張廣慧 吳方榮 何明利 郭振委 秦新月

電刺激嗅球?qū)δX缺血再灌注大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖、遷移及分化的影響

張廣慧 吳方榮 何明利 郭振委 秦新月

目的 探討嗅球電刺激對腦缺血再灌注大鼠腦內(nèi)神經(jīng)發(fā)生的影響。方法 將健康雌性SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、電刺激組、假刺激組，其中腦缺血再灌注組、電刺激組，以線栓法建立大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）/再灌注模型，假手術(shù)組僅分離出頸內(nèi)動脈；電刺激組在右側(cè)嗅球內(nèi)埋置雙極電極，于MCAO再灌注后對嗅球進行電刺激，假刺激組只埋置電極，不進行電刺激；以5—溴脫氧尿嘧啶（Brdu）標記內(nèi)源性神經(jīng)干細胞（NSC）。假手術(shù)組于術(shù)后48 h、1周，腦缺血再灌注組于缺血再灌注后48 h、1周，電刺激組及假刺激組于刺激后48 h、1周分別行Brdu免疫組化染色，觀察各組腦室下區(qū)（SVZ）區(qū)NSC增殖情況；假手術(shù)組、缺血再灌注組、電刺激組、假刺激組4組大鼠在電刺激組行電刺激后腹腔注射Brdu 50 mg/kg，2次/d，連續(xù)2 d，4周后處死，分別取腦切片，進行免疫組化和免疫熒光雙標染色，觀察各組NSC遷移和分化情況。結(jié)果 缺血再灌注組（37.67±1.97）、假刺激組（36.5±2.35）和電刺激組（43.67±1.63）大鼠48 h后SVZ區(qū)Brdu陽性NSC細胞數(shù)較假手術(shù)組（15.5±1.52）明顯增多（=57.21，＜0.05），缺血再灌注組（41.17±2.94）、假刺激組（41.83±2.14）和電刺激組（47.67±2.34）1周后Brdu陽性細胞數(shù)較假手術(shù)組（15.5±1.52）增多（=73.62，＜0.01），電刺激組在各時間點均較其他組Brdu陽性NSC細胞數(shù)增多（＜0.01）。缺血并注射Brdu 4周后缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)電刺激組Brdu陽性NSC細胞數(shù)（57.17±2.4）較缺血再灌注組（46.83±2.48）和假刺激組（45.83±2.14）增多（=161.50，＜0.01）；免疫熒光雙標染色示電刺激組Brdu陽性NSC細胞中Brdu/神經(jīng)元核抗原（Neun）雙陽性細胞比例約為（74.67±3.61）%，Brdu/膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）雙陽性細胞比例約為（38.83±3.36）%，與缺血再灌注組和假刺激組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均＞0.05）。結(jié)論 電刺激嗅球可能促進腦缺血大鼠SVZ區(qū)NSC增殖，并可能促進新生NSC向缺血皮質(zhì)區(qū)遷移，增加缺血皮質(zhì)新生神經(jīng)元數(shù)量，但SVZ區(qū)新生NSC的分化不受影響。

電刺激；缺血再灌注；神經(jīng)發(fā)生，大鼠

目前已經(jīng)公認，生理條件下，在成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)中海馬齒狀回（dentategyms，DG）的顆粒下層（subgranulazone，SGZ）和腦室下區(qū)（subventricular zone，SVZ）兩個區(qū)域存在神經(jīng)干細胞（neural stem cell，NSC）［1］。有研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血可激活自體NSC增殖［2］，但增殖的NSC數(shù)量有限，且只有少部分能夠存活。如何增加內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生，誘導(dǎo)NSC向損傷腦區(qū)遷移，仍有待于進一步研究。本文作者的前期工作研究表明，電刺激嗅球能促進正常大鼠SVZ區(qū)NSC的增殖和遷移，但其對腦缺血大鼠內(nèi)源性NSC增殖和遷移的影響尚未知［3］，國內(nèi)外也未見相關(guān)報道。本研究擬觀察電刺激嗅球?qū)δX缺血再灌注大鼠SVZ區(qū)NSC增殖、向缺血區(qū)遷移及其分化的影響，期望為治療腦梗死提供新的思路和方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動物：健康成年雌性清潔級Sprague-Dawley（SD）大鼠72只，體質(zhì)量250～280 g，購于重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。大鼠接受自然晝夜規(guī)律光照，飼養(yǎng)周圍環(huán)境溫度為25℃左右，自由飲水、攝食。

1.1.2 主要試劑和儀器：Brdu（sigma公司），鼠抗Brdu單克隆抗體（Chemicon公司），兔抗神經(jīng)元核抗原（neuronal nuclei antigen，Neun）單克隆抗體（博奧森公司），兔抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）多克隆抗體、FITC標記的熒光二抗及TRITC標記的熒光二抗（武漢博士德公司），SP通用試劑盒（北京中衫公司）。倒置相差顯微鏡及熒光顯微鏡（Olympus公司，日本），多導(dǎo)電生理儀（BIOPAC system MP100）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及模型制作：將大鼠隨機分為假手術(shù)組（18只）、腦缺血再灌注組（18只）、電刺激組（18只）、假刺激組（18只）。參照Xu等［4］的方法，對腦缺血再灌注組、電刺激組、假刺激組大鼠，運用線栓法建立大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）/再灌注模型。根據(jù)Zea Longa的神經(jīng)功能評分標準［5］，將雖然有癥狀，但神經(jīng)功能評分小于1分的大鼠排除。因各種因素致動物數(shù)量不足者通過隨機抽樣原則補齊。假手術(shù)組僅分離出頸內(nèi)動脈，不插入栓子。據(jù)Linster等［6］的方法制作嗅球電刺激模型，電刺激組及假刺激組安放電極后行腦缺血再灌注。大鼠按體質(zhì)量350 mg/kg以水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后，取頭部正中切口，暴露顱骨。根據(jù)Paxinos腦圖譜［7］，在右側(cè)嗅球內(nèi)，以前囟為原點，取前囟前7.1 mm，中線旁右側(cè)1.7 mm，硬膜下3.8 mm為靶點，垂直插入不銹鋼雙極電極，電極焊接到一個小型插頭，然后用牙科水泥固定插頭。缺血再灌注后立即給予電刺激干預(yù)。以多導(dǎo)電生理儀進行電刺激，直流方波，電流10μA，時程0.5 ms，頻率50 Hz，1次/d，每次1 h。假刺激組安置電極后不給予電刺激干預(yù)，余操作同電刺激組。

1.2.2 SVZ區(qū)NSC增殖情況檢測：假手術(shù)組于術(shù)后48 h、1周，腦缺血再灌注組于缺血再灌注后48 h、1周，電刺激組及假刺激組于電刺激后48 h、1周各取6只大鼠處死（大鼠于處死前1 d腹腔注射Brdu按體質(zhì)量50 mg/kg，共注射3次，每次間隔4 h），經(jīng)主動脈以4%（質(zhì)量濃度）多聚甲醛（PFA）灌注取腦，置于4%（質(zhì)量濃度）PFA中進行后固定，石蠟包埋后制作石蠟切片，在前囟點正中前0.1～0.3 mm處收集10張10μm厚切片，參照說明書進行Brdu免疫組化染色，DAB顯色后常規(guī)脫水、透明、封片。Brdu陽性細胞為胞核染色呈淡黃色；于400倍顯微鏡下觀察切片并攝片，隨機選擇5個非重疊視野，以缺血側(cè)SVZ區(qū)、皮質(zhì)為觀察部位，每只動物的每個部位隨機選取5張非連續(xù)切片，計數(shù)每個視野的陽性細胞數(shù)后計算每只大鼠所要分析部位的平均Brdu陽性細胞數(shù)。

1.2.3 NSC遷移和分化情況：假手術(shù)組、缺血再灌注組、電刺激組、假刺激組四組大鼠（每組6只）在電刺激組行電刺激后經(jīng)腹腔注射Brdu按體質(zhì)量50 mg/kg，2次/d×2 d，4周后處死，分別取腦，行冠狀位切片，放入4%（質(zhì)量濃度）PFA中固定，24 h內(nèi)取出，石蠟包埋，制作石蠟切片，片厚10 μm，收集前囟點正中前0.1～0.3 mm處10張切片，進行Brdu/Neu N、Brdu/GFAP免疫熒光雙標染色：切片經(jīng)HCL、胰酶等變性、抗原修復(fù)及血清封閉后，加入鼠抗Brd U抗體（1∶100）和兔抗Neu N（1∶50）或兔抗GFAP（1∶50）抗體，4℃過夜，加入TRITC標記的羊抗鼠IgG（1∶50）與FITC標記的羊抗兔Ig G（1∶50）混合抗體，室溫孵育2 h，50%（體積分數(shù)）緩沖甘油封片，于200倍熒光顯微鏡下照相，觀察新生細胞的遷移和分化情況。將Brdu陽性細胞判斷為新生細胞，皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)的陽性細胞認為是遷移細胞，細胞同時表達Brdu/Neu N、Brdu/GFAP認為是發(fā)生分化。參照Nakatomi等［8］的方法在每張切片缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)截取10個400倍視野，計數(shù)雙標陽性細胞（Brdu/ NeuN或Brdu/GFAP）數(shù)和Brdu陽性細胞總數(shù)，然后分別計算Brdu/Neu N、Brdu/GFAP陽性細胞數(shù)占Brdu陽性細胞總數(shù)的百分比。Brdu陽性細胞為紅色熒光，GFAP和Neun陽性細胞為綠色熒光。Brdu/Neun雙陽性細胞呈現(xiàn)為淡黃色。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0軟件進行分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（± ）表示。假手術(shù)組、腦缺血再灌注組、假刺激組、電刺激組四組間Brdu陽性細胞數(shù)比較采用ANOVA單因素方差分析，率的比較采用卡方檢驗。以＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Brdu免疫組化染色 缺血再灌注組、電刺激組，假刺激組SVZ區(qū)Brdu陽性細胞數(shù)在大鼠腦缺血后48 h均較假手術(shù)組明顯增多，1周時更為明顯；電刺激組各時間點陽性細胞數(shù)均較其他組相應(yīng)時間點多（48 h時：=57.21，＜0.05；1周時：=73.62，＜0.01）。電刺激后4周時假手術(shù)組大鼠右側(cè)皮質(zhì)區(qū)只有極少數(shù)Brdu陽性細胞，缺血再灌注組、假刺激組和電刺激組缺血側(cè)皮質(zhì)區(qū)可見大量Brdu陽性細胞，其中電刺激組Brdu陽性細胞數(shù)較缺血再灌注組和假刺激組增多（= 161.50，＜0.01）（表1，圖1、2）。

2.2 Brdu/Neun和Brdu/GFAP免疫熒光雙標染色 在電刺激組Brdu陽性細胞中，Brdu/Neun雙陽性細胞比例約為（74.67±3.61）%，Brdu/GFAP雙陽性細胞比例約為（38.83±3.36）%，與缺血再灌注組和假刺激組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均＞0.05）（表1，圖3）。

表1 各組大鼠Brdu陽性細胞計數(shù)及缺血側(cè)皮質(zhì)Brdu/Neun和Brdu/GFAP雙陽性細胞表達比較 （±，=6）

表1 各組大鼠Brdu陽性細胞計數(shù)及缺血側(cè)皮質(zhì)Brdu/Neun和Brdu/GFAP雙陽性細胞表達比較 （±，=6）

注：與假手術(shù)組比較，#＜0.01；與缺血再灌注組比較，*＜0.01

組別 Brdu陽性細胞SVZ區(qū)48 h SVZ區(qū)1周 皮質(zhì)區(qū)4周Brdu/Neun陽性細胞（%） Brdu/GFAP陽性細胞（%）電刺激組 43.67±1.63#* 47.67±2.34#* 57.17±2.4#* 74.67±3.61 38.83±3.36假刺激組 36.5±2.35# 41.83±2.14# 45.83±2.14# 76.17±4.95 36.83±3.54缺血再灌注組 37.67±1.97# 41.17±2.94# 46.83±2.48# 71.00±5.45 35.67±2.66假手術(shù)組 15.5±1.52 15.5±1.52 6.5±1.83 71.76±5.82 36.59±2.94

圖1 大鼠缺血側(cè)SVZ區(qū)Brdu陽性NSC表達（免疫組化；標尺：75μm）

圖2 大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)Brdu陽性新生細胞（免疫組化；標尺：75μm）

圖3 大鼠缺血側(cè)皮質(zhì)NSC的分化（免疫熒光雙標染色；標尺：50μm）

3 討論

腦梗死具有很高的致殘率，是嚴重危害人體健康的一種疾病，人們一直希望能夠找到一種理想的修復(fù)缺血受損的腦組織的方法，即新生的神經(jīng)元來替代死亡的神經(jīng)元，修復(fù)受損的神經(jīng)組織，從而使喪失的神經(jīng)功能完全或基本恢復(fù)。近來中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在NSC的發(fā)現(xiàn)為腦梗死的治療帶來了新的希望。

Altman等［9］于1965年首次發(fā)現(xiàn)在成年哺乳動物腦內(nèi)某些區(qū)域不斷出現(xiàn)新的神經(jīng)元，這些神經(jīng)元被認為來源于干細胞群。后來Reynolds等［10］于1992年在成年鼠紋狀體分離到NSC，證實源于成年腦內(nèi)的NSC可通過體外擴增獲得，且這些細胞具有自我更新和分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的能力。各種病理條件下，如腦缺血［11］、腦外傷［12］等，均可促進內(nèi)源性NSC增殖，但由于SVZ區(qū)NSC增殖、向病灶區(qū)遷移、存活及分化能力有限等原因，其修復(fù)功能仍不甚理想。作者前期研究表明，電刺激嗅球能促進正常大鼠SVZ區(qū)NSC增殖和遷移；本研究中對腦缺血再灌注大鼠進行嗅球電刺激，進一步發(fā)現(xiàn)腦缺血再灌注后48 h及1周，電刺激組大鼠SVZ區(qū)Brdu陽性細胞數(shù)較缺血再灌注組明顯增多，表明電刺激嗅球也能促進腦缺血大鼠內(nèi)源性NSC增殖。腦缺血后內(nèi)源性NSC激活可能與某些細胞因子、營養(yǎng)因子的自分泌或旁分泌有關(guān)，特別是有絲分裂原物質(zhì)如表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等的釋放。Lin等［13］的研究結(jié)果顯示，腦缺血再灌注后海馬部位b FGF m RNA于缺血后60 min開始增高，持續(xù)2周，表達的時間規(guī)律與海馬齒狀回的NSC增殖程度基本一致。Leker等［14］對局灶性腦缺血大鼠進行了轉(zhuǎn)染bFGF的腺病毒干預(yù)，發(fā)現(xiàn)干預(yù)組NSC增殖較正常對照組明顯增強，神經(jīng)功能恢復(fù)更為明顯。Nakatomi等［8］還發(fā)現(xiàn)，向腦缺血大鼠側(cè)腦室內(nèi)注入神經(jīng)生長因子可顯著促進內(nèi)源性NSC增殖。本研究結(jié)果顯示，電刺激嗅球可促進NSC的增殖，推測這可能與電刺激嗅球誘導(dǎo)腦內(nèi)某些上述活性因子的表達升高有關(guān)。

另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，大鼠腦缺血再灌注后4周，缺血皮質(zhì)周圍存在大量Brdu陽性細胞，且電刺激組Brdu陽性細胞數(shù)量與缺血再灌注組比較增多，表明電刺激嗅球也可能促進SVZ區(qū)NSC向缺血區(qū)遷移，增加缺血區(qū)皮質(zhì)NSC數(shù)量，從而參與缺血后的損傷修復(fù)作用。熒光雙標染色顯示假手術(shù)組和電刺激組Brdu陽性細胞大部分同時表達Neun，少部分同時表達GFAP，表明缺血誘導(dǎo)的NSC主要分化為神經(jīng)元，但兩組中NSC分化為神經(jīng)元的比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示電刺激嗅球可能不影響NSC的分化。NSC定向遷移的機制十分復(fù)雜，神經(jīng)前體細胞的遷移類似于“阿米巴”運動，以正切和放射狀兩種方式遷徙［15］。多唾液酸-神經(jīng)細胞黏附分子（polysialylated neural celladhesion molecule，PSA-NCAM）是一種介導(dǎo)細胞間黏附和識別的糖蛋白，多唾液酸的修飾可顯著降低NCAM的黏附，增加細胞之間相互排斥的能力，遷徙細胞表面表達的NCAM可與膠質(zhì)細胞形成特定的放射狀纖維管狀結(jié)構(gòu)，指引細胞遷移，因此推測PSA-NCAM對SVZ的遷移具有重要的作用。嗅球與大腦皮層有廣泛的纖維聯(lián)系，電刺激嗅球可能可促進缺血皮質(zhì)PSA-NCAM等分子的表達，從而促進NSC向病灶區(qū)定向遷移，其具體機制仍有待于更深入的研究和證實。

總之，本研究結(jié)果顯示，電刺激嗅球有可能促進腦缺血再灌注大鼠SVZ區(qū)NSC增殖，增加缺血皮質(zhì)新生干細胞數(shù)量，可能促進SVZ區(qū)NSC向缺血皮質(zhì)遷移，從而參與缺血損傷后的神經(jīng)修復(fù)作用，而且新生NSC的分化功能不受影響，其具體機制尚有待于進一步研究。

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QIN Xin-yue，Email：qinxy20011@sina.com

Objective To investigate the effect of olfactory bulb（OB）electrical stimulation on neurogenesis of rats suffered from ischemia/reperfusion injury.Methods Healthy adult female Sprague-Dawley（SD）rats were randomly divided into the sham-operation group，the ischemia/reperfusion（I/R）group，the stimulation group，and the sham-stimulation group.Cerebral ischemia/reperfusion in the I/R group and the stimulation/sham-stimulation group was induced by intraluminal right middle cerebral artery occlusion（MCAO）. Arteries in the sham-operation group were dissected but not occluded.Electrical stimulation was performed via a bipolar electrode implanted in the right OB of rats，and rats in the sham-stimulation group were implanted electrodes but not stimulated.Bromodeoxyuridine（Brdu）was injected intraperitoneally to label endogenous neural stem cells（NSC）.The animals in all groups were sacrificed at 48 h，1 week after corresponding intervention.Immunohistochemistry staining was used to detect the proliferation of NSC in subventricular zone（SVZ）.After injection with Brdu，the rats were sacrificed 4 weeks after stimulation.Fluorescent double staining for Brdu/Neuronal nuclei antigen（Neun）and Brdu/Glial fibrillary acidic protein（GFAP）was performed in thebrain slices finally.Results In SVZ of rats，Brdu-positive cells began to increase 48 h after ischemia in the I/R group and the stimulation group.There were more Brdu positive cells in the stimulation group than the I/R group at 48 h（43.67±1.63，37.67±1.97；＜0.05）and 7 d（47.67±2.34，41.17±2.94；＜0.01）after ischemia/reperfusion in rats.Four weeks after stimulation，the Brdu-positive cells were significantly increased in cortex of the stimulation group（57.17±2.4）than I/R group（46.83±2.48）and sham-operation group（45.83 ±2.14）（＜0.01）.Fluorescence double staining showed that stimulation of OB had no effect on the differentiation of NSC into neurons or gliocytes（＞0.05）.Conclusions These observations demonstrated that electrical stimulation of OB might enhance proliferation of NSCin SVZ and promote migration of NSC to ischemic cortex，but OB stimulation has no effect on differentiation of NSC.

electrical stimulation；ischemia/reperfusion；neurogenesis，rats

R743.3；R33

：A

：1006-2963（2014）06-0414-05

2014-06-23）

（本文編輯：鄒晨雙）

10.3969/j.issn.1006-2963.2014.06.009

222002連云港市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（張廣慧、吳方榮、何明利、郭振委）；400016重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（秦新月）

秦新月，Email：qinxy20011@sina.com