張守展，佘鵬飛，夏昊云

（南京理工大學(xué)泰州科技學(xué)院，江蘇泰州225300）

蠶沙中葉綠素的超聲波輔助提取研究

張守展，佘鵬飛，夏昊云

（南京理工大學(xué)泰州科技學(xué)院，江蘇泰州225300）

養(yǎng)蠶業(yè)在中國具有悠久的歷史。蠶沙作為養(yǎng)蠶業(yè)的副產(chǎn)物，資源閑置嚴(yán)重，給環(huán)境帶來巨大壓力。從蠶沙中提取葉綠素，用于醫(yī)藥、保健等領(lǐng)域，將提高蠶沙的經(jīng)濟(jì)效益。以蠶沙為原料，丙酮-乙醇混合溶劑為提取劑，采用超聲波輔助法對(duì)蠶沙中葉綠素的提取方法進(jìn)行了研究。

蠶沙；葉綠素；超聲波；丙酮；乙醇

蠶沙是指蠶糞、蠶的蛻皮、香桑葉、糠草等物質(zhì)的混合物，而可以利用的部分主要是蠶糞[1]。其組成主要有碳水化合物、粗纖維、粗蛋白、粗灰分、粗脂肪等，并且其中含有豐富的葉綠素、類胡蘿卜素、葉蛋白、果膠、植物醇等[2]。每年蠶沙產(chǎn)量都很大，但由于利用重視度不高，資源閑置相當(dāng)嚴(yán)重，蠶沙隨意堆棄，嚴(yán)重污染環(huán)境，這將對(duì)整個(gè)養(yǎng)蠶產(chǎn)業(yè)的長期發(fā)展造成影響。因此，對(duì)蠶沙綜合利用，變廢為寶，既可以解決蠶沙對(duì)環(huán)境的影響，還能夠增加蠶沙的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。提高蠶沙經(jīng)濟(jì)價(jià)值的方法有很多，提取葉綠素就是其中之一。

目前，葉綠素的提取多采用溶劑提取法[3]。它是根據(jù)原料中各成分在溶劑中的溶解性質(zhì)，借助溶劑滲透作用和溶質(zhì)擴(kuò)散作用，使有效成分從原料表面或是組織內(nèi)部向溶劑中轉(zhuǎn)移的傳質(zhì)過程。為高效、快速地將葉綠素從蠶沙中提取出來，選擇合適溶劑至關(guān)重要。葉綠素的極性極弱，屬于脂溶性物質(zhì)，只溶于有機(jī)物不溶于無機(jī)溶劑。根據(jù)“相似相容”原理，可知葉綠素易溶于丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑，而在水中幾乎不溶?；谝陨峡紤]，實(shí)驗(yàn)過程中提取蠶沙中葉綠素可用的有機(jī)溶劑有丙酮、乙醇、石油醚、正己烷及其混合物等。

超聲波作為一種新型提取技術(shù)，在天然物的物質(zhì)提取過程中已經(jīng)嶄露頭角[4]。而且超聲波本身在化學(xué)領(lǐng)域已經(jīng)有了廣泛的應(yīng)用，將其應(yīng)用于各種分離也顯示了許多優(yōu)越性。其中，超聲波輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的空化效應(yīng)、強(qiáng)烈擾動(dòng)效應(yīng)、高加速度、擊碎和攪拌效應(yīng)等多級(jí)效應(yīng)，增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，促進(jìn)提取的進(jìn)行。對(duì)于超聲波優(yōu)化工藝來說，超聲波強(qiáng)度、超聲功率及超聲時(shí)間是影響目標(biāo)成分提取率的重要因素。

本研究選取超聲波輔助混合溶劑提取蠶沙中葉綠素，對(duì)傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了改進(jìn)，提高了葉綠素的提取率。實(shí)驗(yàn)過程中，考察了不同溶劑對(duì)葉綠素的提取率，通過正交試驗(yàn)，考察了在不同提取時(shí)間、提取溫度、固液比和提取次數(shù)對(duì)蠶沙中葉綠素提取率的影響，確定了超聲波輔助提取蠶沙中葉綠素的最佳工藝條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此工藝降低了提取溶劑的揮發(fā)性和提取溫度，提高了葉綠素的提取率。因此，利用超聲波輔助提取蠶沙中葉綠素的工藝具有廣泛的應(yīng)用前景。

1 蠶沙中葉綠素含量和提取溶劑的選擇

1.1 蠶沙中葉綠素含量的測定

將蠶沙風(fēng)干除雜，準(zhǔn)確稱取蠶沙各4g共8組，分別加入14mL蒸餾水軟化20h。以丙酮為提取溶劑，提取至提取液接近于無色，將各次的提取液及蠶沙放入40mL棕色容量瓶中，并用提取溶劑進(jìn)行定容。容量瓶避光保存2h，進(jìn)一步提取蠶沙中葉綠素。將提取液混勻后，離心分離，移取上清液，稀釋10倍，在644nm，663nm波長下測定其吸光度，根據(jù)提取液中葉綠素總濃度，計(jì)算蠶沙中葉綠素總含量（%），利用Amon公式[4]。

葉綠素a濃度/mg·L-1：

ρa(bǔ)=12.7A1-2.69A2=4.193

葉綠素b濃度/mg·L-1：

ρb=22.9A2-4.68A1=3.477

葉綠素總濃度/mg·L-1：

ρa(bǔ)+b=（ρa(bǔ)+ρb）×稀釋倍數(shù)

式中：A1——葉綠素a在663nm波長下的吸光度；A2——葉綠素a在644nm波長下的吸光度。

式中：ω——葉綠素含量，%。

經(jīng)計(jì)算蠶沙中葉綠素含量為0.767%，遠(yuǎn)高于植物鮮葉中葉綠素的含量（0.3%）。

1.2 提取溶劑的選擇

選取不同的提取溶劑 8種（A、B、C、D、E、F、G、H），準(zhǔn)確稱量蠶沙4g共8組，在40℃，固液比1∶4（g∶mL），提取60min。

在實(shí)際過程中，以吸光度A代替濃度C來計(jì)算葉綠素的提取率：

假設(shè)將蠶沙中葉綠素提取至幾乎無色時(shí)提取次數(shù)為k次，合并前i次的提取溶劑，則前i次的葉綠素的提取率為：

在相同的提取條件下，8種不同溶劑的提取率如圖1所示。

圖1 不同提取溶劑所得提取率

由圖1可知，在相同提取條件下，丙酮-乙醇（V∶V=1∶1）混合溶劑的提取率最高，因此，選擇其作為提取溶劑用于蠶沙中葉綠素的提取。

2 提取蠶沙中葉綠素的影響因素研究

通過選取提取時(shí)間、提取溫度、固液比、超聲功率、超聲時(shí)間及提取次數(shù)六因素建立正交實(shí)驗(yàn)L24（46），優(yōu)化超聲提取蠶沙中葉綠素的工藝條件，因素水平見表1，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表1 因素水平表

由極差分析可知，6種因素對(duì)超聲波輔助提取葉綠素的影響大小依次為：提取次數(shù)＞固液比＞提取時(shí)間＞提取溫度＞超聲時(shí)間＞超聲功率，最優(yōu)條件為：提取次數(shù)4次，固液比1∶4，提取時(shí)間60min，提取溫度40℃，超聲時(shí)間30min，超聲功率80W。

3 超聲波輔助提取和傳統(tǒng)恒溫水浴提取法對(duì)比試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取質(zhì)量為4.0g蠶沙6份，分為2組，以丙酮-乙醇為混合溶劑，在上述最優(yōu)提取次數(shù)、固液比、提取時(shí)間、提取溫度的條件下，第一組加以超聲波輔助提取，平行測定3次；第二組采用恒溫水浴提取，平行測定3次。得第一組的平均提取率η1=89.01%；第二組平均提取率η1=77.34%，所以在同等水平下，超聲波的加速介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)運(yùn)到，空化作用和超聲波的振動(dòng)勻化等作用，提高了葉綠素的提取率。

4 結(jié)束語

對(duì)于大量閑置的養(yǎng)蠶業(yè)副產(chǎn)物蠶沙，僅僅作為飼料或者肥料，并未達(dá)到“物盡其用”。本文選取丙酮-乙醇為混合溶劑加以超聲波輔助提取蠶沙中的葉綠素，對(duì)傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝進(jìn)行了改進(jìn)，顯著提高了葉綠素的提取率和生產(chǎn)工藝的安全性，減少了提取溶劑的揮發(fā)。對(duì)蠶沙進(jìn)行深度加工，變廢為寶，延長產(chǎn)業(yè)鏈，促進(jìn)了蠶區(qū)產(chǎn)業(yè)的協(xié)調(diào)發(fā)展。

表2 交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

[1]張華，李景琳，李傳欣，等.蠶沙綜合利用現(xiàn)狀與前景[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，1994(4):24-26.

[2]徐法君.間接光度法測定植物葉片中葉綠素含量[J].理化檢驗(yàn)-化學(xué)分冊(cè)，2005，41(9)：661-662.

[3] 鄧祥元，沙鵬，高坤，等.不同溶劑提取蠶沙葉綠素效率的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(4)：21331-21332.

[4]王茂田，謝培山，王忠東.天然有機(jī)化合物提取分離與結(jié)構(gòu)鑒定[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004:5-30.

[5] AmonD L.Copperenzymesinisolatedchloioplasts polyphenoloxidase in Betavulgaris[J].PlantPhysiology，1949，24(1):1-15.

Studyonextractionprocessofchlorophyllfromsilkworm excermentbyultrasonic-assistedmethod

ZHANGShouzhan，SHEPengfei，XIAHaoyun
（DepartmentofChemicalEngineering，TaizhouInstituteofScienceandTechnology，NanjingUniversityofScienceandTechnology，Taizhou224300，China）

Plantingmulberriesandraisingsilkworm，whichcanproducemillionsofsilkwormexcrement，hasalong historyinchina，andsilkwormexcrementistheco-productofsericultureoccupation.Butnowdays，mostofthe silkwormexcrementisoptionallydiscarded，anditbringsahugepressuretotheenviroment.Theultrasonic-assisted methodofchlorophyllhasbeeninvestigatedwithsilkwormexcrementasrawmaterialandacetone-ethanolasextraction solvent.

silkwormexcrement;chlorophyll;ultrasonic-assistedextraction;acetone;ethanol

X71

A

1674-0912（2014）02-0030-03

2014-01-07）

江蘇省高等學(xué)校大學(xué)生實(shí)踐創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201313842014Y）

張守展（1991-），男，江蘇沛縣人，在讀本科生，研究方向：廢棄物的再生和利用。