孫勇，李運(yùn)輝，張鵬

(萊蕪市人民醫(yī)院普外科，山東萊蕪 271100)

·論著·

BRCA1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)抑癌作用研究

孫勇，李運(yùn)輝，張鵬

(萊蕪市人民醫(yī)院普外科，山東萊蕪 271100)

目的研究BRCA1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)在乳腺癌組織中的抑癌作用。方法甲基化PCR法檢測(cè)60例乳腺癌患者的癌組織、癌旁組織和20例乳腺良性組織中BRCA1-mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)，以及評(píng)價(jià)其作用。結(jié)果癌組織和癌旁組織中BRCA1-mRNA的表達(dá)水平分別為(0.612 2±0.234 4)、(0.687 5±0.257 6)，在癌組織、癌旁組織、良性腫瘤組織中BRCA1表達(dá)的甲基化率分別為70.0%、48.3%、35.0%。癌組織的甲基化率明顯的高于癌旁組織和良性腫瘤組織；經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級(jí)在BRCA1-mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化中的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，絕經(jīng)、組織分型在BRCA1-mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化中的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。結(jié)論BRCA1-mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，并且與組織分期和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

乳腺癌；BRCA1基因表達(dá)；啟動(dòng)子區(qū)；甲基化

乳腺癌是臨床上常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一，乳腺癌的發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段的綜合過(guò)程。目前，臨床上對(duì)乳腺癌的研究報(bào)道較多，對(duì)其病因的研究已經(jīng)有一定的了解[1]。BRCA1是卵巢癌和乳腺癌特異性抑癌基因，其在細(xì)胞周期傳導(dǎo)信號(hào)的過(guò)程中具有十分重要的作用。在正常的卵巢組織和乳腺中該基因會(huì)正常表達(dá)，而在卵巢癌或乳腺癌中則會(huì)缺失或下降[7]。本文旨在研究BRCA1-mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)在乳腺癌組織中的抑癌作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取我院普外科2007年6月至2013年6月住院的60例乳腺癌患者，年齡35～75歲，平均(55±11.797)歲。經(jīng)病理學(xué)診斷，侵入性導(dǎo)管癌40例、鱗狀上皮癌10例、浸潤(rùn)小葉癌5例、葉囊性肉瘤5例，同時(shí)選取我院乳腺檢查正常的乳腺良性組織20例。用電泳法提取乳腺癌患者血液組織中DNA，用分光光度儀定量后，在-20℃保存待用。

1.2 診斷及排除標(biāo)準(zhǔn)所有患者均符合乳腺癌篩查規(guī)范化診斷標(biāo)準(zhǔn)和操作方法的乳腺癌臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)以及符合倫理道德，家屬或者患者簽署了知情同意書等。排除標(biāo)準(zhǔn)[3]：①患有其他重要的器官衰竭性疾病，或者內(nèi)分泌性疾病，比如肝腎衰竭、糖尿病等；②正在服用可能影響研究效果和結(jié)局藥物的患者；③具有嚴(yán)重神經(jīng)精神疾病的、意識(shí)不清不能參加隨訪的患者。剔除標(biāo)準(zhǔn)[4]：①凡對(duì)試驗(yàn)的調(diào)查研究不依從、不配合、容易產(chǎn)生失訪的以及拒絕參加試驗(yàn)者都應(yīng)剔除；②試驗(yàn)過(guò)程中不按照規(guī)定進(jìn)行檢查，或者在調(diào)查過(guò)程中采用了其他治療措施的可能影響試驗(yàn)結(jié)果的；③在治療過(guò)程中病情突然加重不能再參加試驗(yàn)的。

1.3 研究方法

1.3.1 BRCA1-mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)(1)RNA提取：選擇FASTAGEN-RNAFAST200試劑盒(由飛捷生物公司生產(chǎn))提取組織中的RNA，利用紫外分光光度法對(duì)RNA的純度和濃度進(jìn)行測(cè)定，放在溫度為-20℃的恒溫箱里保存。（2）RT-PCR的檢測(cè)：對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。用半定量PCR擴(kuò)增cDNA，PCR是25 L反應(yīng)體系，反應(yīng)條件包括：①內(nèi)參照94℃4 min，72℃30 s，55℃30 s，共循環(huán)30次。②BRCIA：94℃5 min，52℃30 s，72℃30 s，55℃30 s，72℃7 min，共循環(huán)30次。

1.3.2 BRCA1基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)(1) DNA的提?。翰捎梅?氯仿手工法提取組織中的DNA，利用紫外分光光度法對(duì)RNA的純度和濃度進(jìn)行測(cè)定，放在溫度為-20℃的恒溫箱里保存。(2)基因組DNA的亞硫酸氫鈉修飾：將DNA 2 μl置于1.5 ml EP管中，稀釋至50 μl，加苯二酚10 mmol/L和亞硫酸氫鈉3.6 mol/L，容易避光、均勻混合，并加200 μl石蠟油，避免氧化和水分蒸發(fā)，在50℃的條件下，水浴16 h。

1.4 觀察指標(biāo)BRCA1-mRNA表達(dá)在各種細(xì)胞中表達(dá)水平；BRCA1-mRNA表達(dá)的下降率；甲基化率。在不同的組織分級(jí)、有無(wú)轉(zhuǎn)移、絕經(jīng)、激素受體(ER)、孕激素受體(PR)中BRCA1-mRNA表達(dá)的差異情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，對(duì)于符合正態(tài)分布，方差齊性的資料應(yīng)用兩組之間的t檢驗(yàn)，對(duì)于符合條件的多個(gè)均值之間的比較應(yīng)用方差分析；計(jì)數(shù)資料采用百分比表示，應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，χ2檢驗(yàn)三者之間有意義后，再采用SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩之間的比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05，當(dāng)P＜0.05時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BRCA1-mRNA在不同細(xì)胞中的表達(dá)經(jīng)過(guò)PCR分析后癌組織和癌旁組織中BRCA1-mRNA的表達(dá)水平分別是(0.612 2±0.234 4)、(0.687 5±0.257 6)，而在乳腺良性腫瘤的組織中表達(dá)水平是(0.996 5±0.045 0)，明顯高于癌組織和癌旁組織，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)后，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 BRCA1-mRNA在癌組織、癌旁組織、良性腫瘤的表達(dá)水平

2.2 三種乳腺組織BRCA1表達(dá)的甲基化率比較癌組織、癌旁組織、良性腫瘤組織BRCA1表達(dá)的甲基化率分別為70.0%、48.3%、35.0%。癌組織的甲基化率明顯高于癌旁組織和良性腫瘤組織。三者甲基化率經(jīng)過(guò)χ2檢驗(yàn)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.766，P=0.008)，再經(jīng)過(guò)兩兩比較，癌組織與癌旁組織之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.829，P=0.016)，而癌組織和良性組織之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.742，P= 0.005)，見(jiàn)表1。

表1 三種乳腺組織中BRCA1表達(dá)的甲基化比較（例）

2.3 乳腺癌組織中BRCA1-mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)與病理指標(biāo)的相關(guān)性經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級(jí)在BRCA1-mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化中的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，絕經(jīng)、組織分型在BRCA1-mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化中的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見(jiàn)表2。

表2 乳腺癌組織中BRCA1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與病理指標(biāo)的相關(guān)性

3 討論

乳腺癌是乳腺上皮組織發(fā)生的惡性腫瘤，超過(guò)了99%的乳腺癌患者為女性。目前臨床上對(duì)乳腺癌的發(fā)病機(jī)制研究結(jié)果尚未明確，有研究表明，乳腺癌的發(fā)生具有一定的規(guī)律性，其中，乳腺癌家族史、月經(jīng)初潮過(guò)早等是乳腺癌發(fā)病的高危因素[5]。通常情況下乳腺癌沒(méi)有明顯的臨床表現(xiàn)，不容易引起患者的重視，往往在乳腺癌篩查或體檢的時(shí)候才會(huì)發(fā)現(xiàn)。BRCA1基因是卵巢癌和乳腺癌特異性的一種抗癌基因，基因的改變和卵巢癌、乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌組織中，關(guān)于BRCA1基因突變的報(bào)道較少，基因的雜合性丟失頻率也較低。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外大部分研究發(fā)現(xiàn)[6]，在卵巢癌或乳腺癌中BRCA1有較高的甲基化頻率，且該基因的異?；淖冎辉诼殉舶┖腿橄侔┲杏凶兓诟伟?、結(jié)腸癌、食管癌以及白血病等惡性腫瘤中均不發(fā)生甲基化。Deshmukh等[7]用甲基化特異性檢測(cè)法MSP對(duì)乳腺癌的引流液進(jìn)行檢查，結(jié)果顯示BRCA1啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化的頻率達(dá)到了39%。另有謝飛等[8]對(duì)20例乳腺癌患者BRCA1中CPG島中的30個(gè)CPG位點(diǎn)的基因轉(zhuǎn)錄水平和甲基化情況進(jìn)行研究，結(jié)果證實(shí)CPG島甲基化和抑制基因轉(zhuǎn)錄有著密切的關(guān)系。

BRCA1基因在正常卵巢組織和乳腺癌上皮組織中高表達(dá)，臨床上對(duì)BRCA1-mRNA表達(dá)水平降低的原因主要以基因突變、啟動(dòng)子區(qū)甲基化以及雜合性丟失。目前，國(guó)內(nèi)用RT-PCR檢測(cè)乳腺癌組織中的BRCA1-mRNA表達(dá)水平尚沒(méi)有明確報(bào)道。湯靚等[9]用RT-PCR檢測(cè)法表明，BRCA1-mRNA在乳腺癌上皮組織中及癌旁正常組織中的表達(dá)均明顯低于乳腺良性組織中的表達(dá)。在組織分級(jí)中，分級(jí)越低BRCA1-mRNA的表達(dá)下降率越低，而分級(jí)率越高其表達(dá)率也隨之升高，其中T3的下降率達(dá)到了60%。此外，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中該基因的表達(dá)下降率為39%[10]，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中，BRCA1-mRNA的表達(dá)下降率為28%，表明BRCA1-mRNA的表達(dá)下降與有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。但是BRCA1-mRNA的表達(dá)與絕經(jīng)、P53，腫瘤組織分型等無(wú)關(guān)[10]。

本研究通過(guò)對(duì)60例乳腺癌組織中BRCA1-mRNA組織中BRCA1和mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，癌組織和癌旁組織中BRCA1-mRNA的表達(dá)水平分別是(0.612 2±0.234 4)、(0.687 5±0.257 6)，癌組織、癌旁組織、良性腫瘤組織BRCA1表達(dá)的甲基化率分別為70.0%、48.3%、 35.0%。癌旁組織的甲基化鋁明顯的高于癌旁組織和良性腫瘤組織；經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分級(jí)在BRCA1-mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，絕經(jīng)、組織分型在BRCA1-mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果提示BRCA1-mRNA的表達(dá)水平在正常乳腺癌組織中沒(méi)有異常變化，而在乳腺癌組織中明顯降低，且與淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移和組織分型相關(guān)。

對(duì)BRCA1-mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)在乳腺癌組織中抑癌作用的研究，有助于對(duì)乳腺癌中抑癌基因失活的遺傳學(xué)機(jī)制進(jìn)行充分闡明。DNA甲基化的改變具有乳腺癌腫瘤細(xì)胞的特異性，甲基化的表型在惡性表型出現(xiàn)之前，因此，在確診腫瘤之前，可以對(duì)甲基化陽(yáng)性的抑癌基因進(jìn)行檢測(cè)。

綜上所述，BRCA1-mRNA表達(dá)及啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，并且與組織分期和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這一結(jié)果對(duì)乳腺癌的臨床診斷的治療具有重要參考價(jià)值。

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Effect of BRCA1 promoter methylation on tumor inhibition.

SUN Yong,LI Yun-hui,ZHANG Peng.
Department of General Surgery,Laiwu People's Hospital,Laiwu 271100,Shandong,CHINA

>ObjectiveTo study the effect of BRCA1 promoter methylation on tumor inhibition in breast cancer tissue.MethodsBRCA1-mRNA expression and promoter methylation were detected by methylation PCR in 60 cases of breast cancer tissue,pericarcinous tissue,and 20 cases of benign mammary gland tissue.Meanwhile,its effect was evaluated.ResultsThe expression of BRCA1-mRNA levels in the cancer tissue and pericarcinous tissue were(0.612 2±0.234 4)and(0.234 4±0.257 6),respectively.The methylation rate in cancer tissure,pericarcinous tissue and benign tumor tissue were 70.0%,48.3%and 35.0%,respectively.And the methylation rate in cancer tissue was significantly higher than those in pericarcinous tissue and benign tumor tissue.The differences of lymph node matastasis and tumor classification in BRCA1 mRNA expression and promoter methylation were statistically significant (P＜0.05),while there was no difference in menopause and histological stages in BRCA1 mRNA expression and promoter region methylation(P＞0.05).ConclusionBRCA1 mRNA expression and promoter region methylation status play an important role in the development of breast cancer,and are closely related to the histological stages and lymph node metastasis.

Breast cancer;BRCA1 gene expression;The promoter region;Methylation

R737.9

A

1003—6350（2014）12—1717—03

2013-12-18)

山東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：009ZRB14999)

孫勇。E-mail：fl81955664703@163.com