張曉光，鄭雅梅，李 強(qiáng)，楊 剛，張 巖

（1.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050091；2.河北醫(yī)科大學(xué)，河北 石家莊 050017）

近年來(lái)，隨著人們生活水平的不斷提高，對(duì)保健食品的需求量逐年增大，不法商販為了追求更高利益，向保健品中違法添加西藥類物質(zhì)屢見不鮮。糖皮質(zhì)激素具有廣泛的臨床用途，因而成為不法商家在保健品中非法添加的目標(biāo)物質(zhì)，如果誤食了非法添加含有糖皮質(zhì)激素類物質(zhì)的保健食品，可能會(huì)導(dǎo)致諸多不良反應(yīng)，造成人體機(jī)體代謝紊亂、發(fā)育異?；驖撛谥禄掳╋L(fēng)險(xiǎn)［1－2］。由此可見，加強(qiáng)對(duì)保健品中非法添加的監(jiān)管，建立保健品中激素類檢測(cè)方法十分必要。

精確先進(jìn)的激素測(cè)定方法是實(shí)現(xiàn)激素殘留有效監(jiān)督的重要手段，目前，激素類物質(zhì)的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法［3－5］、毛細(xì)管色譜法［6］、薄層色譜法［7］、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［8］、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法［9－11］等。本文介紹了一種超聲萃?。咝б合嗌V－質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)方法能快速分析檢測(cè)保健食品中10種糖皮質(zhì)類類西藥成分，該方法主要的優(yōu)勢(shì)在于檢測(cè)時(shí)間短，方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便快速，能夠?yàn)楸＝∑返臋z驗(yàn)工作和產(chǎn)品質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器，試劑與材料

Thermo TSQ Vantage液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)Thermo公司）；乙腈、甲醇、甲酸、乙酸銨均為色譜純（德國(guó)Merck公司）；無(wú)水硫酸鎂（分析純，天津富宇試劑公司）；N－丙基乙二胺吸附劑PSA（天津博納艾杰爾公司）；實(shí)驗(yàn)用水為實(shí)驗(yàn)室自制，符合GB／T 6682一級(jí)水的標(biāo)準(zhǔn)。

化學(xué)降糖藥物標(biāo)準(zhǔn)品：潑尼松、氫化可的松、曲安西龍雙醋酸酯、倍他米松、氟米龍、氟氫縮松、甲基潑尼松龍醋酸酯、氫化可的松丁酸酯、氫化可的松戊酸酯、倍他米松雙丙酸酯購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。

實(shí)驗(yàn)用保健品產(chǎn)品共計(jì)30份，均購(gòu)于石家莊某超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備

分別將10種糖皮質(zhì)類化合物用乙腈配制成質(zhì)量濃度為1mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使用時(shí)用乙腈稀釋成所需的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，－20℃冰箱保存。

1.3 樣品處理

稱取1.0g（精確至0.01g）樣品于50mL具塞離心管中，加入乙腈10mL，渦旋混勻，再加入2.0g無(wú)水硫酸鎂和100mgPSA，渦旋混勻后超聲萃取20min，于4℃、10000r／min條件下離心5min，收集上清液并移至圓底燒瓶，42℃減壓蒸發(fā)至近干。以10% 乙腈水溶解濃縮物，定容至1.0mL，過(guò)0.22μm 濾膜，供上機(jī)測(cè)定。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件：

色譜柱：Thermo Hypersil Gold（50mm×2.1mm，1.9μm）

流動(dòng)相：A相0.1%（V／V）甲酸水溶液；B相乙腈；梯度洗脫：0－1min，90%A；1－8min，90%－10%A；8－10min，10%A；10－11min，10%A－90%A；11－14min，90%A。流速：0.30mL／min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1μL。

1.4.2 質(zhì)譜條件：

電噴霧離子源（ESI）溫度：350℃；

毛細(xì)管電壓：4000V（正離子模式）；

掃描范圍：m／z 100～800（正離子模式）；

氣化溫度：300℃；

鞘氣壓（N2）：30arb；

輔助氣壓（N2）：10arb；

離子傳輸管溫度：350℃；

碰撞裂解氣：高純氬氣；

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取方法的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)采用有機(jī)溶劑進(jìn)行超聲提取，比較了乙醇、甲醇、乙腈、三氯甲烷等4種有機(jī)溶劑，以確定本實(shí)驗(yàn)用的提取有機(jī)溶劑。分別選用以上四種溶劑作為提取劑和不同的提取時(shí)間（5、10、15、20、30min），對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)（加標(biāo)量為10μg／kg），比較回收率、本底干擾及可操作性綜合評(píng)價(jià)提取溶劑的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：乙腈的提取回收率最高，基質(zhì)干擾最小，效果最好。當(dāng)超聲時(shí)間為20min時(shí)，目標(biāo)物提取回收趨于穩(wěn)定，均能獲得70－115%的回收率。因此實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈為提取溶劑，超聲時(shí)間為20min。

2.2 凈化條件的優(yōu)化

由于保健品中用乙腈提取所得提取物基質(zhì)較為復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)明顯，因此需對(duì)提取液進(jìn)行凈化處理，實(shí)驗(yàn)考察對(duì)比了固相萃取柱法和基質(zhì)固相分散法的兩種凈化效果，以基質(zhì)加標(biāo)回收率的高低作為萃取凈化方法評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果表明，使用HLB固相萃取柱凈化得到了較好的效果，10種糖皮質(zhì)激素平均回收率達(dá)到75%以上，降低了基質(zhì)效應(yīng)；使用基質(zhì)固相分散萃取法，能夠有效地去除樣品基質(zhì)中的色素、脂類、醚類、金屬離子等雜質(zhì)，回收率與使用HLB固相萃取相比，平均回收率無(wú)明顯差異，但是平均回收率RSD值較高，這可能是由于PSA填料結(jié)構(gòu)為N－丙基乙二胺，對(duì)一些糖皮質(zhì)激素具有吸附作用，但是與使用固相萃取柱HLB相比，基質(zhì)分散固相萃取操作更加簡(jiǎn)便，使用的提取劑用量少，操作更加簡(jiǎn)便，因此本實(shí)驗(yàn)最終選取PSA凈化方法。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)10種糖皮質(zhì)激素化合物的化學(xué)電離性質(zhì)，分別選用正模式掃描和負(fù)模式掃描作為離子化模式，采用流動(dòng)注射泵連續(xù)進(jìn)樣方式進(jìn)行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10種糖皮質(zhì)類激素物質(zhì)在正模式和負(fù)模式均有響應(yīng)，在正模式下形成［M＋H］、［M＋Na］峰、在負(fù)模式下形成［M－H］峰，其中10種糖皮質(zhì)激素在正模式下的［M＋H］峰的豐度最高，因此本實(shí)驗(yàn)確定以正模式掃描，以［M＋H］來(lái)確定10種糖皮質(zhì)激素的母離子，在確定糖皮質(zhì)激素的母離子后，采用子離子掃描方式對(duì)子離子進(jìn)行了優(yōu)化選擇，每個(gè)母離子確定了2對(duì)子離子。通過(guò)優(yōu)化碰撞能量、透鏡電壓等質(zhì)譜參數(shù)使每種激素的特征碎片離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度達(dá)到最大。確定碰撞能量和透鏡電壓后，連接液相色譜和三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀聯(lián)機(jī)，對(duì)離子源溫度、毛細(xì)傳輸管溫度、鞘氣流量、輔助氣流量進(jìn)行優(yōu)化，使樣液中每種激素的離子化效率達(dá)到最佳。10種激素的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 10種糖皮質(zhì)激素的質(zhì)譜分析參數(shù)

2.4 色譜流動(dòng)相的選擇

液相色譜質(zhì)譜儀在正模式下常用的流動(dòng)相體系有甲酸水溶液（甲酸含量0.1%v／v）－甲醇體系、甲酸水溶液（甲酸含量0.1%v／v）－乙腈體系、乙酸銨水溶液（乙酸銨含量5mmol／L）－乙腈體系、乙酸銨水溶液（乙酸銨含量5mmol／L）－甲醇體系等，考察了以上四種流動(dòng)相體系下，質(zhì)譜出峰的情況。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)表明，不同流動(dòng)相對(duì)質(zhì)譜出峰影響較大，其中有機(jī)相使用乙腈體系得到的峰影響強(qiáng)度均大于甲醇體系，且基質(zhì)干擾明顯小于使用甲醇體系，水相中使用乙酸銨比使用甲酸得到的峰形更好，這可能是因?yàn)槭褂靡宜徜@有利于目標(biāo)物的分子離子化，改善化合物的峰形。但是使用乙酸銨水溶液作為水相得到的10種糖皮質(zhì)激素平均峰強(qiáng)度比使用甲酸水溶液得到的10種糖皮質(zhì)激素平均峰強(qiáng)度小1／2左右，這可能是由于甲酸使正離子模式下的目標(biāo)物質(zhì)子化增強(qiáng)，但同時(shí)也增加了糖皮質(zhì)激素類物質(zhì)在流動(dòng)相中的保留能力，導(dǎo)致峰形變寬。綜合考慮目標(biāo)物的以上幾點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)最終確定以甲酸水溶液（甲酸含量0.1%v／v）－乙腈體系作為流動(dòng)相，優(yōu)化后的目標(biāo)物MRM色譜圖見圖1。

圖1 10種糖皮質(zhì)激素的MRM色譜圖

（從上到下依次為潑尼松Prednisolone、氫化可的松Hydrocortisone、曲安西龍雙醋酸酯Triamcinolone acetonide、倍他米松Betamethasone氟米龍F(tuán)luoromethalone、氟氫縮松Fludroxycortide、甲基潑尼松龍醋酸酯Methylprednisolone 21－acetate、氫化可的松丁酸酯Hydrocortisone 17－butyrate、氫化可的松戊酸酯Hydrocortisone 17－valerate、倍他米松雙丙酸酯Betamethasone dipropionate）

2.5 方法準(zhǔn)確度和精密度

以10種糖皮質(zhì)激素物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度（ng／mL）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計(jì)算，得到線性方程和相關(guān)系數(shù)。10種分析物的線性方程相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以3倍信噪比（S／N）為檢出限（LOD），10倍信噪比（S／N）為定量限（LOQ）。各目標(biāo)物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限見表2。

表2 10種目標(biāo)物的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.6 方法的回收率

在空白基質(zhì)中添加10種降壓藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加水平分別為1μg／kg、3μg／kg和10μg／kg，每個(gè)添加水平平行測(cè)定3次，用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定，其回收率和精密度結(jié)果列于表3。10種目標(biāo)物在3種添加水平下的加標(biāo)回收率在71.4%～113.5%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.1%－13.6%。

表3 實(shí)際樣品的加標(biāo)回收率和相對(duì)偏差

續(xù)表3

2.7 實(shí)際樣品的測(cè)定

應(yīng)用本方法對(duì)市場(chǎng)上銷售的保健類產(chǎn)品共30份進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1份功能性保健食品中含有0.20mg／kg的倍他米松。

3 結(jié)論

建立了同時(shí)快速測(cè)定降糖類保健食品中的10種違禁添加成分的UPLC－MS／MS方法，通過(guò)優(yōu)化液相條件和質(zhì)譜條件，有效地提高了分析效率和靈敏度，縮短了檢測(cè)的時(shí)間（在6min內(nèi)能夠完成10種藥物的檢測(cè)），降低了檢出限，擴(kuò)大了線性范圍。方法的樣品前處理步驟簡(jiǎn)單，有效降低了基質(zhì)效應(yīng)，回收率符合方法學(xué)要求。該方法可以用于保健食品中糖皮質(zhì)激素類物質(zhì)非法添加的檢測(cè)。

［1］ 杜昆.腎上腺皮質(zhì)激素的不良反應(yīng)［J］.首都醫(yī)藥，2000，7（8）：62－63.

［2］ 李佩佩，郭遠(yuǎn)明，張小軍，等.高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定動(dòng)物源食品中同化激素的研究進(jìn)展［J］.理化檢驗(yàn)－化學(xué)分冊(cè)，2014，50（11）：1476－1477.

［3］ 吳大南，鄭和輝，王萍，等.超高效液相色譜法檢測(cè)化妝品中8種糖皮質(zhì)激素［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（2）：197－198.

［4］ 潘軍.HPLC法篩查中藥軟膏制劑中非法添加的17種糖皮質(zhì)激素［J］.中成藥，2014，36（11）：2323－2324.

［5］ 吳小紅，李煥德.高效液相色譜法二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)分析測(cè)定中成藥及保健品中非法添加的9種糖皮質(zhì)激素［J］.中南藥學(xué)，2009，7（5）：324－325.

［6］ 孫雪婷，商少明，陳秀英，等.微乳毛細(xì)管電色譜電動(dòng)進(jìn)樣－場(chǎng)放大堆積法檢測(cè)化妝品中糖皮質(zhì)激素［J］.分析化學(xué)，2014，42（1）：36－40.

［7］ 夏瑞，董素英，車寶泉.薄層色譜法快速鑒別中藥制劑中的糖皮質(zhì)激素［J］.藥物分析雜志，2008，28（3）：470－471.

［8］ 吳維群，沈朝燁，楊玉林，等.GC－MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)水性化妝品性激素成分的方法研究［J］.環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2004，21（4）：307－309.

［9］ 王朝，馬強(qiáng)，王星，等.液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定化妝品中16種激素［J］.分析化學(xué)，2007，35（9）：1257－1262.

［10］ 凌霄，徐志洲，牛沖.HPLC／MS／MS法檢測(cè)中藥制劑中解熱鎮(zhèn)痛及糖皮質(zhì)激素類化學(xué)藥［J］.藥物分析雜志，2010，30（7）：1311－1314.

［11］ 嚴(yán)華，云環(huán)，劉鑫，等.UHPLC－LTQ－OrbitrapMS測(cè)定雞肉組織中5種糖皮質(zhì)激素殘留［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2013，32（8）：909－914.