郭建國(guó)，趙龍浩，徐 丹，孫野青

(大連海事大學(xué)環(huán)境系統(tǒng)生物學(xué)研究所，大連 116026)

人工濕地是一類人工建造、模仿自然濕地的綜合性生態(tài)體系［1］，通過(guò)對(duì)自然濕地的模擬，利用人造生態(tài)系統(tǒng)中的物理、化學(xué)和生物的協(xié)同作用，可以促進(jìn)廢水中污染物質(zhì)良性循環(huán)，實(shí)現(xiàn)對(duì)污水的凈化，防止環(huán)境的再污染，獲得污水處理與資源化的最佳效益。人工濕地作為一種低成本、高效率的手段早在20世紀(jì)初就開始被應(yīng)用于污水的處理，目前已經(jīng)被廣泛用于各種污水處理;如重金屬排放工業(yè)污水、生活污水、造紙污水和畜牧業(yè)廢水等［2-11］。在人工濕地的去污過(guò)程中，植物、基質(zhì)和微生物共同發(fā)揮了重要的作用，其中微生物的作用最大［12-13］，是降解水體中污染物的主力軍。

目前，關(guān)于人工濕地微生物的研究多集中于人工濕地基質(zhì)中的不同位置，不同深度微生物群落的結(jié)構(gòu)及隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)演變過(guò)程［13-14］，用于探索人工濕地中穩(wěn)定的微生物群落的形成規(guī)律。人工濕地處理的工業(yè)污水，大多關(guān)注于其中污染物的含量，如COD，對(duì)于排入環(huán)境的水樣中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究較少，對(duì)人工濕地處理造紙污水后的微生物群落的研究更少。

造紙行業(yè)為全世界第五大能源耗費(fèi)產(chǎn)業(yè)，也是需水量最多的行業(yè)，能夠造成嚴(yán)重的河流污染問(wèn)題，因此如何處理和凈化造紙污水已經(jīng)越來(lái)越受到重視。但是污水排放過(guò)程中的微生物的危害并沒(méi)有引起太大關(guān)注。在微生物監(jiān)測(cè)中，通常選擇大腸桿菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌，沙門氏菌等一些生活污水中的代表性微生物，這些微生物在工業(yè)污水中有的并不具有代表性，而其他的一些代表微生物的危害性不容忽視。所以，本論文結(jié)合人工濕地對(duì)造紙污水處理后水質(zhì)的情況和細(xì)菌群落的變化來(lái)研究人工濕地在污染物和病原微生物去除的雙重作用，為今后人工濕地作為處理工業(yè)污水和降低病原微生物的環(huán)境排放提供有效可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究的水樣于2012年8月采自遼寧省錦州市金城造紙廠排污口和人工濕地處理后的出水口。將排污口水樣編號(hào)為 PWK，出水口水樣編號(hào)為CSK。該人工濕地為水平潛流濕地，基質(zhì)填料為礫石，占地10hm2，處理規(guī)模2t4/d，主要的挺水植物為茭白、蘆葦、香蒲。企業(yè)排放的污水在廠區(qū)內(nèi)進(jìn)行處理后，經(jīng)過(guò)約2km管線輸送至潛流濕地處理區(qū)的提升泵站，將污水由泵提升至潛流濕地去除多種污染物，潛流濕地出水進(jìn)入渠塘濕地，最后排入大凌河。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水樣理化因素的測(cè)定

DO由溶氧儀雷磁GTB-607A測(cè)定，pH由PH計(jì)雷磁THB-1測(cè)定，鹽度S由鹽度計(jì)測(cè)定，總氮、氨氮、總磷、磷酸鹽、化學(xué)需氧量的測(cè)定參照《水質(zhì)分析方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)匯編》(1996，ISBN:7506612801)中提供的方法進(jìn)行。

1.2.2 DNA 的提取

水樣經(jīng)300目的無(wú)菌紗布過(guò)濾除去大型顆粒和雜質(zhì)，取300ml，使用真空泵將水樣經(jīng)0.22um的硝酸纖維素膜過(guò)濾，將濾紙剪碎后，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》CTAB法提取DNA。

1.2.3 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

對(duì)DNA濃度定量，以提取的水樣微生物DNA為模板，用引物對(duì) U968-GC-F(5'CGCCCGGG GCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCAGGGGG GAA CGCGAAGAACCTTAC3')和L1401-R(5'CGGTGTGTACAAGACCC3')擴(kuò)增16SrDNA的 V6-V8區(qū)，94℃5min，(94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min)30 cycles，72℃ 10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物定量到400 ng進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，120V 17h，60℃保溫，聚丙烯酰胺凝膠的濃度為8%，變性濃度為45%—65%。電泳結(jié)束后，進(jìn)行硝酸銀染色，然后利用UVP掃描儀進(jìn)行掃描成像。

1.2.4 克隆測(cè)序

對(duì)膠上的主要條帶利用PAGE膠回收試劑盒(BIOMIGA)進(jìn)行膠回收，然后利用引物 B968(5'AACGCGAAGAACCTTAC3')，L1401-R進(jìn)行條帶擴(kuò)增，對(duì)目的條帶利用瓊脂糖膠回收試劑盒(TIANGEN)回收，回收產(chǎn)物利用DNA Ligation Kit Ver.2.1(TAKARA)進(jìn)行 PMD18 T-vector的連接和轉(zhuǎn)化，驗(yàn)證的陽(yáng)性克隆送去Invitrogen北京分公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)利用 SPSS處理，DGGE圖譜利用Quantity one對(duì)主要條帶進(jìn)行灰度分析，導(dǎo)出相應(yīng)的灰度值，用于微生物多樣性指數(shù)和均勻度指數(shù)的計(jì)算。測(cè)序結(jié)果已上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，GenBank編號(hào)為:KF305475-KF305491。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工濕地處理后的水質(zhì)評(píng)價(jià)和主要污染物的檢測(cè)

對(duì)造紙廠排污口(PWK)和人工濕地出水口(CSK)兩處水樣的主要水質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明人工濕地對(duì)污染物有較好的去除作用，水質(zhì)有所改善。

表1 人工濕地處理前后水樣理化因素的測(cè)定Table 1 The physicochemical characteristic of wasterwater samples before or after treatment with aritficial wetland

2.2 人工濕地處理后對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響分析

2.2.1 人工濕地處理后微生物群落多樣性分析

利用DGGE技術(shù)對(duì)造紙廠排污口(PWK)和人工濕地出水口(CSK)兩處水樣的微生物群落的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，每個(gè)采樣點(diǎn)設(shè)兩個(gè)重復(fù)樣，如圖1所示，PWK樣本有12條明顯的條帶(P1-12)，CSK樣本有6條明顯的條帶(P2，C1-5)，通過(guò)比較各條帶的位置發(fā)現(xiàn)兩者之間僅有P2條帶位置相同，人工濕地處理后微生物群落圖譜改變。

圖1 人工濕地處理前后水中微生物的圖譜分析Fig.1 The profile of microbe in the wasterwater before and after treatment with aritficial wetland

進(jìn)一步對(duì)造紙廠排污口(PWK)和人工濕地出水口(CSK)兩處水樣的微生物群落進(jìn)行分析如表2，與排污口相比，出水口中微生物Shannon-Wiener's指數(shù)、物種多度和均勻度降低，微生物結(jié)構(gòu)趨于簡(jiǎn)單化，這些結(jié)果提示人工濕地處理后污染物的種類減少，導(dǎo)致參與污染物降解的微生物種類減少。

表2 人工濕地處理后的微生物多樣性、物種多度和均勻度分析Table 2 Analysis of the Shannon-Wiener's index，Species richness and Evenness of microbial communities before and after treatment with aritficial wetland

2.2.2 人工濕地處理后微生物種群的分析

主要條帶經(jīng)克隆測(cè)序序列比對(duì)，分析發(fā)現(xiàn)17種微生物中，12個(gè)屬于變形菌門。人工濕地處理前的造紙污水中以γ變形菌和衣原體為主要菌群，處理后主要以α變形菌為主，γ變形菌比例降低(如圖2)，人工濕地處理后微生物種群分布發(fā)生改變。

2.2.3 人工濕地處理后微生物種群的功能分析

已鑒定的微生物根據(jù)功能主要分為三類:致病作用(Pathogen)、固氮作用(N2fixation)和降解作用(Degradation)。如圖 3所示，在造紙廠排污口(PWK)，微生物主要以致病菌和降解菌為主;而在人工濕地出水口中，環(huán)境友好的固氮菌為主要優(yōu)勢(shì)菌，具有致病作用的細(xì)菌比例明顯下降。

經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)在造紙污水中存在較多的污染物降解菌和致病菌，而在出水口中這類微生物的比重較低。在造紙廠排污口處中，Thioalkalivibrio為硫氧化細(xì)菌，參與反硝化過(guò)程［15］;Dehalococcoides可以在氯乙烯和三氯乙烯污染的環(huán)境中大量富集［16］，為脫氯細(xì)菌，在歐洲六氯苯污染的河流中，發(fā)揮了重要的脫氯作用［17］;Hyphomicrobium 可降解氯甲烷［18-19］，農(nóng)藥甲胺磷［20］。其中的致病菌和人類疾病的發(fā)生關(guān)系密切，Legionella具有耐受青霉素的特性，是第一種被發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)的細(xì)菌病原體，可以引起一種高致死性肺炎［21］;Klebsiella可以引起呼吸疾病、肝膿腫、腸道疾病和骨髓炎等［22-25］;Parachlamydia可以引起角膜炎和肺炎［26-27］。

圖2 人工濕地處理前后的微生物種群分布比例情況Fig.2 The percentage of different classes of microbe in the sample PWK and CSK

圖3 人工濕地處理前后的不同功能細(xì)菌分布比例情況Fig.3 The percentage of different bacteria according to their function in the sample PWK and CSK

在人工濕地出水口處，Mesorhizobium，Rhizobium為植物共生固氮菌［28-30］，廣泛存在于土壤中，與豆科植物共生，形成根瘤，有利于植物固氮。Variovorax存在于微量污染的環(huán)境中，以可溶性有機(jī)物為碳源，通過(guò)環(huán)羥基化降解農(nóng)藥高香草酸［31］，選擇性除草劑利谷?。?2］，三氯乙烯［33］，它們可以與植物和其他微生物相互作用，促進(jìn)生態(tài)修復(fù)過(guò)程［34］。Rhodobacter是一種革蘭氏陰性菌，它們廣泛的存在于淡水和高鹽環(huán)境下，代謝功能復(fù)雜。Cryobacterium主要從冰川和冰川土壤中分離得到［35］，功能研究較少。

表3 測(cè)序微生物序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析Table 3 Analysis of the sequencing microbia compared with NCBI database

續(xù)表

3 結(jié)論與討論

隨著環(huán)境保護(hù)的迅速發(fā)展，人工濕地以其獨(dú)到的優(yōu)越性受到了越來(lái)越多的關(guān)注，已經(jīng)普遍地應(yīng)用于各種污水的處理。本研究中的人工濕地位于遼寧省錦州凌海市金城造紙廠污水處理區(qū)，植物以中國(guó)北方用于處理污水的適用物種蘆葦、茭白和香蒲為主，它們根系發(fā)達(dá)，耐污能力強(qiáng)，去污效果好，適應(yīng)當(dāng)?shù)丨h(huán)境。本研究結(jié)果顯示人工濕地可以改善造紙污水的水質(zhì)，對(duì)TN和TP都有較好的去除率，COD降低66.59%，說(shuō)明該潛流人工濕地對(duì)于造紙污水中污染物的去除有很好的效果。這與濕地植物的交替種植，植物根系的吸附、分解和轉(zhuǎn)化作用有關(guān)。在主要污染物中TN的去除率最高，與濕地中的微生物在氮的轉(zhuǎn)化和去除過(guò)程中的硝化/反硝化作用有關(guān)［36，37］，人工濕地基質(zhì)中形成了有效的降解污染物的微生物菌群。

微生物群落研究表明，在造紙污水中含有與污染物降解有關(guān)的微生物，如 Dehalococcoides和Hyphomicrobium，提示污水中有機(jī)污染物的存在。而且在造紙污水中致病性細(xì)菌達(dá)50%以上，如Legionella、 Klebsiella、 Parachlamydia。 特 別 是Legionella大量存在，可以引起致死性的肺炎，該病菌與1976年在美國(guó)發(fā)生的肺炎大爆發(fā)密切相關(guān)［38］。它們排入環(huán)境中不僅污染水體，而且對(duì)食物鏈中營(yíng)養(yǎng)級(jí)較高的動(dòng)物危害較大，甚至可以造成人類傳染性疾病大規(guī)模爆發(fā)，這些微生物種類與工業(yè)類型，生產(chǎn)工藝有很大關(guān)系，它們并不包含在常規(guī)的生活污水微生物監(jiān)測(cè)種類中，如總大腸菌群、糞大腸菌群、糞鏈球菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、沙門氏菌等［39］。所以，在工業(yè)病原微生物的監(jiān)測(cè)方面還需要大量的研究。

在經(jīng)過(guò)人工濕地處理后，微生物群落的結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化，主要微生物由γ變形菌和衣原體變?yōu)棣磷冃尉?，處理后水樣中大量致病菌被去除了。微生物的去除由人工濕地中化學(xué)、物理及生物作用共同完成的［40］。夏季溫度適宜，系統(tǒng)中植物的生理生化活性較高，植物根系對(duì)于微生物的沉積和去除有很大作用。沉積作用是人工濕地中病原微生物去除的最主要途徑［41］。該人工濕地的基質(zhì)為礫石，已有研究表明較小粒徑的礫石濾料可以在濾池中截留住微生物。污水進(jìn)入人工濕地后，水中含有的微生物會(huì)粘附于懸浮固體顆?；驊腋∮谒w中，通過(guò)與基質(zhì)相互作用與水體分離。分離的微生物的聚集形成生物膜，其中具有降解能力的微生物在其中發(fā)揮降解功能，這也是礫石濾池去除污染物的主要途徑。存活的微生物可能從固體基質(zhì)中釋放，滯留在生物膜上或基質(zhì)間隙水中，或者重新返回水體［42］。沿著污水流經(jīng)濕地的徑跡，污染物的種類和濃度不斷降低，污水中原有的微生物經(jīng)過(guò)吸附解吸過(guò)程不斷與周圍其他微生物發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)作用。在競(jìng)爭(zhēng)過(guò)程中，由于原有環(huán)境的改變，不適應(yīng)環(huán)境的微生物多數(shù)會(huì)死亡，被周圍適應(yīng)環(huán)境的微生物替代。所以，水體中微生物的組成可以反映水質(zhì)的狀況。人工濕地處理造紙污水后水中多為環(huán)境友好的固氮菌和小部分致病菌，這也表明水質(zhì)有所改善。

工業(yè)污染物種類繁多，常規(guī)的理化指標(biāo)不能反映所有的污染物情況，而且需要投入巨大的資金和精力，有時(shí)具有局限性，而微生物群落結(jié)構(gòu)的研究在一定程度上可以彌補(bǔ)這一不足，環(huán)境中的微生物組成可以與理化指標(biāo)共同反映水質(zhì)狀況。本研究的結(jié)論也證實(shí)了這一點(diǎn)。

本研究主要對(duì)人工濕地處理造紙污水中微生物群落的影響進(jìn)行了研究，還有必要開展對(duì)其他工業(yè)污水中的微生物群落的研究，擴(kuò)展微生物在評(píng)價(jià)污水處理系統(tǒng)對(duì)污染物和致病菌的雙重去除作用［43］。值得重視的是，人工濕地處理后的水中依然存在可以引起呼吸疾病、肝膿腫、腸道疾病的致病菌，如Klebsiella細(xì)菌，它們提醒人們應(yīng)該關(guān)注工業(yè)污水排放過(guò)程中的致病微生物的監(jiān)測(cè)和致病微生物的排放控制，這樣可以防止污水在環(huán)境中引起生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

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