錢飛中， 朱麗波， 徐能斌， 馮加永*， 洪正昉，徐立紅， 陳鐘佺， 汪晟樂

(1.寧波市環(huán)境監(jiān)測中心，浙江寧波315012;2.浙江省環(huán)境監(jiān)測中心，浙江杭州310012;3.紹興市環(huán)境監(jiān)測中心，浙江紹興312000)

2，4，6-三硝基苯酚又名苦味酸，是早期炸藥的主要成分，第二次世界大戰(zhàn)期間生產(chǎn)的苦味酸炸彈近些年仍然在德國、中國等地時有發(fā)現(xiàn)［1］。同時苦味酸廣泛用作染料、醫(yī)療中的收斂劑和殺菌劑等，也是許多芳香族硝基化合物生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物［2］?？辔端峋哂袕娧趸院蛷娝嵝?，在環(huán)境中很快降解成毒性更大的苦氨酸等降解產(chǎn)物［3］。

苦味酸是我國地表水常規(guī)監(jiān)測化合物，目前的國標(biāo)方法采用衍生化-氣相色譜法檢測水體中的苦味酸［4］。該方法首先需要將沸點較高(300℃)的苦味酸衍生成沸點較低(112℃)的氯化苦，采用氣相色譜-電子捕獲檢測器(ECD)進行檢測。該方法存在3個比較大的缺陷，一是需要用毒性較大的苯進行萃取;二是用于反應(yīng)的次氯酸鈉不穩(wěn)定，衍生反應(yīng)難以控制，且氯化苦是一種極易爆炸的物質(zhì)，具有一定的危險性;三是采用 ECD難以對目標(biāo)物準(zhǔn)確定性。

由于苦味酸是一種強酸和強極性化合物，其在25℃時電離常數(shù)達0.42，在水中能夠較為充分的電離，以至于在普通反相色譜柱中難以實現(xiàn)有效保留［5］。為了盡可能地使其在反相色譜柱中保留，需要在初始流動相中使用很高比例的水相，以降低洗脫能力，使得方法的靈敏度較低［6］。在以往的文獻報道中對于苦味酸的保留通常有兩種方式［7］:一種采取離子抑制的方法，即在流動相中添加酸性緩沖鹽以抑制苦味酸的電離，如Nipper等［8］使用組成為35%(v/v)甲醇和65%(v/v)醋酸鈉(pH為4.8)的流動相分析苦味酸;另一種方法是使用離子對試劑，通過離子對試劑與待測離子結(jié)合增加其疏水性，從而增加待測離子在反相色譜柱中的保留，如Yost等［9］使用組成為50%(v/v)乙腈和50%(v/v)0.05 mol/L辛烷磺酰的流動相，且流動相中含有0.1 mol/L的三丁基氫氧化銨(tributyl ammonium hydroxide，TBAH)離子對試劑。通常使用的離子對試劑TBAH并不適合液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析，因為不揮發(fā)的離子對試劑會在LC-MS接口處沉淀而污染離子源。所以在Pamme等［7］的實驗中使用了三丁基甲酸銨(tributyl ammonium formate，TBAF)這種揮發(fā)性的離子對試劑。但是，離子對試劑的使用一方面需要考慮其是否能夠完全反應(yīng)，另一方面如果離子對在進樣口處不能及時完全揮發(fā)仍然可能導(dǎo)致儀器的污染。以上所述的液相方法及衍生化LC-MS方法中，由于儀器靈敏度只能達到mg/L 級［7－9］，因此必須采取高倍濃縮、凈化等方式進行樣品前處理，需要時間較長，過程復(fù)雜。

親水作用色譜主要針對在普通反相色譜中保留弱或者不保留的極性物質(zhì)，并且可以緩解在反相液相色譜中流動相中高水相引起的反壓高及質(zhì)譜信號低等問題［10］。本文建立了超高效親水作用色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測水中苦味酸及其降解產(chǎn)物苦氨酸的方法，實現(xiàn)了待測物的有效保留。本方法無需衍生，選擇性好，靈敏度高，分析速度快。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)，Quattro Premier XE三重四極桿質(zhì)譜儀(Waters公司);VisiprepTMSPE真空固相萃取裝置(Supelco公司);Oasis MAX固相萃取小柱(200 mg/6 mL，Waters公司);BEH HILIC色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，Waters公司)。1.0 mL一次性無菌注射器(浙江玉升醫(yī)療器械有限公司);有機相針式濾器(13 mm×0.2 μm，上海安譜科學(xué)儀器有限公司)。

苦氨酸、苦味酸(99.5%，AccuStandard公司);甲醇、乙腈、甲酸(HPLC級，TEDIA公司);醋酸、氨水(優(yōu)級純，國藥集團);實驗用水為去離子水。

1.2 樣品采集及前處理

地表水樣品12個，采自浙江省寧波市亭下水庫、晈口水庫、橫山水庫和白溪水庫。廢水樣品7個，采自浙江省杭州市蕭山區(qū)某采礦場周圍水域。

水樣使用100 mL棕色玻璃瓶采集，于4℃冷藏運輸、保存，6 h內(nèi)檢測。地表水樣品使用一次性無菌注射器吸入約1.0 mL，經(jīng)過0.2 μm有機相針式濾器過濾后注入液相色譜進樣小瓶中待測。廢水樣品采用固相萃取凈化，具體流程如下:用3 mL甲醇和3 mL水活化固相萃取小柱;將10 mL廢水樣品通過小柱，用5 mL 5%氨水淋洗小柱，棄去流出液;用10 mL含2%(v/v)甲酸的甲醇溶液將目標(biāo)物從小柱中洗脫出來，收集洗脫液，取1 mL待測。

1.3 色譜條件

柱溫40℃;流速0.25 mL/min;進樣量5.0 μL;分離時間 3 min。流動相:乙腈-水(90∶10，v/v)。苦味酸、苦氨酸的保留時間分別為0.86和1.13 min。苦味酸和苦氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

1.4 質(zhì)譜條件

三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);電噴霧電離(ESI)正離子電離模式;毛細管電壓3.0 kV;離子源溫度100℃;脫溶劑氣溫度200℃;脫溶劑氣流量450 L/h;錐孔氣流量50 L/h，各目標(biāo)化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

圖1 苦味酸和苦氨酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的HILIC色譜圖Fig.1 HILIC chromatogram of picric acid and picramic acid

表1 苦味酸、苦氨酸的LC-MS參數(shù)Table 1 LC-MS parameters of picric acid and picramic acid

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

親水色譜柱是近年來發(fā)展起來的針對強極性化合物的新型液相色譜柱。本文對比了反相C18色譜柱(Acquity UPLC BEH C18 column，100 mm ×2.1 mm，1.7 μm)和親水作用色譜柱(Acquity UPLC BEH HILIC column，100 mm ×2.1 mm，1.7 μm)對苦味酸的保留，結(jié)果見圖2。

圖2 不同色譜柱分析苦味酸的UPLC-MS/MS色譜圖Fig.2 UPLC-MS/MS chromatograms of picric acid with different columns

從圖2可以看出，在HILIC色譜柱中，采用乙腈/水體系分析苦味酸，不僅實現(xiàn)了強極性化合物的保留，而且靈敏度極高，峰形良好，無須使用緩沖鹽;在同樣的等度流動相情況下，苦味酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在C18色譜柱中出現(xiàn)一個很寬的延展峰，無法實現(xiàn)有效保留。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件的優(yōu)化是通過在流動注射模式下對1.0 mg/L的兩種物質(zhì)單獨進樣完成的。首先比較了ESI和大氣壓化學(xué)電離(APCI)兩種電離源。在SIM模式下，ESI中兩種化合物的靈敏度明顯高于APCI，這與ESI更適用于極性物質(zhì)的結(jié)論相符［11］。在MRM模式中，苦味酸和苦氨酸最主要的子離子都是m/z 181.7，對于苦味酸是［M －H －NO2］－，對于苦氨酸是［M －OH］－，二級質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 苦味酸和苦氨酸的二級質(zhì)譜圖Fig.3 MS/MS spectra of picric acid and picramic acid

2.3 前處理條件的優(yōu)化

在對廢水樣品進行處理時，選取了適合強酸性物質(zhì)的Oasis MAX固相萃取小柱進行萃取。由于本方法的檢測靈敏度足夠高，本研究未進行復(fù)雜的樣品濃縮富集，簡化了樣品前處理流程，既縮短了檢測時間，又提高了檢測準(zhǔn)確度。在低、中、高3種濃度水平下同時添加兩種化合物標(biāo)準(zhǔn)品(加標(biāo)質(zhì)量濃度為 1.0、10.0、100.0 μg/L)，在地表水樣品中的回收率為89%～107%，在廢水樣品中的回收率為72%～101%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過20%。

2.4 方法驗證

實驗室空白和方法空白均未檢出目標(biāo)化合物。以2.0、20.0、100.0 μg/L空白加標(biāo)溶液做6次平行試驗，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.9%～14.7%。以空白實際水樣為基質(zhì)，添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過低濃度曲線外推法確定檢出限(三倍信噪比)，苦味酸和苦氨酸的檢出限分別為0.1和0.3 μg/L，滿足國家地表水標(biāo)準(zhǔn)限值要求［12］。

2.5 實際樣品檢測

在15個地表水樣品中均未檢出苦味酸和苦氨酸，在6個采礦場周圍水域樣品中苦味酸檢測結(jié)果為未檢出～59.5 μg/L;苦氨酸檢測結(jié)果為未檢出～12.3 μg/L。

3 結(jié)論

本研究采用HILIC色譜柱實現(xiàn)了強極性物質(zhì)苦味酸在液相色譜中的有效保留。地表水樣品直接進樣即可檢測，廢水樣品也只需通過SPE凈化而無需濃縮。串聯(lián)質(zhì)譜法對苦味酸和苦氨酸定性準(zhǔn)確。本方法操作簡便，選擇性好，靈敏度高，分析速度快，適用于地表水、生活污水、工業(yè)廢水等多種實際水樣的檢測。

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