李鵬飛，陳堃，修冰水，張慶波，張賀秋

1.河北聯(lián)合大學(xué)，河北 唐山 063000；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100850

腺病毒（adenovirus，Ad）包括1～55血清型[1]，能引起急性腺病毒肺炎、急性胃腸炎、眼角膜炎和急性間質(zhì)性腎炎等多種臨床癥狀[2]。我國常見的呼吸道傳播的腺病毒類型主要為3型、7型[3]。腺病毒可以引起呼吸道感染暴發(fā)，特別是生活在軍隊(duì)、學(xué)校等封閉環(huán)境內(nèi)的人群[4-5]。2006年，陜西省岐山縣中學(xué)暴發(fā)急性呼吸道疾病疫情；2012年2月，河北保定解放軍252醫(yī)院發(fā)生聚集性疫情。經(jīng)鑒定，這2起集中發(fā)熱事件均由腺病毒55型（Ad55）感染所致。Ad55是由Ad11與Ad14基因重組而形成的新型毒株[6]，其臨床表現(xiàn)新特征，如發(fā)熱38.5℃以上、流鼻涕、咽痛、咳嗽、伴有呼吸困難，可能更易于暴發(fā)流行，一度被懷疑為SARS、甲流、禽流感[7]，可引起公眾恐慌。由于缺少有效的針對(duì)腺病毒的治療手段和疫苗，因此針對(duì)呼吸道癥候群，研制包含Ad55在內(nèi)的廣譜性腺病毒早期快速診斷試劑，對(duì)疾病預(yù)警、確定隔離人群，控制疾病傳播具有重要意義。

人腺病毒基因組長約36 kb，其衣殼呈規(guī)則的20面體結(jié)構(gòu)，由六鄰體、五鄰體和纖突等蛋白組成復(fù)合結(jié)構(gòu)[8-9]。六鄰體含有型、組和亞組抗原決定簇，是診斷不同血清型的標(biāo)準(zhǔn)[10]。六鄰體含有重要的中和性抗原表位，也是疫苗研究的重要靶點(diǎn)[11]。纖突有血清特異性，且含有體外血細(xì)胞凝集的種屬特異性抗原決定位點(diǎn)。有研究顯示，纖突抗體的產(chǎn)生略早于六鄰體[12]，因此，纖突抗原在早期診斷中具有重要地位。由于Ad55發(fā)現(xiàn)較晚，有關(guān)其抗原表位分析尚未見報(bào)道。我們用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)了Ad55六鄰體和纖突抗原表位，為研制包括Ad55在內(nèi)的腺病毒血清學(xué)檢測(cè)和疫苗提供免疫學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

47份疑似腺病毒呼吸道感染臨床樣本血清由本室保存；48份正常人血清樣本來自北京血站紅十字血液中心；大腸桿菌HB101和表達(dá)載體pBVIL-1由本室保存；Taq DNA聚合酶為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；T4DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；DNA限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ購自Pro?mega公司；配制LB培養(yǎng)基的胰蛋白胨及酵母提取物購自本院條件處；PCR產(chǎn)物回收試劑盒由北京百泰克生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。引物全部由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成；DNA序列測(cè)定由中美泰和生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 抗原表位分析

從 NCBI網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/proteins/）下載Ad55的氨基酸序列，運(yùn)用Biosun生物軟件比對(duì)序列，分析六鄰體、纖突的抗原表位情況，確定克隆表達(dá)的表位區(qū)間。

1.3 引物設(shè)計(jì)與基因合成

根據(jù)抗原表位的氨基酸序列，采用大腸桿菌優(yōu)勢(shì)密碼子設(shè)計(jì)并優(yōu)化優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)間的基因（分段設(shè)計(jì)并合成引物，采用重疊延伸PCR方法合成各基因片段，并逐步將各片段搭橋擴(kuò)增，最終得到完整的優(yōu)勢(shì)抗原區(qū)間基因）。

1.4 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)的上下游引物，對(duì)上述基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而在基因片段兩端引入酶切位點(diǎn)，經(jīng)雙酶切后插入經(jīng)同樣酶切的表達(dá)載體pBVIL-1，轉(zhuǎn)化大腸桿菌HB101，挑選鑒定陽性克隆并測(cè)序。

1.5 抗原表達(dá)與純化

鑒定出的陽性克隆在37℃培養(yǎng)過夜后，轉(zhuǎn)至新鮮的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)2～3 h，至D600nm值為0.4～0.6，42℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h以上，離心收集菌體，用TE緩沖液沖洗菌體并懸起，超聲波破碎細(xì)胞，離心收集上清，用陰離子交換柱Sephrose 4B和分子篩Sephdex G50純化抗原，SDS-PAGE鑒定各步分離產(chǎn)物。

1.6 間接ELISA法評(píng)價(jià)Ad55主要抗原表位活性

以純化的Ad55主要抗原表位蛋白包被酶聯(lián)板，用間接ELISA法對(duì)疑似患者和正常人血清樣本進(jìn)行測(cè)定，根據(jù)D450nm值計(jì)算S/c，評(píng)價(jià)重組抗原的反應(yīng)活性。

2 結(jié)果

2.1 序列比對(duì)與抗原表位選擇

運(yùn)用Biosun生物軟件預(yù)測(cè)Ad55六鄰體、纖突蛋白抗原表位，表位峰值較高的區(qū)段如圖1中橫線所示，Ad55六鄰體含有4個(gè)連續(xù)表位（130～190、180～240、230～280和270～322 aa，以下分別稱為表位1～表位4）和2個(gè)非連續(xù)表位（410～460和620～680 aa，以下分別稱為表位5、表位6），纖突含有2個(gè)主要抗原表位（135～165和210～260 aa，以下分別稱為表位7、表位8），作為克隆表達(dá)的目的序列。

2.2 抗原表達(dá)與純化

測(cè)序結(jié)果顯示基因插入正確。將測(cè)序正確的表達(dá)菌株進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，超聲波裂解后的菌懸液幾乎無沉淀，經(jīng)SDS-PAGE鑒定，8個(gè)融合Ad55蛋白為包涵體形式表達(dá)，純化后，其純度可達(dá)95%以上。

2.3 間接ELISA評(píng)價(jià)8個(gè)融合Ad55蛋白的抗原性

以純化的融合Ad55蛋白包被酶聯(lián)板，用間接ELISA初步檢測(cè)48例正常人和47例疑似患者的血清，ROC曲線分析結(jié)果見圖3。其中表位4、5和8的ROC 曲線下面積（AUC）分別為 0.76（P＜0.05）、0.77（P＜0.05）和0.81（P＜0.05），具有一定的診斷意義。

2.4 3種Ad55診斷抗原的變異分析

考慮到腺病毒具有多個(gè)血清型，我們對(duì)篩選的表位4、5和7等3個(gè)Ad55表位與其他血清型之間的變異情況進(jìn)行了比較，主要篩選了臨床具有呼吸道癥狀，且在我國有流行傳播的3、7、11和14共4種血清型，結(jié)果見表1。篩選的Ad55表位與不同腺病毒血清型之間的序列同源性并不相同，3個(gè)Ad55表位均與Ad11相關(guān)表位之間的同源性最高，與Ad3的同源性最低，提示3個(gè)表位除了可檢出Ad55外，對(duì)Ad11也有相同的檢出能力。表位7除了與Ad3差異較大外，與Ad7、Ad11、Ad14其他型別之間具有較高的同源性；表位5除了與Ad11高度同源外，與Ad3、Ad7、Ad11存在較大差異，是最有可能具有Ad55血清學(xué)特異性的抗原。這一結(jié)果提示，可通過一定的抗原組合達(dá)到針對(duì)多種腺病毒血清型的檢測(cè)目的。

圖1 Ad55六鄰體（A）和纖突（B）的抗原表位分析

3 討論

腺病毒在我國上世紀(jì)50～60年代出現(xiàn)過大規(guī)模流行，其中兒童感染肺炎死亡率高達(dá)30%[13]。沉寂了半個(gè)世紀(jì)后，近些年國內(nèi)又暴發(fā)了多起腺病毒感染造成的集體發(fā)熱疫情。由于腺病毒引發(fā)的肺炎癥狀并不典型，且對(duì)抗生素不敏感，一度被懷疑為SARS、甲流、禽流感等，給公眾造成一定的恐慌，因此，對(duì)腺病毒的早期診斷具有重要意義。

圖2 8種Ad55表位抗原的純化M：蛋白marker；1～8：依次為表位1～8

圖3 8種Ad55表位抗原檢測(cè)的ROC曲線

表1 Ad55篩選表位氨基酸序列的同源性分析

目前針對(duì)腺病毒的檢測(cè)主要是基因檢測(cè)，具有靈敏度高、能分型等特點(diǎn)[14]，但操作復(fù)雜，儀器昂貴，無法用于基層。20世紀(jì)60年代臨床建立的以免疫熒光為主的腺病毒抗原檢測(cè)，主要針對(duì)3型和7型,往往難以檢測(cè)新的腺病毒血清型[15]。本研究針對(duì)新發(fā)腺病毒55開展相關(guān)抗原研究，為研發(fā)廣譜性腺病毒免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)打下基礎(chǔ)。

Ad55是由腺病毒11型與14型基因重組形成的新型毒株[3]，是新發(fā)傳染病原。我們初步用疑似腺病毒感染者血清篩選出3個(gè)Ad55抗原表位，序列比較結(jié)果提示Ad55抗原與Ad11高度同源，與Ad3、Ad7的同源性較差。因此，針對(duì)Ad3、Ad7的單抗無法識(shí)別新發(fā)的Ad55表位，是造成Ad55漏檢的主要原因。本研究獲得的3個(gè)表位，特別是135～165 aa表位，與除Ad3型外所有的腺病毒血清型高度同源。因此，補(bǔ)充Ad3型相關(guān)表位，聯(lián)合本研究篩選的表位，能提高檢測(cè)腺病毒血清型的覆蓋面，最終為研制包括Ad3、Ad7、Ad11、Ad14、Ad55在內(nèi)的我國通用性呼吸道癥狀腺病毒的免疫檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

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