楊海玉 于 濤 楊愛(ài)成 廖曉春

（廣東省江門(mén)市五邑中醫(yī)院，廣東 江門(mén) 529030）

丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)2型糖尿病大鼠心肌TNF-α mRNA表達(dá)的影響*

楊海玉 于 濤△楊愛(ài)成 廖曉春

（廣東省江門(mén)市五邑中醫(yī)院，廣東 江門(mén) 529030）

目的評(píng)價(jià)丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)2型糖尿病大鼠心肌腫瘤壞死因子（TNF）-α mRNA表達(dá)的影響，探討其對(duì)糖尿病心肌病的保護(hù)機(jī)制。方法 將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型對(duì)照組及丹參酮ⅡA磺酸鈉組。成模后丹參酮ⅡA磺酸鈉組給藥12周，留取血及心肌標(biāo)本用放免法檢測(cè)各組大鼠血漿TNF-α，RT-PCR方法檢測(cè)心肌組織中NF-κB、TNF-α mRNA表達(dá)水平。結(jié)果模型對(duì)照組大鼠血漿中TNF-α水平較正常對(duì)照組明顯升高（P＜0.01），且心肌組織中NF-κB、TNF-α mRNA表達(dá)較正常對(duì)照組明顯增加（P＜0．01）。給藥12周后，丹參酮ⅡA磺酸鈉組心肌組織中NF-κB、TNF-α mRNA表達(dá)較模型對(duì)照組明顯降低，兩組之間差異顯著（P＜0.05）。結(jié)論丹參酮ⅡA磺酸鈉可能通過(guò)抑制2型糖尿病大鼠心肌組織中NF-κB通路，減少TNF-α mRNA表達(dá)，對(duì)2型糖尿病大鼠心肌提供保護(hù)作用。

糖尿病心肌病 丹參酮ⅡA磺酸鈉 腫瘤壞死因子-α 核因子-κB

糖尿病心肌病是一種獨(dú)立的糖尿病心血管并發(fā)癥，它是糖尿病引起心臟微血管病變和心肌代謝紊亂所致的心肌廣泛局灶性壞死，早期通常表現(xiàn)為舒張功能不全，晚期以收縮功能不全為主，易發(fā)生充血性心力衰竭［1］，但其發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，至今仍未完全闡明。糖尿病時(shí)高血糖可通過(guò)多種途徑激活機(jī)體炎癥反應(yīng)，是導(dǎo)致糖尿病繼發(fā)性病變的重要原因。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立2型糖尿病大鼠模型，觀察循環(huán)中腫瘤壞死因子（TNF）-α和心肌中NF-κB、TNF-α mRNA的表達(dá)水平，研究丹參酮ⅡA磺酸鈉的干預(yù)作用，進(jìn)一步探討2型糖尿病心肌病的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 成年健康Wistar雄性大鼠30只，體質(zhì)量180～220g，由南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物研究中心提供。

1.2 藥物與試劑 丹參酮ⅡA磺酸鈉由上海第一生化藥業(yè)提供，實(shí)驗(yàn)時(shí)以蒸餾水配制成所需濃度；鏈脲佐菌素（STZ），由廣州捷倍斯生物科技有限公司提供。

1.3 分組與造模 30只健康雄性Wistar大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按抽簽法隨機(jī)選取10只大鼠為正常對(duì)照組，給予普通飼料。其余20只大鼠為進(jìn)行造模，給予高糖高脂飼料（蔗糖∶豬油∶奶粉∶雞蛋∶普通飼料=30∶20∶4∶2∶63，質(zhì)量比）喂養(yǎng)。1月后以小劑量STZ 25 mg/kg，溶于0.1 mol／L枸櫞酸緩沖液（pH4.4）一次性腹腔注射誘導(dǎo)大鼠模型。正常組僅腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液，后每日以同體積蒸餾水灌胃1次。模型組在腹腔注射STZ 2周后斷尾測(cè)空腹血糖，連續(xù)2次＞7.8 mmol／L者為糖尿病大鼠。

1.4 給藥方法 造模成功的糖尿病大鼠再編號(hào)按抽簽法隨機(jī)分為模型對(duì)照組、丹參酮ⅡA磺酸鈉組，各10只。于成模后第2日，丹參酮ⅡA磺酸鈉組大鼠每天按10 mg/kg體質(zhì)量腹腔注射丹參酮ⅡA磺酸鈉，其余2組給予等體積蒸餾水腹腔注射，實(shí)驗(yàn)周期為12周。

1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 第12周結(jié)束時(shí)，禁食12～14 h，測(cè)定血糖（羅氏羅康全活力型血糖儀）后，10％烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠。腹主靜脈取血測(cè)血脂、血漿Ins水平及TNF-α；迅速取出心臟，冰鹽水沖洗后稱左心室質(zhì)量，取部分左心室組織置于10％中性甲醛固定，供蘇木精-伊紅（HE）染色；另取部分心肌置于液氮中留做心肌NF-кB、TNF-α mRNA的檢測(cè)。（1）血漿TNF-α的測(cè)定：采用放射免疫法，藥盒由上海英駿生物技術(shù)有限公司提供。（2）心肌中NF-кB、TNF-α mRNA表達(dá)檢測(cè)：采用RT-PCR方法檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平。引物序列依據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道設(shè)計(jì)，由上海英駿生物技術(shù)有限公司提供。β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）：上游引物5′-ATTG TCAGCAATGCATCCTG-3′，下游引物5′-ATGGACTGTgGTCATGAGCC-3′；TNF-α：上游引物5′-TGCCTCAG CCTCTTCTCATT-3′；下游引物5′-CCCATTTGGGAAC TTCTCCT-3′；NF-кB：上游引物 5′-CGCCTCAGAATCGgCTCTTG-3′；下游引物5′-TCCACTCGGAT ACTAGTCgC-3′。反應(yīng)體系（25 μL）：SYBR Premix Ex TAQTM（2×）12.5 μL，D H2O 8.5 μL，cDNA 2 μL，PCR Forward Prime （10 μmol/L）1 μL，PCR Rervise Prime（10 μmol/L）1 μL。TNF-α基因擴(kuò)增條件為：95℃，3 min（1個(gè)循環(huán)）；95℃，20 s，60℃，40 s（40個(gè)循環(huán)）；NF-кB基因擴(kuò)增條件為：95℃3 min，然后95℃40 s，60℃40 s（35個(gè)循環(huán)）。以β-actin作為內(nèi)參，取PCR產(chǎn)物凝膠成像后用圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s）表示，采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組空腹血糖（FPG）、血脂、血漿胰島素（Ins）和TNF-α水平比較 見(jiàn)表1。模型對(duì)照組大鼠FPG、血漿Ins、TG和TNF-α水平均明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，丹參酮ⅡA磺酸鈉組各指標(biāo)均有下降，其中TNF-α下降明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 各組FPG、血漿Ins、血脂及TNF-α水平比較（±s）

表1 各組FPG、血漿Ins、血脂及TNF-α水平比較（±s）

與正常對(duì)照組比較，#P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。下同。

組 別 n FPG（mmol/L）Ins（mU/L）TG（mmol/L）TNF-α（μg/L）正常對(duì)照組 10模型對(duì)照組 10 5.81±1.27 13.4±2.6 0.58±0.11 3.21±0.77 22.15±4.30# 23.2±5.6# 4.17±0.93# 6.44±1.81#丹參酮ⅡA磺酸鈉組 10 19.98±3.37 21.5±4.3 3.85±0.81 4.34±1.26**

2.2 各組大鼠心肌組織病理變化 見(jiàn)圖1。正常組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊、致密，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核呈卵圓形；模型對(duì)照組大鼠心肌疏松，淡染，提示大鼠心肌纖維腫脹，排列紊亂，空泡變性，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；丹參酮ⅡA磺酸鈉組心肌細(xì)胞排列趨于整齊，結(jié)構(gòu)接近正常。

圖1 各組大鼠心肌組織病理變化（×200）

2.3 各組大鼠心肌 NF-κB、TNF-α mRNA的表達(dá)見(jiàn)表2。給藥12周后，丹參酮ⅡA磺酸鈉組心肌組織中NF-κB、TNF-α mRNA表達(dá)較模型對(duì)照組明顯降低，兩組之間差異顯著（P＜0.05）。

表2 各組NF-κB、TNF-α mRNA比較（±s）

表2 各組NF-κB、TNF-α mRNA比較（±s）

組 別 n NF-кB TNF-α mRNA正常對(duì)照組 10 0.33±0.11 0.44±0.10模型對(duì)照組 10 0.61±0.21# 0.74±0.25#丹參酮ⅡA磺酸鈉組 10 0.43±0.14* 0.51±0.18*

3 討論

心血管并發(fā)癥是糖尿病相關(guān)的病死率和發(fā)病率的主要原因［2］。糖尿病心肌病是一種獨(dú)立于冠心病及高血壓之外的糖尿病心血管并發(fā)癥［3］。目前認(rèn)為發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)可能是其重要發(fā)病環(huán)節(jié)之一［4］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型對(duì)照組大鼠心肌病理學(xué)切片顯示心肌疏松，淡染，心肌纖維腫脹，排列紊亂，空泡變性，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，提示炎癥反應(yīng)參與了糖尿病心肌病過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB是對(duì)炎癥、免疫調(diào)節(jié)較為敏感的轉(zhuǎn)錄因子，活化可產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生。糖尿病大鼠胰島素抵抗、糖脂代謝異常，導(dǎo)致NF-κB的激活，激活NF-κB信號(hào)通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致氧化應(yīng)激的增加，從而擴(kuò)大心肌局部炎癥損傷，引起心肌線粒體功能障礙并發(fā)心功能不全［5-6］。本研究表明，模型對(duì)照組大鼠糖脂代謝明顯異常，血TNF-α水平及其心肌NF-κB、TNF-α mRNA表達(dá)均顯著高于正常組，進(jìn)一步證實(shí)了NF-κB、TNF-α mRNA表達(dá)是糖尿病心肌炎癥損害重要機(jī)制。

研究表明［7］，丹參酮ⅡA具有干預(yù)炎癥反應(yīng)作用，能夠降低左心室心肌中TNF-α的表達(dá)以及肥厚心肌細(xì)胞中NF-κB的表達(dá)，同時(shí)通過(guò)抗氧化減輕TNF-α對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。本研究病理切片發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA磺酸鈉組心肌細(xì)胞排列趨于整齊，結(jié)構(gòu)接近正常。前期研究亦發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)糖尿病大鼠心功能具有保護(hù)作用。上述研究結(jié)果提示，丹參酮ⅡA磺酸鈉對(duì)糖尿病大鼠心肌具有保護(hù)作用。本研究中，丹參酮ⅡA磺酸鈉組大鼠糖脂水平比模型對(duì)照組下降，但差異顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示丹參酮ⅡA對(duì)心肌保護(hù)作用是降糖脂外的作用；與模型對(duì)照組對(duì)比，丹參酮ⅡA磺酸鈉組糖尿病大鼠不但循環(huán)中TNF-α水平明顯降低，心肌中NF-КB、TNF-α mRNA表達(dá)也顯著降低，這與文獻(xiàn)研究基本一致［8］。本研究結(jié)果表明丹參酮ⅡA磺酸鈉可能通過(guò)抑制糖尿病大鼠心肌的NF-кB通路，抑制TNF-α mRNA表達(dá)，從而發(fā)揮對(duì)心肌的保護(hù)作用。

［1］Galderisi M.Diastolic dysfunction and diabetic cardiomyopathy evaluation by Doppler echoeardiography［J］.J Am Coll Cardiol，2006，48（1）：1548-1551.

［2］Mazzone T，Chait A，Plutzky J.Cardiovascular disease risk in type 2diabetes mellitus：insights from mechanistic studies［J］. Lancet，2008，371（9626）：1800-1809.

［3］Seferovi PM，Milinkovi I，Risti AD，et al.Diabetic cardiomyopathy：ongoing controversies in 2012［J］.Herz，2012，37（8）：880-886.

［4］Sun D，Shen M，Li J，et al.Cardioprotective effects of tanshinone IIA pretreatment via kinin B2 receptor-Akt-GSK-3βdependent pathway in experimental diabetic cardiomyopathy［J］.Cardiovascular Diabetology，2011，10（1）：4.

［5］Kim J，Kim CS，Sohn E，et al.Involvement of advancedglycation end products，oxidative stress and nuclear factor-kappaB in thedevelopmentofdiabetic keratopathy［J］.Graefe′sArchive for Clinical and Experimental Ophthalmology，2011，249（4）：529-536.

［6］Lorenzo O，Picatoste B，Ares-Carrasco S，et al.Potential Role of Nuclear Factor КB in Diabetic Cardiomyopathy［J］.Mediators of Inflammation，2011，65（2）：97.

［7］張萌，張伯禮，高秀梅，等.丹酚酸B／丹參酮ⅡA不同配比對(duì)腫瘤壞死因子-α損傷大鼠心肌細(xì)胞的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2003，19（9）：992-994.

［8］Westermann D，Rutschow S，J?ger S，et al.Contributions of inflammation and cardiac matrix metalloproteinase activity to cardiac failure in diabetic cardiomyopathy the role of angiotensin type1 receptorantagonism［J］.Diabetes，2007，56（3）：641-646.

Effect of TanshinoneⅡA Sulfonate Sodium on TNF-α m RNA Expression in Rats w ith Type-ⅡDiabetic M yocardium

YANG Hai-Yu，YU Tao，YANG Ai-Cheng，et al.Jiangmen Wuyi Traditional Chinese Medicine Hospital，Guangdong Province，Guangdong，Jiangmen 529030，China

Objective：To evaluate the effect of tanshinoneⅡA sulfonate sodium on TNF-α mRNA expressions in myocardium of rats with type-Ⅱdiabetics and further discuss the protective mechanism of diabetic cardiomyopathy. M ethods：Wister rats were random ly divided into normal controlgroup（NC），model controlgroup（DM）and tanshinoneⅡA sulfonate sodium treatmentgroup（DMS）.After rats model was established and STS was administrated for 12 weeks.Specimens of blood and myocardium in rats were reserved for detecting serum TNF-α by radio immunoassay and expressions of NF-κB（Nuclear factor-kappa B）、TNF-α mRNA in myocardium by RT-PCR.Results：Compared with the NCgroup，the level of TNF-α in DMgroup elevated（P＜0.01）.Compared with the NCgroup，the NF-κB and TNF-α mRNA expressions in myocardium of DMgroup significantly increased （P＜0.01）．However，the NF-κB and TNF-α mRNA expressions in myocardium of DMSgroup after 12 weeks treatment were less than those of DMgroup，showing statistical differences （P＜0.05）.Conclusion：TanshinoneⅡA sulfonate sodium can reduce TNF-α mRNA expressions in myocardium of rats with type-Ⅱdiabetics by inhibition of NF-κB pathway and protect the diabetic rats′myocardium.

Diabetic cardiomyopathy；TanshinoneⅡA sulfonate sodium；TNF-α；NF-κB

R285.5

A

1004-745X（2014）03-0440-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.03.025

2013-12-10）

廣東省江門(mén)市科技局資助課題（20107514）

△通信作者