和白腐真菌Trametes gibbosai(褶孔栓菌)的酶系與T.reesei酶系在降解木質(zhì)纖維素材料時具有良好的協(xié)調(diào)效應(yīng)。F.verticillioides的分泌組分析結(jié)果表明該酶系含有豐富的β-木糖苷酶(BX)、阿拉伯呋喃糖苷酶(ABF)和果膠酶［40］。而在 U.maydis分泌組中，半纖維素酶類和葡萄糖-甲醇-膽堿氧化還原酶(GMC)是最主要的組分［41］。T.gibbosa 所分泌的酶類比T.reesei酶系在晶體纖維素上表現(xiàn)出更高的水解活力，而已知T.gibbosa僅含有很少量的纖維素降解酶［42］。因此，要解析其高效水解能力，需要利用蛋白組分析來闡明具體酶類組成，亦可以進(jìn)一步尋找與T.reesei酶系協(xié)同降解纖維素的因子。

4 提高纖維素酶酶解效率和產(chǎn)量的改良策略

為了提高纖維素酶高效率降解轉(zhuǎn)化纖維素材料的目的，一方面需要尋找或利用蛋白工程獲得具有更高活力或特性的單酶組分，另一方面則是提高菌株產(chǎn)酶水平和整體酶系效率。前者主要是蛋白性質(zhì)與工程的研究，已有大量綜述進(jìn)行總結(jié)，同時，突變篩選、菌株融合等傳統(tǒng)方法也比較常用，所以，在此筆者主要對最近比較關(guān)注的降解酶系優(yōu)化、高效表達(dá)平臺構(gòu)建、基因表達(dá)調(diào)控以及蛋白分泌改造等方面進(jìn)行探討。

4.1 酶系組分優(yōu)化改造

真菌共培養(yǎng)是一種可提高木質(zhì)纖維素材料水解效率進(jìn)行酶系優(yōu)化的策略。例如，纖維素降解過程中，3種主要酶組分EG、CBH和BGL需求都比較大，但是沒有真菌菌株能夠同時生產(chǎn)高水平的3種酶。例如，T.reesei可生產(chǎn)大量CBH和EG，但它的BGL活力很低［43］。為提高 T.reesei BGL的活力，一些成功的嘗試已經(jīng)開展，如利用T.reesei的 xyn3和egl3的啟動子同源過表達(dá) BGL I，將BGL活力分別提高了4倍和7.5倍［44］。另外，當(dāng)木質(zhì)纖維素材料轉(zhuǎn)化時，也需要考慮半纖維素的水解。這主要是由預(yù)處理方法決定的。在堿法預(yù)處理過程中，部分木質(zhì)素被除去，這樣半纖維素就必須用半纖維素酶來降解，而酸催化的預(yù)處理中，半纖維素會被除去。一些真菌會對纖維素降解更有效，而另一些真菌產(chǎn)生更多的半纖維素酶降解半纖維素。通過共培養(yǎng)兩種或多種匹配的微生物可以同時高效水解纖維素和半纖維素。事實上，在自然界中，木質(zhì)纖維素材料是被多種共存的纖維素降解微生物共同降解的。共培養(yǎng)兩種或多種真菌進(jìn)行發(fā)酵是抗生素、酶及發(fā)酵食品生產(chǎn)等許多生物過程廣泛采用的策略。與單菌培養(yǎng)相比，混合真菌培養(yǎng)具有許多優(yōu)點，包括提高產(chǎn)量、適應(yīng)性和底物利用率。共培養(yǎng)T.reesei和黑曲霉提高真菌纖維素降解能力已被廣泛研究［29］。共培養(yǎng)的主要缺點是在同一培養(yǎng)基中生長多個微生物的復(fù)雜性。

對天然纖維素降解酶系進(jìn)行理性添加所需酶類也是一種有效策略。例如，T.reesei不具有阿魏酸酯酶和纖維二糖脫氫酶，把其他來源的這2種酶直接補(bǔ)加到T.reesei酶系中可以顯著提高木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化效率［45］。為了提高T.reesei對含有半纖維素酶組分的材料進(jìn)行有效降解，將Podospora anserina(柄孢霉)的5種半纖維素酶添加到T.reesei酶系中，發(fā)現(xiàn)2種甘露聚糖酶可以顯著提高糖化效率［46］。同樣，許多來源不同并含有木聚糖酶、果膠酶、葡萄糖苷酶和阿魏酸酯酶等的粗酶復(fù)合物，盡管它們的纖維素酶活力很低或幾乎沒有，但能夠有效地促進(jìn)T.reesei酶系催化效率［37］，以預(yù)處理玉米秸稈的糖化效率為標(biāo)準(zhǔn)，通過系列組合實驗，獲得了僅由少數(shù)“核心酶”和“輔助酶”構(gòu)成的組合酶系，可與含有80多種蛋白的商品酶媲美［47］。這些研究說明，通過對酶系進(jìn)行優(yōu)化組合可以進(jìn)一步提高纖維素轉(zhuǎn)化效率。

4.2 異源表達(dá)平臺構(gòu)建

異源表達(dá)是提高酶產(chǎn)量和酶活力，并直接獲得改良菌株的有效策略。各種基因工程方法如強(qiáng)啟動子控制、表達(dá)融合蛋白、缺失蛋白酶活力等提高重組蛋白表達(dá)的技術(shù)已比較成熟，為絲狀真菌高效生產(chǎn)異源纖維素酶奠定了基礎(chǔ)［48］。T.reesei的低BGL活力的情況可以通過同源或異源過表達(dá)BGL來改良，如利用內(nèi)源CBH I強(qiáng)啟動子同源過表達(dá)BGL可以提高30%以上的糖化效果［49］，而過表達(dá)來自草酸青霉的BGL可以提高糖化效果達(dá)150%［43］。另外，為了構(gòu)建強(qiáng)大的木質(zhì)纖維素降解真菌，許多具有高活力或特殊性質(zhì)的不同真菌纖維素酶被克隆和表達(dá)。例如，來自嗜熱真菌T.emersonii的熱穩(wěn)定的 BGL/cel3a 在 T.reesei中利用CBH I啟動子進(jìn)行表達(dá)，獲得了高熱穩(wěn)定性(最佳溫度為71.5 ℃)和高比活力［50］。T.reesei的纖維二糖水解酶I和II(CBH I和CBH II)可利用CBH I啟動子進(jìn)行額外多拷貝表達(dá)，CBH I提高了1.3倍(1個多拷貝)和1.5倍(2個多拷貝)，而CBH II在多1個拷貝數(shù)的情況下提高了3～4倍，從而都改善了對纖維素底物的轉(zhuǎn)化效果［51］。另外，利用DNA重組技術(shù)設(shè)計具有特殊應(yīng)用的嵌合蛋白已經(jīng)被應(yīng)用。例如，來自Acidothermus cellulolyticus的1個內(nèi)切酶與 T.reesei CBH I融合表達(dá)在 T.reesei中，這個雙功能的內(nèi)切和外切酶能夠提高糖化產(chǎn)量［52］。要實現(xiàn)絲狀真菌對異源纖維素酶的高效表達(dá)，不可避免遇到的瓶頸是表達(dá)量低，這現(xiàn)象主要存在于蛋白分泌途徑中，異源蛋白不能完成正確的折疊和成熟，或不能順利穿過分泌途徑，從而在細(xì)胞內(nèi)被部分降解或完全降解，這方面的研究正在起步階段。建立起絲狀真菌異源表達(dá)平臺將是獲得高產(chǎn)高效纖維素酶菌株的一個重要途徑。

4.3 基因表達(dá)調(diào)控和蛋白分泌途徑的改良前景

基因工程和蛋白工程手段改良菌株主要是提高了單酶組分的產(chǎn)量或酶活力。從基因表達(dá)調(diào)控水平上進(jìn)行改造，甚至僅改造一個調(diào)控因子則可以實現(xiàn)調(diào)控某個途徑整體表達(dá)變化。這種策略已成功用在釀酒酵母生物燃料生產(chǎn)的改良上。例如，利用易錯PCR方法對轉(zhuǎn)錄因子Spt15進(jìn)行突變從而提高了酵母對乙醇的耐受性［53］。這說明對單個細(xì)胞蛋白的改變就可以實現(xiàn)復(fù)雜表型的改良。實際上，T.reesei高產(chǎn)突變株Rut C30和草酸青霉JU-A10的代謝阻遏解除都是因為對單個轉(zhuǎn)錄抑制因子CRE I/CreA的突變造成的［36］。對RUT C30菌株遺傳差異分析和基因組測序得知cre1基因被截短，而對草酸青霉JU-A10基因組測序發(fā)現(xiàn)CreA基因的1205位缺失一個堿基“C”，從而造成該基因的移碼突變。在進(jìn)一步改造纖維素酶基因表達(dá)調(diào)控方面，通過敲除轉(zhuǎn)錄抑制因子ACEI或CRE I、過表達(dá)激活因子XlnR或LAE I甚至組合改造相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，已經(jīng)一定程度上實現(xiàn)了纖維素酶基因轉(zhuǎn)錄水平的增加，并提高了胞外纖維素酶的產(chǎn)量［36］。這些工作表明:在促進(jìn)產(chǎn)纖維素酶的菌株遺傳工程中，轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白是潛在有效的改良靶標(biāo)。

構(gòu)建高產(chǎn)纖維素酶菌株的一個基本目標(biāo)就是使酶蛋白大量分泌到細(xì)胞外。目前，工業(yè)絲狀真菌一般都具有高水平蛋白分泌能力，如T.reesei的最好突變株可以分泌100 g/L的胞外蛋白。但是，當(dāng)表達(dá)異源蛋白/酶時，產(chǎn)量往往很低，即使采用強(qiáng)啟動子等策略也達(dá)不到目標(biāo)。這主要是因為:過量表達(dá)的異源蛋白超出細(xì)胞承受能力，多肽鏈不能及時正確折疊，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引起非折疊蛋白響應(yīng)(UPR)并進(jìn)一步導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(ERAD)，嚴(yán)重影響了蛋白的順利轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌。一個經(jīng)典例子就是，在構(gòu)巢曲霉 A.niger中表達(dá)異源白腐菌 Trametes versicolor蟲漆酶和植物甜蛋白(Thaumatin)，這2個蛋白的初始產(chǎn)量都很低，但在過量表達(dá)UPR響應(yīng)特異轉(zhuǎn)錄因子hac1持續(xù)激活UPR后，使得異源蟲漆酶產(chǎn)量提高了7倍，而甜蛋白產(chǎn)量提高了 2.8倍［54］。最近，Idiris等［55］系統(tǒng)總結(jié)了遺傳改造蛋白分泌途徑的不同階段，包括蛋白折疊、糖基化、囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)等，提高異源蛋白(包括纖維素酶)產(chǎn)量的基本原理和進(jìn)展?？傊?，改良蛋白質(zhì)分泌途徑也是實現(xiàn)纖維素酶系優(yōu)化和改良的重要策略。

5 總結(jié)與展望

絲狀真菌作為自然界中高效降解纖維素材料的微生物類群，一方面在促進(jìn)C源循環(huán)方面起到了重要作用，另一方面，在工業(yè)上也已經(jīng)成為纖維素酶的主要生產(chǎn)者，在為人類利用可再生性纖維素資源轉(zhuǎn)化生物燃料等化學(xué)品方面具有特殊重要的地位。深入了解絲狀真菌產(chǎn)纖維素酶多樣性，將為挖掘絲狀真菌在降解轉(zhuǎn)化纖維素材料上的巨大潛力奠定基礎(chǔ)。而隨著基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)手段的快速發(fā)展，將會不斷地深入解析絲狀真菌產(chǎn)酶變化及降解纖維素的具體機(jī)制，為產(chǎn)酶菌株改良和酶系優(yōu)化提供重要的參考和規(guī)范。纖維素酶蛋白工程、酶系組分改造、新酶組分的發(fā)現(xiàn)以及高效纖維素酶表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建，將會獲得對各種不同纖維素底物降解效率更高、性能更優(yōu)良的工程菌株，從而提高纖維素酶的效率和產(chǎn)量，最終降低纖維乙醇等生物化學(xué)品的生產(chǎn)成本，使得地球上生物量最大的可再生性纖維素資源轉(zhuǎn)化為社會發(fā)展需要的生物燃料和化學(xué)品，而服務(wù)于人類社會。

［1］ Kubicek C P，Mikus M，Schuster A，et al.Metabolic engineering strategies for the improvement of cellulase production by Hypocrea jecorina［J］.Biotechnol Biofuels，2009，2:19.doi:10.1186/1754-6834-2-19.

［2］ Chandel A K，Chandrasekhar G，Silva M B，et al.The realm of cellulases in biorefinery development［J］.Crit Rev Biotechnol，2012，32(3):187-202.

［3］ Regalbuto J R.Cellulosic biofuels:got gasoline［J］.Science，2009，325:822-824.

［4］ Lynd L R，van Zyl W H，McBride J E，et al.Consolidated bioprocessing of cellulosic biomass:an update［J］.Curr Opin Biotechnol，2005，16(5):577-583.

［5］ Greer D.Spinning straw into fuel［J］.Biocycle，2005，46(4):61-65.

［6］ Wilson D B.Cellulases and biofuels［J］.Curr Opin Biotechnol，2009，20(3):295-299.

［7］ Percival Zhang Y H，Himmel M E，Mielenz J R.Outlook for cellulase improvement:screening and selection strategies［J］.Biotechnol Adv，2006，24(5):452-481.

［8］ Himmel M E，DingSY，JohnsonD K，etal.Biomass recalcitrance:engineering plants and enzymes forbiofuels production［J］.Science，2007，315:804-807.

［9］ Martinez D，Berka R M，Henrissat B，et al.Genome sequencing and analysis of the biomass-degrading fungus Trichoderma reesei(syn.Hypocrea jecorina)［J］.Nat Biotechnol，2008，26(5):553-560.

［10］ Liu G，Zhang L，Wei X，et al.Genomic and secretomic analyses reveal unique features of the lignocellulolytic enzyme system ofPenicillium decumbens［J］.PLoSOne，2013，8(2):e55185.doi:10.1371/journal.pone.0055185.

［11］ Lynd L R，Weimer P J，van Zyl W H，et al.Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2002，66(3):506-577.

［12］ Margeot A，Hahn-H?gerdal B，Edlund M，et al.New improvements for lignocellulosic ethanol［J］.Curr Opin Biotechnol，2009，20(3):372-380.

［13］ Gusakov A V.Alternatives to Trichoderma reesei in biofuel production［J］.Trends Biotechnol，2011，29(9):419-425.

［14］ Mandels M，Sternberg D.Recent advances in cellulase technology［J］.J Ferment Technol，1976，54(4):267-286.

［15］ de Vries R P，VisserJ.Aspergillusenzymesinvolved in degradation of plant cell wall polysaccharides［J］.Microb Mol Biol Rev，2001，65(4):497-522.

［16］ Schülein M.Enzymatic properties of cellulases from Humicola insolens［J］.J Biotechnol，1997，57(1/2/3):71-81.

［17］ Berlin A，Gilkesa N，Kilburn D，et al.Evaluation of novel fungal cellulase preparations for ability to hydrolyze softwood substrates:evidence for the role of accessory enzymes［J］.Enzyme Microb Technol，2005，37(2):175-184.

［18］ Morozova V V，Gusakov A V，Andrianov R M，et al.Cellulases of Penicillium verruculosum［J］.Biotechnol J，2010，5(8):871-880.

［19］ Bhiri F，Gargourib A，Ali M，et al.Molecular cloning，gene expression analysis and structural modeling of the cellobiohydrolase I from Penicillium occitanis［J］.Enzyme Microb Technol，2010，46(2):74-81.

［20］ Ikeda，Y，HayashiH，Okuda N，etal.Eff i cientcellulase production by the f i lamentous fungus Acremonium cellulolyticus［J］.Biotechnol Prog，2007，23(2):333-338.

［21］ FujiiT，F(xiàn)ang X，Inoue H，etal.Enzymatic hydrolyzing performance of Acremonium cellulolyticus and Trichoderma reesei against three lignocellulosic materials［J］.Biotechnol Biofuels，2009，2(1):24.doi:10.1186/1754-6834-2-24.

［22］ Voutilainen S P，Puranen T，Siika-Aho M，et al.Cloning，expression，and characterization of novel thermostable family 7 cellobiohydrolases［J］.Biotechnol Bioeng，2008，101(3):515-528.

［23］ Gusakov A V，Salanovich T N，Antonov A I，et al.Design of highly eff i cient cellulasemixtures for enzymatic hydrolysis of cellulose［J］.Biotechno Bioeng，2007，97(5):1028-1038.

［24］ Bayer E A，Chanzy H，Lamed R，et al.Cellulose，cellulases and cellulosomes［J］.Curr Opin Struct Biol，1998，8(5):548-557.

［25］ Baldrian P， Valásková V.Degradation of cellulose by basidiomycetous fungus［J］.FEMS Microbiol Rev，2008，32(3):501-521.

［26］ Sukharnikov L O，Cantwell B J，Podar M，et al.Cellulases:ambiguous nonhomologous enzymes in a genomic perspective［J］.Trends Biotechnol，2011，29(10):473-479.

［27］ Morais H，Ramos C，Matos N，et al.Liquid chromatographic and electrophoretic characterisation of extracellular beta-glucosidase of Pleurotus ostreatus grown in organic waste［J］.J Chromatogr B，2002，770:111-119.

［28］ Ishikawa E，Sakai T，Ikemura H，et al.Identification，cloning，and characterization of a Sporobolomyces singularis beta-galactosidaselike enzyme involved in galacto-oligosaccharide production［J］.J Biosci Bioeng，2005，99:331-339.

［29］ Dashtban M，SchraftH，Qin W.Fungalbioconversion of lignocellulosic residues:opportunities ＆ perspectives［J］.Int J Biol Sci，2009，5(6):578-595.

［30］ Kubicek C P.Release ofcarboxymethyl-cellulase and βglucosidase from cell walls of Trichoderma reesei［J］.Eur J Appl Microbiol Biotechnol，1981，13(4):226-231.

［31］ Reese E T.Enzymatic hydrolysis of cellulose［J］.Appl Microbiol，1956，4(1):39-45.

［32］ Merino S T，CherryJ.Progress and challenges in enzyme development for biomass utilization［J］.Adv Biochem Eng Biotechnol，2007，108:95-120.

［33］ Horn S J，Vaaje-Kolstad G，Westereng B，et al.Novel enzymes for the degradation of cellulose［J］.Biotechnol Biofuels，2012，5(1):45.doi:10.1186/1754-6834-5-45.

［34］ Vaaje-Kolstad G，Westereng B，Horn S J，et al.An oxidative enzyme boosting the enzymatic conversion ofrecalcitrant polysaccharides［J］.Science，2010，330:219-222.

［35］ Foreman P K，Brown D，Dankmeyer L，et al.Transcriptional regulation of biomass-degrading enzymes in the f i lamentous fungus Trichoderma reesei［J］.J Biol Chem，2003，278:31988-31997.

［36］ Peterson R，Nevalainen H.Trichoderma reesei RUT-C30:thirty years of strain improvement［J］.Microbiology，2012，158(1):58-68.

［37］ Liu G，Qin Y，Li Z，et al.Development of highly efficient，low-cost lignocellulolytic enzyme systems in the post-genomic era［J］.Biotechnol Adv，2013，31(6):962-975.

［38］ Chundawat S P，Lipton M S，Purvine S O，et al.Proteomics-based compositional analysis of complex cellulase-hemicellulase mixtures［J］.J Proteome Res，2011，10(10):4365-4372.

［39］ Phillips C M，Iavarone A T，Marletta M A.Quantitative proteomic approach for cellulosedegradation by Neurospora crassa［J］.J Proteome Res，2011，10(9):4177-4185.

［40］ Ravalason H，Grisel S，Chevret D，et al.Fusarium verticillioides secretomeas a source ofauxiliary enzymes to enhance saccharif i cation of wheat straw［J］.Bioresour Technol，2012，114:589-596.

［41］ Couturier M，Navarro D，Olive C，et al.Post-genomic analyses of fungal lignocellulosic biomass degradation reveal the unexpected potential of the plant pathogen Ustilago maydis［J］.BMC Genomics，2012，13:57.doi:10.1186/1471-2164-13-57.

［42］ Berrin J G，Navarro D，Couturier M，et al.Exploring the natural fungal biodiversity of tropical and temperate forests toward improvement of biomass conversion［J］.Appl Environ Microbiol，2012，78:6483-6490.

［43］ Ma L，Zhang J，Zou G，et al.Improvement of cellulase activity in Trichoderma reeseiby heterologous expression ofa betaglucosidase gene from Penicillium decumbens［J］.Enzyme Microb Technol，2011，49(4):366-371.

［44］ Rahman Z，Shida Y，F(xiàn)urukawa T，etal.Application of Trichoderma reesei cellulase and xylanase promoters through homologous recombination for enhanced production of extracellular beta-glucosidase I［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2009，73(5):1083-1089.

［45］ Bey M，Berrin J G，Poidevin L，et al.Heterologous expression of Pycnoporus cinnabarinuscellobiose dehydrogenase in Pichia pastoris and involvement in saccharif i cation processes［J］.Microb Cell Fact，2011，10:113.doi:10.1186/1475-2859-10-113.

［46］ CouturierM，Haon M，CoutinhoP M.Podospora anserina hemicellulases potentiate the Trichoderma reesei secretome for saccharif i cation of lignocellulosic biomass［J］.Appl Environ Microbiol，2011，77(1):237-246.

［47］ Banerjee G，Car S，Scott-Craig J S，et al.Synthetic multicomponent enzyme mixtures for deconstruction of lignocellulosic biomass［J］.Bioresour Technol，2010，101(23):9097-9105.

［48］ 鐘耀華，王曉利，汪天虹.絲狀真菌高效表達(dá)異源蛋白研究進(jìn)展［J］.生物工程學(xué)報，2008，24(4):531-540.

［49］ Zhang J，Zhong Y，Zhao X，et al.Development of the cellulolytic fungus Trichoderma reesei strain with enhanced beta-glucosidase and f i lter paper activity using strong artif i cial cellobiohydrolase 1 promoter［J］.Bioresour Technol，2010，101(24):9815-9818.

［50］ Murray P，Aro N，Collins C，et al.Expression in Trichoderma reesei and characterisation of a thermostable family 3 betaglucosidase from the moderately thermophilic fungus Talaromyces emersonii［J］.Protein Expr Purif，2004，38(2):248-257.

［51］ Miettinen-Oinonen A，Paloheimo M，Lantto R，et al.Enhanced production ofcellobiohydrolasesin Trichoderma reeseiand evaluation of the new preparations in biofinishing of cotton［J］.J Biotechnol，2005，116(3):305-317.

［52］ Bower B，Larenas E，Mitchinson C.Exo-endo cellulase fusion protein:WO，20060057672［P］.2006-03-16.

［53］ AlperH，Moxley J，NevoigtE，etal.Engineering yeast transcription machineryforimproved ethanoltoleranceand production［J］.Science，2006，314:1565-1568.

［54］ Valkonen M，Ward M，Wang H，et al.Improvement of foreignprotein production in Aspergillus niger var.awamori by constitutive induction of the unfolded-protein response［J］.Appl Environ Microbiol，2003，69(12):6979-6986.

［55］ Idiris A，Tohda H，Kumagai H，et al.Engineering of protein secretion in yeast:strategies and impact on protein production［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，86:403-417.