大鼠腸淋巴液引流方法的改進

陳 杰，陳 淼

(遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，貴州 遵義 563099)

研究證實，腸道作為全身炎癥的源頭[1]，是多器官功能衰竭的發(fā)動機[2]。當腸道受到嚴重感染或炎癥[3-4]、休克、創(chuàng)傷[5]以及燒傷[6-7]等致病因素作用后會發(fā)生缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury,IRI)，腸壁通透性增加，大量腸源性活性物質(zhì)進入循環(huán)引起遠隔器官損傷，甚至導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)及多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。盡管腸缺血再灌注導(dǎo)致MODS的機制尚未明確，但通過腸淋巴管結(jié)扎和淋巴液引流可以阻斷“腸-淋巴”途徑，并能減輕IRI導(dǎo)致的局部炎性反應(yīng)和遠隔組織的損傷[8-10]。將失血性休克后腸系膜淋巴液經(jīng)靜脈注射至大鼠體內(nèi)，可引起大鼠多器官功能損傷[11]。這些研究證實“腸-淋巴”途徑在腸缺血再灌注后導(dǎo)致遠隔器官損傷的病理生理過程中扮演重要的角色。因此，對腸淋巴液進行深入研究具有重要的意義。但動物模型腸淋巴液的獲取難度大，在一定程度上限制了對腸淋巴液的深入研究。我們采用文獻[12-13]的方法進行大鼠腸淋巴液引流，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腸淋巴干置管操作難度大，腸淋巴液引流成功率較低。因此，我們對文獻中的方法進行改進，建立了一種操作簡便、成功率高的大鼠腸淋巴液引流方法，現(xiàn)將操作方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 動物 SPF級雄性SD大鼠60只，體重500±50g，購于長沙天勤生物技術(shù)有限公司。隨機分為文獻組30只，改進組30只。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，術(shù)前自由進食及飲水。

1.2 實驗材料 醫(yī)用膠水(3M公司，美國)；Elisa(檢測LPS、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)；20G靜脈留置針(洪達醫(yī)療器械有限公司)；硅膠管(內(nèi)外徑分別為0.5 mm/1.0 mm，上海道冠橡塑五金有限公司)；EP管(海門市瑞博實驗器材廠)；1%戊巴比妥鈉(上海嶅稞實業(yè)有限公司)。

1.3 術(shù)前準備 所有手術(shù)器械、EP管(2 mL)、硅膠管(內(nèi)外徑分別為0.5 mm/1.0 mm)、移液槍頭等均預(yù)先滅菌、去熱原處理，EP管管蓋預(yù)先鉆一小孔，無菌狀態(tài)下將靜脈留置針延長管沿遠端剪斷，去掉單手夾，將延長管遠端由小孔插入EP管內(nèi)約5 mm，硅膠導(dǎo)管一端預(yù)先剪一45°斜面。

1.4 手術(shù)操作 兩組開始部分相同的手術(shù)操作：經(jīng)大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉，麻醉顯效后，大鼠腹部剃毛，取仰臥位固定于手術(shù)臺上，腹部消毒鋪巾后，行腹部正中切口，長約4 cm，將全腸道及網(wǎng)膜組織向大鼠左側(cè)掀起，暴露腸系膜上動脈及腸淋巴干，在近下腔靜脈處剪開漿膜。

文獻組：鈍性分離腸系膜上動脈及腸淋巴干。輕提大鼠腸淋巴干，用眼科剪輕剪一小口，待少量淋巴液流出的同時，用眼科鑷夾住硅膠導(dǎo)管，將45°斜面置于開口處，然后順著淋巴管走向緩慢往里送，待導(dǎo)管進入淋巴干管腔，有淋巴液流出時，用少量醫(yī)用膠涂抹于右腎旁漿膜處，固定導(dǎo)管，以防脫出，縫合腹部切口。

改進組：以靜脈留置針作穿刺針，腸淋巴干遠端為穿刺點，順著淋巴管走向緩慢將穿刺針置入腸淋巴干內(nèi)，見有淋巴液進入穿刺針導(dǎo)管內(nèi)，置入穿刺針約4 mm后保持穿刺針導(dǎo)管位置相對固定，緩慢拔出鋼針，滴少許醫(yī)用膠于穿刺點處固定穿刺針，以防脫出，縫合腹部切口，大鼠取左側(cè)臥位便于淋巴液引流。穿刺置管后，以能持續(xù)引流出淡乳白色或乳白色的淋巴液作為評價引流成功的標準。

1.5 標本采集 引流腸淋巴液180 min，4℃、10 000×g離心10 min，取上清液，-80℃保存，待檢。

1.6 檢測指標 記錄180 min淋巴液引流量，采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(Elisa)檢測兩組淋巴液中LPS、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平。

2 結(jié)果

文獻組與改進組完成引流操作所用時間相近，約需20 min，兩組均可由單人完成操作。改進組引流成功率(93.3%)高于文獻組(73.3%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.04)。兩組180 min淋巴液引流量相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.44)(兩組淋巴液引流情況見表1)。文獻組與改進組淋巴液中LPS、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10水平相近，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P值均大于0.05)(兩組淋巴液中活性物質(zhì)水平見表2)。

表1兩組淋巴液引流情況(n=30)

組別成功例數(shù)失敗例數(shù)成功率引流量(mL)文獻22873.3%1.67±0.25改進28293.3%?1.72±0.16#

*：成功率與文獻組比較，χ2=4.32，P=0.04；#：引流量與文獻組比較，t=0.79,P=0.44。

組別LPS(EU/mL)TNF-α(pg/mL)IL-6(pg/mL)IL-4(pg/mL)IL-10(pg/mL)文獻6.32±1.3135.89±3.8621.13±3.3017.43±4.3516.84±3.42改進5.99±1.6336.02±4.4320.57±2.4516.77±3.8617.46±4.02t0.790.110.680.570.58P0.430.910.500.570.57

3 討論

腸淋巴液在腸缺血再灌注后導(dǎo)致遠隔器官損傷的病理過程中所起的重要作用受到越來越多研究者的重視。調(diào)節(jié)腸缺血再灌注后腸系膜淋巴的生物活性可減少全身炎癥和終末器官損傷[14]。大鼠是作為研究腸淋巴液較好的實驗動物，但大鼠腸淋巴干管壁薄，僅為數(shù)層上皮細胞構(gòu)成，穿刺時很容易造成管壁損傷，導(dǎo)致淋巴液獲取失敗，所以大鼠腸淋巴液的獲取一直以來都是一個難點。筆者在實驗前查閱國內(nèi)外相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)關(guān)于大鼠腸淋巴液獲取方法的研究較少。目前仍以使用硅膠管行腸淋巴管穿刺置管為主[12-13]。筆者在實驗前期采用該方法進行腸淋巴干穿刺置管引流，實驗過程發(fā)現(xiàn)實際操作難度大，淋巴液引流成功率較低，經(jīng)過反復(fù)實驗，仍難提高成功率，按照文獻的方法，筆者與同課題組人員經(jīng)過反復(fù)練習(xí)，成功率僅能達到73.3%(22/30)。故在文獻方法的基礎(chǔ)上反復(fù)實驗，做了如下改進：①將文獻中的硅膠管改為靜脈留置針作為穿刺針及引流管，因硅膠管質(zhì)地較軟，置管前需將淋巴管剪一小口，實際操作中很難把握所剪小口的大小。剪口太小，置管困難，剪口太大，置管后會出現(xiàn)淋巴液外漏。②在腸淋巴管剪口后，淋巴管內(nèi)的淋巴液會很快流出，導(dǎo)致淋巴管塌陷，因腸淋巴干管壁非常薄，淋巴管塌陷后會增加置管難度。而選用靜脈留置針作為穿刺針，不需要將淋巴管剪開，充分暴露出淋巴管后直接穿刺置管，淋巴管內(nèi)因有淋巴液而變得比較充盈，穿刺操作簡單，且穿刺孔與針管相匹配，不會出現(xiàn)淋巴液外漏現(xiàn)象。另外，若淋巴管內(nèi)淋巴液較少，淋巴管充盈不佳，可用無創(chuàng)動脈夾夾閉腸淋巴干近心端，數(shù)分鐘后，淋巴管便會變得充盈，使淋巴管穿刺變得更容易，穿刺成功后松開動脈夾，對淋巴管不會造成損傷，對后續(xù)實驗無影響。③腸淋巴干置管后，將大鼠置于左側(cè)臥位，有利于淋巴液引流。④文獻中所選實驗大鼠體重為300±20g，本課題組所選大鼠體重為500±50g。因大鼠腸淋巴干較細，體重小的大鼠與體重大的大鼠相比，腸淋巴干更細，穿刺置管難度更大，穿刺成功率更低，故選擇體重較大的大鼠更有利于實驗。⑤在既往的大部分文獻中，大鼠術(shù)前禁食6～12 h，不禁飲，在本實驗中，我們嘗試不對大鼠禁食，大鼠術(shù)前均自由進食及飲水。實驗證實，進食并未影響手術(shù)操作，也未導(dǎo)致大鼠嘔吐、窒息，反而可能使大鼠腸道血循環(huán)更豐富，腸淋巴液生成更多，單位時間內(nèi)腸淋巴液引流量更多。按照改進的方法，穿刺成功率明顯提高，達到93.3%(28/30)。30只大鼠僅有2只穿刺失敗，其中一只穿刺后未引流出淋巴液，可能是穿刺針管尖端貼壁，導(dǎo)致堵塞，另一只因穿刺后穿刺針管固定不牢，導(dǎo)致穿刺針管滑脫，其余28只老鼠均成功穿刺置管，持續(xù)引流出淋巴液。

本課題組后期將研究腸缺血再灌注后腸淋巴液導(dǎo)致遠隔器官損傷的機制，故在腸淋巴液引流成功后選擇觀察180 min腸淋巴液引流量及檢測淋巴液中活性物質(zhì)(LPS、TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10)的水平，結(jié)果顯示，引流成功后，兩組大鼠180 min腸淋巴液引流量相近(P=0.44)，兩組淋巴液中活性物質(zhì)的水平均無明顯差異(P值均大于0.05)，表明引流方法改進后對大鼠淋巴液引流量及淋巴液中活性物質(zhì)的水平無明顯影響。

經(jīng)改進方法后，操作更簡便、腸淋巴液引流成功率更高，有利于大鼠腸淋巴液引流模型的建立及后續(xù)實驗。