丁怡然， 黃 云， 趙婷婷， 蔡 倩， 羅 玉，黃 斌， 張榆霞， 潘學軍＊

（1.昆明理工大學環(huán)境科學與工程學院，云南 昆明650500；2.云南省環(huán)境監(jiān)測中心站，云南 昆明650034）

有機紫外防曬劑是指可以吸收太陽光中長波紫外線（UVA，320～420 nm）和中波紫外線（UVB，275～320 nm）的一類有機物，該類物質主要作為化妝品添加劑被廣泛應用于防曬霜等護膚品中，世界各國對該類物質的使用種類及用量均有規(guī)定［1］。我國化妝品衛(wèi)生規(guī)范（2007版）［2］也對該類物質進行了種類及用量的規(guī)范，可以作為化妝品添加劑使用的有機紫外防曬劑共有24種。近年來，隨著皮膚癌患病率增高及人們健康防護意識增強，有機紫外防曬劑的使用范圍及使用量都在逐漸增加［3］。大多數(shù)有機紫外防曬劑含有一個或者多個苯環(huán)，且常連接有疏水性基團，具有較強的脂溶性，因此其進入環(huán)境后引起的環(huán)境及健康問題引起了國際社會的關注［4］。已有研究表明有機紫外防曬劑具有內(nèi)分泌干擾效應、遺傳毒性、生殖毒性等多種負面生物效應［5］。因此，建立簡單、快速、靈敏、有效的水環(huán)境中有機紫外防曬劑的分析方法迫在眉睫。

化妝品中有機紫外防曬劑的檢測普遍采用高效液相色譜（HPLC），通常使用該方法對標準溶液進行測定的檢出限可達 mg／L級［6］。毛希琴等［7］優(yōu)化了前處理、色譜柱和流動相等條件后用HPLC法檢測了化妝品中17種有機紫外防曬劑，檢出限和定量限達到μg／g。林維宣等［8］使用液相色譜－串聯(lián)質譜法（LC－MS／MS）檢測化妝品中11種有機紫外防曬劑，定量限達mg／kg。由于環(huán)境樣品中有機紫外防曬劑的濃度遠遠不及其在化妝品中的濃度，因此對于環(huán)境中的樣品較少采用HPLC法。目前，針對環(huán)境樣品中有機紫外防曬劑的檢測方法有LC－MS／MS法，液相色譜－二極管陣列檢測法（LC－DAD），氣相色譜－質譜法（GC－MS）。其中，使用 LC－MS／MS測定水體中二苯酮－3（benzophenone－3，BP－3）的檢出限可達50 ng／L［9］；LC－DAD 檢測水體中 BP－3、甲氧基肉桂酸乙基己酯（ethylhexyl methoxycinnamate，EHMC）、4－甲基芐亞基樟腦 （4－methylbenzylidene camphor，4－MBC）的檢出限分別可達0.45、0.56、0.14μg／L［10］。由此可見，對環(huán)境樣品進行檢測使用LC－MS／MS要優(yōu)于LC－DAD，但是由于LC－MS／MS設備昂貴，因此該方法并未得到廣泛應用。而GC－MS在運行成本及檢出限方面具有一定的優(yōu)勢，使用 GC－MS檢測4－MBC、EHMC檢出限分別可達5.8、2.5 ng／L［10］。

目前檢測水樣中有機紫外防曬劑采用的前處理方法包括了傳統(tǒng)的液液萃取法（LLE）［11］、固相萃取法（SPE）［9］、固相微萃取法（SPME）［12］。其中 LLE法耗費有機溶劑較多且操作復雜，近年來關于該法的前處理報道較少；SPME法是一種快速、精確的前處理方法，且不僅可以用于簡單的水樣，還可以用于如尿液等復雜樣品；SPE法在3種前處理方法中較為常用。近年來，基質固相分散法（MSPD）和攪拌棒吸附萃取法（SBSE）作為新興的水樣前處理技術也有報道［13，14］。

本研究以5種典型有機紫外防曬劑BP－3、EHMC、4－MBC，奧克立林（octocrylene，OC）、胡莫柳酯（homosalate，HMS）為目標污染物，建立環(huán)境水樣中典型有機紫外防曬劑的GC－MS分析方法。在所選的5種目標化合物中，EHMC、BP－3、OC和4－MBC為市售化妝品中用量前4位的有機紫外防曬劑［15］；此外，生物實驗表明 BP－3、4－MBC 和HMS具有雌激素效應，會引起實驗生物的一些負面生物效應［16］。同時這5種物質也是很多研究調查選取的目標污染物，具有一定的代表性。

在所選目標污染物中，HMS和BP－3均具有苯環(huán)上連接羥基的結構（見表1），使得這兩個物質與其他物質相比極性較大，不利于其在GC－MS分析過程中氣化。已有研究［17］表明，HMS和BP－3經(jīng)衍生化后，色譜峰形有較大的改善，兩個物質的檢出限達到ng／L級。但目前尚未見對這兩個物質的衍生化反應進行全面系統(tǒng)的條件考察，不同的文獻［17－20］采用的衍生化試劑、衍生化反應時間和溫度均不盡相同。

本文針對HMS、BP－3衍生化條件進行了系統(tǒng)的優(yōu)化，得出HMS、BP－3的最佳衍生化條件，并對SPE條件進行了系統(tǒng)優(yōu)化，建立了SPE－衍生化－GCMS分析5種目標化合物在水體中含量的方法，并使用該方法對實際水樣進行了驗證分析。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

氣相色譜（7890A，Agilent）－質譜（5975C，Agilent）聯(lián)用儀；自動固相萃取裝置（Reeko）；固相萃取柱 Oasis HLB（0.5 g，6 mL，Waters）；HGC－36A型氮吹儀（天津恒奧）；GF／F玻璃纖維濾紙（0.45 μm，Millipore）。

BP－3、benzophenone－d10（BP－d10，回收率指示物）和肉桂酸芐酯（內(nèi)標，I.S.）購于Sigma－Aldrich，純度均大于99%；EHMC、4－MBC、OC和HMS購于Dr.Ehrenstorfer，純度均大于99%；衍生化試劑N－甲基－N－三甲基硅基三氟乙酰胺（N－methyl－N－trimethylsilyltrifluoroacetamide，MSTFA）、雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（N，O－bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide，BSTFA）購于Sigma－Aldrich，純度均大于98%；正己烷、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯等有機溶劑均為色譜純級（Fisher）。目標化合物及回收率指示物、內(nèi)標結構式見表1。

1.2 標準溶液的配制

實驗所用玻璃容器均用鉻酸洗液浸泡24 h后用超純水洗凈，400℃以上烘干4～6 h以排除有機雜質對實驗結果的影響。

標準貯備液：準確稱取 HMS、EHMC、BP－3、4－MBC、OC、BP－d10、肉桂酸芐酯各10 mg，溶于10 mL正己烷中，得到1 g／L的標準貯備液，4℃冷藏保存。根據(jù)實驗需要稀釋。

混合標準溶液：分別取 HMS、EHMC、BP－3、4－MBC、OC和 BP－d10標準貯備液各100μL，加入9 400μL正己烷，得到10 mg／L的混合標準溶液，4℃冷藏。

1.3 固相萃取

水樣經(jīng)0.45μm玻璃纖維濾膜過濾，調節(jié)pH3～5，待用。Oasis HLB柱依次用5 mL乙酸乙酯－二氯甲烷混合溶液（1∶1，v／v）、5 mL甲醇和5 mL去離子水活化，將處理過的水樣以5 mL／min流速通過活化好的Oasis HLB柱。上樣富集完畢后，先用10 mL超純水淋洗固相萃取柱以除去雜質，之后待固相萃取柱中水份完全抽干后用15 mL乙酸乙酯－二氯甲烷溶液（1∶1，v／v）混合溶液對固相萃取柱進行洗脫，收集洗脫溶液得到目標化合物。

1.4 衍生化

將含有目標化合物的洗脫溶液通入氮氣緩慢吹干，加入100μL衍生化試劑，搖勻混合后在100℃下反應100 min，冷卻至室溫后加入100μL 10 mg／L內(nèi)標使最終進樣溶液中內(nèi)標質量濃度為5 mg／L，取1μL進行GC－MS分析。

1.5 GC－MS儀器參數(shù)及分析條件

氣相色譜柱為 DB－5MS色譜柱（30 m×0.25mm×0.25μm，美國J ＆W Scientific公司）；以氦氣為載氣，流速1.2 mL／min；不分流方式進樣，進樣口溫度280℃，進樣體積1μL。色譜柱升溫程序為：初始溫度80℃，保持1 min；以20℃／min升溫到210℃，保持6 min；以30℃／min 升溫至280℃，保持5 min。接口溫度280℃；傳輸線溫度300℃；離子源為電子轟擊離子源（EI）；能量70 eV；離子源溫度250℃。以全掃描（scan）模式定性，掃描范圍m／z 50～600；以選擇離子掃描模式（SIM）定量。其他參數(shù)見表1。

表1 目標物質、回收率指示物、內(nèi)標物的化學結構及圖譜信息Table 1 Chromatogram information and structures of the target compounds，recovery indicator and internal standard

2 結果與討論

2.1 HMS、BP－3衍生化條件優(yōu)化

2.1.1 衍生化試劑的選擇

根據(jù)文獻［21］報道羥基衍生化常用的衍生化試劑為MSTFA及BSTFA。因此，首先考察了衍生化試劑用量為150μL，反應溫度為70℃，反應時間為60 min條件下，不同衍生化試劑對目標化合物衍生化的影響，結果見圖1。使用BSTFA作為衍生化試劑，目標化合物的相對響應因子（relative response factors，RRF）值明顯高于使用MSTFA作為衍生化試劑的所得值。對樣品進行GC－MS全掃描檢測，使用BSTFA作為衍生化試劑時的色譜圖峰形優(yōu)于使用MSTFA的。因此選擇BSTFA作為HMS和BP－3的衍生化試劑。

2.1.2 衍生化試劑的用量

考察了衍生化試劑為BSTFA，反應溫度為70℃，反應時間為60 min條件下，衍生化試劑用量對HMS、BP－3衍生化效果的影響，結果見圖2。當衍生化試劑用量為50μL時，HMS和BP－3的衍生化反應不完全，仍有大部分化合物未被衍生化，因此RRF值較低；當衍生化試劑增加到100μL時，HMS和BP－3衍生化反應較完全，RRF值較高。因此選擇衍生化試劑用量為100μL。

圖1 衍生化試劑對衍生化產(chǎn)物響應因子（RFF）的影響Fig.1 Effect of derivatization reagent on the relative response factor（RFF）values of the derivative products

圖2 衍生化試劑用量對衍生化產(chǎn)物RRF值的影響Fig.2 Effect of the volume of derivatization reagent on the RRF values of the derivative products

2.1.3 衍生化時間

在衍生化試劑為BSTFA，用量為100μL，反應溫度為70℃條件下，考察了反應時間分別為30、50、60、80、90、100、120 min對衍生化反應的影響，結果如圖3所示。當衍生化反應時間小于100 min時，HMS和BP－3未能完全衍生化，RRF值較低；但隨著反應時間增加，衍生化反應逐步進行完全，RRF值呈現(xiàn)遞增趨勢；而當衍生化反應時間為100 min時，HMS和BP－3的衍生化效果較好，取得較高RRF值。因此選擇反應時間為100 min。

圖3 衍生化反應時間對衍生化產(chǎn)物RRF值的影響Fig.3 Effect of the derivatization reaction time on the RRF values of the derivative products

2.1.4 衍生化溫度

考察了衍生化試劑為BSTFA，衍生化試劑用量為100μL，反應時間為100 min條件下，衍生化溫度分別為20、50、70、80、90、100、120 ℃時對衍生化反應的影響，實驗結果如圖4。溫度在20～90℃時，HMS和BP－3的衍生化反應逐步進行完全，RRF值逐漸遞增；當溫度達到100℃時，HMS和BP－3的衍生化反應較為完全，此時目標化合物的RRF值達到峰值。因此選擇反應溫度為100℃。

圖4 衍生化反應溫度對衍生化產(chǎn)物RRF值的影響Fig.4 Effect of the derivatization reaction temperature on the RRF values of the derivative products

2.1.5 衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性

在上述確定的衍生化條件下，分別取100μL10 mg／L的HMS和BP－3標準溶液，對其進行衍生化。衍生化后產(chǎn)物在4℃下保存，分別于0、6、12、24、36、48 h后取出進行GC－MS檢測，發(fā)現(xiàn)HMS和BP－3衍生化產(chǎn)物RRF值呈現(xiàn)下降趨勢，說明衍生化產(chǎn)物不穩(wěn)定，對HMS、BP－3進行衍生化后需要立即檢測以保證數(shù)據(jù)的可靠性。

2.2 固相萃取條件

2.2.1 固相萃取柱的選擇

在水樣pH為中性，洗脫溶劑為乙酸乙酯的條件下，對比了使用 Oasis HLB（0.5 g）、Sep－Pak C18（0.5 g）和Sep－Pak C18（1.0 g）3種固相萃取小柱時5種目標化合物及回收率指示物的回收率。如表2所示，與其余兩種小柱相比，使用Oasis HLB小柱時目標物的回收率較高。這是由于與Sep－Pak C18柱相比，Oasis HLB柱對極性較弱的物質具有更好的吸附性能，且其具有較高的吸附量，在填料較少的情況下仍然可以得到較高的回收率。因此選擇Oasis HLB柱進行固相萃取。

2.2.2 洗脫溶劑

使用Oasis HLB柱，在水樣pH為中性的條件下考察了乙酸乙酯（EA）、二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯－二氯甲烷（1∶1，v／v）、乙酸乙酯－二氯甲烷（2∶1，v／v）4種溶液作為洗脫溶劑時各目標物的回收率。從表3可以看出，洗脫溶劑為乙酸乙酯－二氯甲烷（1∶1，v／v）時，目標物質的回收率高于使用其余3種洗脫溶劑時的回收率，因此選擇其作為洗脫溶劑。

表2 不同固相萃取柱對目標物回收率的影響Table 2 Effect of solid phase extraction column on the recoveries of the target compounds

表3 洗脫溶劑對目標物回收率的影響Table 3 Effect of elution solvent on the recoveries of the target compounds

2.2.3 水樣pH值的選擇

使用Oasis HLB柱，以乙酸乙酯－二氯甲烷（1∶1，v／v）為洗脫溶劑的條件下考察了水樣pH對各物質回收率的影響。由于Oasis HLB柱填料性質使得其對酸性樣品的保留能力高于堿性樣品，因此當水樣處于酸性條件下，pH值對各物質的回收率沒有明顯影響；當水樣處于堿性條件下，各物質的回收率下降。因此調節(jié)水樣pH值為3～5。

2.3 方法學驗證

2.3.1 線性關系、檢出限和定量限

配制系列質量濃度（0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0μg／L）的混合標準溶液，在優(yōu)化的衍生化條件下進行測定。以目標物與內(nèi)標的峰面積之比（即RRF）為縱坐標，各目標物的質量濃度（μg／L）為橫坐標，得到5種目標物及回收率指示物的標準曲線、相關系數(shù)及線性范圍（見表4）。各分析物的RRF值與其質量濃度呈良好的線性關系，相關系數(shù)（r2）均高于0.99，線性范圍為0.01～10μg／L。分別按照信噪比（S／N）為3和10確定方法的檢出限與定量限，結果見表4。使用衍生化－氣相色譜－質譜法檢測5種典型有機紫外防曬劑的方法檢出限為0.5～1.2 ng／L，定量限為1.4～4.0 ng／L。文獻［17］中5種典型有機紫外防曬劑的檢出限為23～181 ng／L，與本文進行比較可以看出本文方法的檢出限更低。

2.3.2 方法的回收率和精密度

實際空白水樣采自撫仙湖湖心，向水樣中加入10μL10 mg／L的混合標準溶液，在優(yōu)化的實驗條件下進行3次平行試驗，計算回收率和方法精密度（見表5）。在實際水樣中，各目標化合物的平均回收率為87.85%～102.34%，相對標準偏差（RSD，n＝3）為1.9%～4.8%，可以滿足環(huán)境樣品中有機紫外防曬劑的分析要求。目標物的色譜圖見圖5。

表4 目標物的線性方程、相關系數(shù)、檢出限及定量限Table 4 Linear equations，correlation coefficients（r2），LODs and LOQs of the target compounds

表5 撫仙湖水樣中6種目標物的加標回收率和相對標準偏差（n＝3）Table 5 Recoveries and RSDs of the six target compounds in spiked water sample collected from Fuxian Lake（n＝3）

圖5 實際加標（100 ng／L）水樣的選擇離子色譜圖Fig.5 SIM chromatogram of a real water sample spiked at 100 ng／L

2.4 實際環(huán)境樣品的測定

2013年12月采集了昆明市第一污水處理廠進出口水樣進行檢測。按照優(yōu)化的方法對水樣進行前處理、衍生化及測定。經(jīng)檢測，HMS、EHMC、BP－3、4－MBC、OC 在 進 水 中 的 質 量 濃 度 分 別 為2 344.92、558.34、109.79、382.79、183.92 ng／L，在出 水 中 分 別 為 334.78、81.55、58.13、196.25、126.71 ng／L。對各點位水樣進行了3組平行實驗，各組實驗結果的RSD小于4%。將所得結果與文獻［11］進行比較發(fā)現(xiàn)差別不大，認為該結果可以代表昆明市部分市區(qū)生活污水中5種典型紫外防曬劑的含量。污水處理廠水樣，尤其是進水水樣中成分較復雜，本文方法成功測定了污水處理廠水樣中目標物質的含量，表明其具有一定的使用前景。

3 結論

對HMS和BP－3的衍生化反應條件進行了系統(tǒng)的優(yōu)化，并對衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性進行了考察。建立了固相萃?。苌瓪庀嗌V－質譜檢測水體中5種有機紫外防曬劑的方法，具有較低的檢出限。應用該方法檢測了污水處理廠進出水中目標物的含量，證明該方法穩(wěn)定可靠，重現(xiàn)性好，能滿足實際環(huán)境樣品檢測的要求。該方法的建立對開展檢測該類物質在污水處理廠、水環(huán)境中的分布研究工作具有一定的支撐作用。

［1］ Buchberger W W.J Chromatogr A，2011，1218：603

［2］ Ministry of Health of the People's Republic of China.Hygienic Standard for Cosmetics（中華人民共和國衛(wèi)生部.化妝品衛(wèi)生規(guī)范），2007：75

［3］ Paris C，Lhiaubet－Vallet V，Jimenez O，et al.Photochem Photobiol，2009，85：178

［4］ Boxall A B A，Rudd M A，Brooks B W，et al.Environ Health Perspect，2012，120（9）：1221

［5］ Li L P，Wei D B，Li M，et al.Environmental Chemistry（李立平，魏東斌，李敏，等.環(huán)境化學），2012，31（2）：150

［6］ He Q S，Xu N，Li J，et al.Chinese Journal of Chromatography（何喬桑，徐娜，李晶，等.色譜），2011，29（8）：762

［7］ Mao X Q，Bian H T，Qu B C.Chinese Journal of Chromatography（毛希琴，邊海濤，曲寶成.色譜），2013，31（8）：775

［8］ Lin W X，Sun X Q，Ma J.Chinese Journal of Chromatography（林維宣，孫興權，馬杰.色譜），2013，31（5）：410

［9］ Wick A，F(xiàn)ink G，Ternes T A.J Chromatogr A，2010，1217：2088

［10］ Giokas D L，Sakkas V A，Albanis T A，et al.J Chromatogr A，2005，1077：19

［11］ Kupper T，Plagellat C，Br?ndli R C，et al.Water Res，2006，40：2603

［12］ Felix T，Hall B J，Brodbelt J S.Anal Chim Acta，1998，371：195

［13］ Negreira N，Rodríguez I，RubíE，et al.J Chromatogr A，2009，1216：5895

［14］ Rodil R，Moeder M.J Chromatogr A，2008，1179：81

［15］ Gao L X，Zhang L X.Chinese Journal of Public Health（高立雪，張麗霞.中國公共衛(wèi)生），2011，27（6）：785

［16］ Fent K，Kunz P Y，Zenker A，et al.Mar Environ Res，2010，69：S4

［17］ Cuderman P，Heath E.Anal Bioanal Chem，2007，387：1343

［18］ Román I P，Chisvert A，Canals A.J Chromatogr A，2011，1218：2467

［19］ Jeon H K，Chung Y，Ryu J C.J Chromatogr A，2006，1131：192

［20］ Sánchez－Brunete C，Miguel E，Albero B，et al.J Chromatogr A，2011，1218：4291

［21］ Huang B，Pan X J，Wan X，et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry（黃斌，潘學軍，萬幸，等.分析化學）.2011，39（4）：449