王林林，王 兵，于金寶，張立亞，王玉亮，崔堯麗，王勇強

(1天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津300070;2天津市第一中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科天津市急救醫(yī)學(xué)研究所;3衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學(xué)重點實驗室)

自上世紀(jì)80年代提出腸源性學(xué)說［1］以來，多器官功能障礙綜合征(MODS)的發(fā)病機制得到了進一步解釋，腸系膜淋巴液導(dǎo)致急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(ALI/ARDS)的機制也得到進一步驗證［2］。實驗表明，創(chuàng)傷失血性休克(THS)腸系膜淋巴液能夠?qū)е卵軆?nèi)皮細胞凋亡和壞死［3］。近年來，研究證實在有些情況下細胞壞死也是由基因控制的、有序的過程［4］，這個過程能被 Necrostatin-1(Nec-1)特異性阻斷［5］。Nec-1是細胞程序性壞死的特異性阻滯劑，它能夠特異性結(jié)合細胞程序性壞死傳導(dǎo)通路中的關(guān)鍵酶。2013年3～7月，我們觀察了THS腸系膜淋巴液能否導(dǎo)致血管內(nèi)皮細胞程序性壞死，以及能否被Nec-1阻斷。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級健康成年雄性SD大鼠12只，體質(zhì)量280～320 g，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，許可證號:SCXK-(軍)20070004;飼養(yǎng)于采用明暗各12 h、25℃恒溫的隔離系統(tǒng)動物房內(nèi)，適應(yīng)期至少7 d，實驗前禁食12 h。多導(dǎo)生理記錄儀(美國AD公司)，酶標(biāo)儀(美國伯樂公司)，垂直電泳儀(美國伯樂公司)，凝膠成像分析儀(美國伯樂公司)，移液槍(德國艾本德公司);MTT細胞活性檢驗試劑盒，人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)，二甲基亞砜(DMSO);抗體:鼠抗受體交互體用蛋白(RIP)抗體(1∶2 000，BD 公司)，RIP3(H-43):SC-135170(1∶200，Santa Cruz公司)，Anti-GAPDH單克隆抗體(1∶2 500，EarthOx公司)，羊抗兔 IgG(1∶1 000，Immuno Reagents公司)，羊抗鼠IgG(1∶1 000，Immuno Reagents公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與模型制備 將大鼠隨機分為手術(shù)(T/HS)組與假手術(shù)(T/SS)組，每組6只。T/HS組以戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔麻醉，置于手術(shù)臺，用加熱毯及熱燈保持大鼠肛溫37℃。術(shù)前準(zhǔn)備后行5 cm腹部正中切口，左側(cè)頸內(nèi)動脈插管監(jiān)測動脈血壓，右側(cè)股靜脈插管用于放血及輸血。左旋內(nèi)臟暴露腸系膜淋巴管，硅膠導(dǎo)管插管并于右側(cè)腹壁穿出引入置于冰袋上的無菌離心管，雙層縫合腹部切口。以1 mL/min靜脈血放入含10 U肝素鈉(溶于0.3 mL生理鹽水)的無菌注射器至動脈血壓為30 mmHg，后通過放或注入血維持動脈血壓30～40 mmHg。90 min后以自身血及2倍放血量的林格液復(fù)蘇。T/SS組大鼠僅手術(shù)切開，不放血及輸血。

1.2.2 腸系膜淋巴液收集 自復(fù)蘇開始時收集腸系膜淋巴液，持續(xù)3 h。收集完成后，以1 500 r/min離心15 min去除內(nèi)含細胞。用PBS以1∶1稀釋后，立即－80℃保存?zhèn)溆?。使用時，腸淋巴液終濃度為5%。

1.2.3 腸系膜淋巴液對HUVECs活性及程序性壞死影響的觀察 根據(jù)文獻資料，以HUVECs替代大鼠肺血管內(nèi)皮細胞。取在內(nèi)皮細胞生長培養(yǎng)基中傳代2 ～3 代的 HUVECs，以2 ×104/孔(200 μL)接種與96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h。將細胞分為3組，T/HS、T/SS組分別加入1∶1稀釋的T/HS、T/SS大鼠腸系膜淋巴液，對照組加入20 μL PBS;培養(yǎng)3 h后，應(yīng)用MTT細胞活性檢驗試劑盒檢驗HUVECs活性，并以無細胞的空白孔細胞活性為100%。在5 mL細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細胞，孵育3 h后提取蛋白質(zhì)，應(yīng)用Western blot法檢測程序性壞死的特異性蛋白RIP1和 RIP3。按說明書操作，以目標(biāo)蛋白與GAPDH光密度比值作為RIP1和RIP3表達量。

1.2.4 Nec-1對 THS腸系膜淋巴液處理 HUVECs活性及程序性壞死影響的觀察 將HUVEC以2×104/孔(200 μL)接種96孔細胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h。將細胞分為6組，A(D)、B(E)、C(F)組分別加入20 μL PBS、0.2 μL 濃度為 100 mmol/L Nec-1、溶媒DMSO預(yù)處理1 h，D、E、F組分別加入1∶1稀釋的T/HS大鼠腸系膜淋巴液。孵育3 h后，觀察細胞活性及細胞程序性壞死情況，方法同1.2.3。

1.2.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析(ANOVA)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腸系膜淋巴液對HUVECs活性及程序性壞死的影響 各組HUVECs活性及 RIP1、RIP3相對表達量比較，見表1、圖1。

2.2 Nec-1對THS腸系膜淋巴液處理HUVECs活性及程序性壞死的影響 各組HUVECs活性及RIP1、RIP3相對表達量比較，見表2、圖2。

3 討論

隨著上個世紀(jì)醫(yī)學(xué)科技的發(fā)展，單一器官、系統(tǒng)衰竭的病死率已大大降低，但隨之而來的是先期存活患者發(fā)生MODS的幾率大大增加［6］。創(chuàng)傷是導(dǎo)致40歲以下患者死亡的首要原因，在外科重癥監(jiān)護病房中MODS占到死亡原因的50% ～80%［7］，但是嚴(yán)重創(chuàng)傷引起遠隔器官的損傷機制還不甚明了。在MODS產(chǎn)生機制的眾多學(xué)說中，腸源性學(xué)說占有重要地位。Glenn等［8］首先提出，T/HS導(dǎo)致內(nèi)臟低灌注產(chǎn)生的有害因子通過淋巴管進入血液循環(huán)。此學(xué)說經(jīng)過 Moore實驗室［9］和 Deitch 等［10］的發(fā)展，認(rèn)為導(dǎo)致T/HS后終末器官損傷的因子是由缺血的腸產(chǎn)生，并經(jīng)腸系膜淋巴管進入腹腔淋巴管，然后經(jīng)胸導(dǎo)管經(jīng)鎖骨下靜脈入血;肺臟首先接受這些血液，因而肺常常先于其他器官出現(xiàn)損傷，并且通過結(jié)扎腸淋巴管能夠減輕肺臟的損傷。因而，獲取T/HS腸系膜淋巴液，使我們可以在體外條件下研究其可能的細胞損傷機制。研究發(fā)現(xiàn)，T/HS腸系膜淋巴液能夠增加血管內(nèi)皮細胞通透性［11］、上調(diào)內(nèi)皮細胞黏附因子的表達［12］、活化中性粒細胞［13］。但是，大量的實驗并沒有明確其中的毒性物質(zhì)，包括細菌或其產(chǎn)物、內(nèi)毒素［14］、腫瘤壞死因子及其他細胞因子，均不存在于其中。最新研究認(rèn)為，T/HS腸淋巴含有的游離脂肪酸是重要的內(nèi)皮細胞毒素，其中亞油酸毒性最強［15］。

表1 各組HUVECs活性及RIP1、RIP3相對表達量比較(±s)

表1 各組HUVECs活性及RIP1、RIP3相對表達量比較(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.01;與 T/SS組比較，#P ＜0.01

RIP1 RIP3 T/HS 組 17.00 ±4.31*# 0.52 ±0.14*# 0.64 ±0.25*#組別 細胞活性(%)T/SS 組 92.09 ±5.84 0.17 ±0.01 0.18 ±0.04對照組96.82 ±2.17 0.15 ±0.02 0.17 ±0.03

圖1 腸系膜淋巴液對HUVECs中RIP1、RIP3表達的影響

表2 Nec-1對各組HUVECs活性及RIP1、RIP3相對表達量的影響(±s)

表2 Nec-1對各組HUVECs活性及RIP1、RIP3相對表達量的影響(±s)

注:與其他各組比較，#P ＜0.01

RIP1 RIP3 A組組別 細胞活性(%)94.62 ±3.38 0.15 ±0.03 0.19 ±0.03 B 組 92.12 ±5.46 0.17 ±0.04 0.17 ±0.05 C 組 92.55 ±4.27 0.16 ±0.02 0.21 ±0.07 D 組 18.61 ±3.00 0.47 ±0.12 0.62 ±0.22 E 組 31.97 ±7.51# 0.36 ±0.14# 0.40 ±0.17#F組20.22 ±5.35 0.51 ±0.09 0.64 ±0.19

圖2 Nec-1對THS腸系膜淋巴液處理HUVECs中RIP1、RIP3表達的影響

肺血管內(nèi)皮損傷是T/HS肺損傷發(fā)生的重要病理過程，其損傷包括凋亡與壞死［3］。本研究目的在于觀察T/HS腸系膜淋巴液導(dǎo)致的血管內(nèi)皮細胞壞死是否存在程序性壞死。程序性壞死是新近發(fā)現(xiàn)的一種由基因控制的、有序的過程［5］，其主要發(fā)生機制［16］是“死亡受體—RIP—線粒體—氧自由基通路”。死亡受體活化后迅速形成聚體，隨后RIP1與之結(jié)合形成復(fù)合物，內(nèi)吞作用使得RIP1進入細胞，此時RIP1與死亡受體解離并與RIP3形成復(fù)合物Ⅱ。復(fù)合物Ⅱ能夠招募Caspase-8，Caspase-8聚集引起復(fù)合物Ⅱ降解，從而進入死亡受體誘導(dǎo)的凋亡通路，當(dāng)Caspase-8不足以降解復(fù)合物Ⅱ時，RIP3活化并作用于能量代謝相關(guān)的酶，從而大量的氧自由基產(chǎn)生損傷細胞，致使細胞壞死。RIP1與RIP3在其中起重要作用，Nec-1能夠特異性阻斷RIP1與RIP3的相互磷酸化，從而阻斷復(fù)合物Ⅱ的形成及信號的向下傳導(dǎo)［17］。

參照以往的實驗，我們以HUVECs替代肺血管內(nèi)皮細胞，使用終濃度為5%的腸系膜淋巴液以達到其在大鼠血液中的濃度［18］，并應(yīng)用MTT細胞活性試劑盒檢測細胞活性及Western blot法檢測程序性壞死特異性蛋白RIP1、RIP3相對含量。我們首先對比了T/HS及T/SS腸系膜淋巴液對HUVECs程序性壞死的影響。結(jié)果表明，T/HS腸系膜淋巴液對內(nèi)皮細胞的毒性明顯高于T/SS腸系膜淋巴液，并使HUVECs中程序性壞死特異性蛋白RIP1和RIP3相對含量明顯升高。隨后應(yīng)用特異性抑制劑Nec-1觀察其對HUVECs程序性壞死的影響。結(jié)果顯示，加入Nec-1的E組HUVECs活性顯著高于沒有加入的D、F組，并且RIP1、RIP3的相對含量明顯低于 D、F組;同時，與 A、B、C 組比較，E 組 HUVECs活性顯著降低、RIP1和RIP3相對含量顯著升高。說明Nec-1能夠部分抑制T/HS腸系膜淋巴液對HUVEC程序性壞死的作用。

綜上所述，T/HS大鼠腸系膜淋巴液能夠引起血管內(nèi)皮細胞程序性壞死，在血管內(nèi)皮細胞損傷中占有一定比例;Nec-1能夠抑制程序性壞死的發(fā)生，減輕血管內(nèi)皮細胞的損傷。血管內(nèi)皮細胞的損傷及壞死造成的血管通透性增加是ALI/ARDS的重要病理基礎(chǔ)，那么Nec-1應(yīng)該能起到減輕ALI/ARDS的效果，然而體內(nèi)實驗與體外實驗不是等同的，至于在體內(nèi)實驗是否有同樣的效果，需要更多的實驗進一步驗證。T/HS大鼠腸系膜淋巴液能夠引起血管內(nèi)皮細胞程序性壞死的機制，以及與凋亡之間的關(guān)系也需要進一步的研究。

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