杭柏林,孟令輝,胡建和,王青,徐彥召,張慶華,魏曉曉

（1.河南科技學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003；2.輝縣市畜牧局,河南輝縣453600）

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）理論與技術(shù)的不斷發(fā)展,從整體水平和動態(tài)水平上認(rèn)識組織、器官、生物群落或生態(tài)環(huán)境中的各種生命現(xiàn)象或生物學(xué)規(guī)律已經(jīng)實現(xiàn)[1-2].蛋白質(zhì)組學(xué)中最重要的技術(shù)就是對混合樣品中蛋白質(zhì)的分離,而后進(jìn)行鑒定.雙向電泳（two dimensional gel electrophoresis,2-DE）技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中最經(jīng)典的蛋白分離方法[3].雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜（massspectrometry,MS）技術(shù)在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域已經(jīng)得到了多方面的應(yīng)用[1,4-5].肝臟（liver）是機(jī)體的重要器官之一,執(zhí)行著代謝等功能.據(jù)估計,在任意給定的時間點,有超過10 000個生物化學(xué)反應(yīng)在肝臟中發(fā)生[6].然而,肝臟也易受到外界各種異物的危害,進(jìn)而導(dǎo)致肝臟損傷.某些病原如禽多殺性巴氏桿菌、禽白血病病毒、馬立克病病毒、組織滴蟲等感染均可造成肝臟的損傷[7].因此,研究雞肝臟蛋白質(zhì)組雙向電泳技術(shù)具有重要意義.

雙向電泳試驗操作繁瑣,很多環(huán)節(jié)會影響到試驗結(jié)果的可靠性、重復(fù)性與再現(xiàn)性[5].因此,針對不同的樣品需要根據(jù)不同的試驗條件摸索出比較切實可行的試驗條件.本文以SPF雞的肝臟為研究對象,對可能影響因素進(jìn)行了優(yōu)化,成功建立了雞肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳技術(shù),為后續(xù)研究各種病原感染致雞肝臟損傷病理機(jī)制等方面提供了可靠的技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 試劑

尿素、CHAPS、三羥甲基氨基甲烷（Tris Base）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、甘氨酸（glycine）、丙烯酰胺（acrylamide）、甲叉雙丙烯酰胺（methylene bisacrylamide）、過硫酸銨（APS）、四甲基乙二胺（TEMED）、考馬斯亮藍(lán)G-250為 AMRESCO公司產(chǎn)品.二硫蘇糖醇（DTT）為上海生工公司產(chǎn)品.碘乙酰胺（iodoacetamide）、礦物油、雙向電泳蛋白定量試劑盒（Protein Assay）為Bio-Rad公司產(chǎn)品.IPG緩沖液（Bio-Lyte）、IPG干膠條為GE公司產(chǎn)品.低熔點瓊脂糖（agarose）、蛋白酶抑制劑雞尾酒混合液（Protease Inhibitor Cocktail）為Sigma公司產(chǎn)品.鹽酸、磷酸、冰乙酸、甲醇、硫酸銨及其他試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 儀器

試驗用到的儀器主要有超聲破碎儀（Vibra Cell）、高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）、紫外分光光度儀（NanoDrop1000）、渦旋儀（Scientific Industries）、水平搖床（HY-4）、超低溫冰箱（Thermo）、水化槽（GE Healthcare）、等電聚焦儀（GEHealthcare）、垂直電泳儀（GEHealthcare）、低溫水循環(huán)系統(tǒng) GEHealthcare）、純水儀（Millipore）、掃描儀（UMAX）等,數(shù)據(jù)分析采用 PDQuest8.0.1圖像分析軟件（Bio-Rad）.

1.3 試劑溶液的配制

樣品裂解液和水化液、Tris-HCl、平衡緩沖液、SDS電泳緩沖液、30%聚丙烯酰胺貯液、1%溴酚藍(lán)儲備溶液、10%SDS、瓊脂糖封膠液等試劑溶液均按照GE公司的推薦配方進(jìn)行配置.10%過硫酸銨和固定液（V（水）∶V（乙醇）∶V（乙酸）=5∶4∶1）現(xiàn)配現(xiàn)用.膠染色液（1 L）：去離子水 100mL,H3PO4100mL,充分混勻；（NH4）2SO4100 g,邊攪拌邊加入,充分溶解；加入考馬斯亮藍(lán)G-250 1.2 g,長時間攪拌溶解；去離子水定容至800mL,邊攪拌邊加入甲醇200mL；終體積1 000mL；分裝后室溫保存.

1.4 雞肝臟樣品的采集

30日齡SPF白萊航雞頸靜脈放血后,剖開胸腹腔,取肝臟組織一小塊,置于冷的滅菌去離子水中,清洗10 s左右,置于濾紙上吸干水分,放入凍存管中,置液氮中保存.

1.5 雞肝臟總蛋白的制備

從液氮中取出肝臟組織,置預(yù)冷的清潔研缽中,研磨成粉末；取0.1mg左右的粉末加入裂解液1mL,用移液器吹吸混勻；渦旋儀上混搖2 min,放冰上,置旋轉(zhuǎn)搖床上搖30 min,重復(fù)4次；超聲裂解,30Amplitute,3min,9 s/pulse,重復(fù)4次；15 000 r/min,30min,16℃；取中間層于另一個EP管中；15 000 r/min,15min,16℃；取上層于另一個EP管中；分裝,置-70℃保存.

1.6 蛋白定量

為保證蛋白上樣量的一致性,對提取的總蛋白進(jìn)行定量.應(yīng)用BIO-RADProtein Assay試劑盒對提取的肝臟蛋白進(jìn)行Bradford法[8]測定.定量后的蛋白溶液進(jìn)行分裝,-70℃保存.

1.7 IPG膠條的水化及等電聚焦

膠條水化：將膠條從-20℃取出,室溫下放置20~30min；將蛋白樣品與水化液混合,終體積400μL,充分混合,室溫靜置15min；15 000 r/min,15min,16℃；取上層液體,均勻線性加入水化槽中；去除膠條保護(hù)膜,將膠面與液面接觸,避免產(chǎn)生氣泡；將水化槽置于水平位置,水化12 h以上.

等電聚焦：將水化好的膠條置于聚焦槽的相應(yīng)位置,對好正負(fù)極；將浸泡過去離子水的電極紙放在膠條的兩端,與膠面接觸；加上礦物油,防止聚焦過程中水分蒸發(fā)；在膠條兩端的電極紙上加上電極板；蓋上蓋子,啟動電源,設(shè)置并啟動等電聚焦程序（見表1）.

表1 等電聚焦程序Tab.1 Program of isoelectric focusing electrophoresis

1.8 膠條平衡

膠條分2次平衡：將膠條置于去離子水中5 s左右,去除表面礦物油；將膠條置于濾紙上,先水平再垂直,避免膠面與濾紙的接觸,去除多余水分；將膠條置于平衡管中,加入平衡液10mL（含1%DTT）,置水平搖床上平衡15min；取出膠條,置于濾紙上,先水平再垂直,去除多余平衡液；將膠條置于另一個平衡管中,加入平衡液10mL（含2.5%碘乙酰胺）,置水平搖床上平衡15min；取出膠條,置于濾紙上,去除多余平衡液.

1.9 SDS-PAGE電泳

提前3~5 h配制好12%的SDS-PAGE凝膠,用去離子水清洗玻璃板,用1×SDS電泳緩沖液潤洗膠面,然后用濾紙吸去多余液體；將膠條在1×SDS電泳緩沖液中潤洗3~5 s,垂直置于濾紙上3~5 s；將膠條朝上置于長玻璃板上,用壓板輕輕向下推,置膠面上方0.5~1 cm處；在凝膠上方加入已融化好的低熔點瓊脂糖封膠液（約40℃）2~3mL；用膠板將膠條向下推,使其與凝膠面完全接觸,同時避免膠面與膠條之間產(chǎn)生氣泡,室溫下靜置10min；將凝膠板轉(zhuǎn)入電泳槽中,加上層電泳緩沖液；電泳：5W、30min,10W、4~6 h；待溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)底部邊緣約0.5~1 cm時,結(jié)束電泳.

1.10 固定與染色

將凝膠轉(zhuǎn)入固定液中,置于水平搖床上,輕輕搖晃2~3 h；用去離子水漂洗4次,15min/次；加入考馬斯亮藍(lán)G-250染色液,染色12 h以上；用去離子水漂洗至背景清楚.

1.11 圖像掃描與分析

凝膠用掃描儀進(jìn)行圖像透射掃描,分辨率為300 dpi；用PDQuest軟件過濾或去除圖像的背景和條紋,并檢測蛋白質(zhì)斑點數(shù).

2 結(jié)果與分析

2.1 肝臟蛋白制備率

使用1mL組織裂解液按照本研究的制備程序進(jìn)行了2次蛋白樣品制備,所制備的肝臟總蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度范圍在5.67~5.72mg/mL,表明提取蛋白的方法可靠.

2.2 不同長度膠條和蛋白上樣量的影響

為了選擇合適長度的IPG膠條,分別對24 cm pH3-10和18 cm pH3-11的IPG膠條的分離效果進(jìn)行了比較,結(jié)果如圖1所示.按照公司的推薦,18 cm膠條的蛋白最大上樣量為200μg,24 cm膠條的蛋白最大上樣量為400μg.

圖1 雞肝臟蛋白不同長度膠條雙向電泳結(jié)果Fig.1 2-DE results of chicken liver proteins using different long strips

從圖1可以看出,24 cm的IPG膠條的蛋白分離效果明顯好于18 cm的IPG膠條,蛋白點數(shù)明顯增多,特別是在上方高分子量區(qū)域.同時,還可以看出,當(dāng)?shù)鞍咨蠘恿吭黾雍?許多相同位置的斑點面積變得更大.基于蛋白分離的清晰及有利于圖像分析的考慮,選擇24 cm的IPG膠條進(jìn)行后續(xù)試驗.

2.3 不同聚焦時間和水化液中DTT的含量的影響

為了得到一個比較清晰的雙向電泳圖譜,需要對雙向電泳的參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化.在雙向電泳圖譜中,最常見到的是蛋白點的縱向拖尾和橫向拖尾.因此,需要對引起蛋白點橫向拖尾和縱向拖尾的因素進(jìn)行優(yōu)化.在本研究中,幾乎沒有出現(xiàn)縱向條紋,但出現(xiàn)了橫向條紋.本文主要對DTT含量和等電聚焦時間進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果如圖2所示.

圖2 聚焦時間和DTT的量對肝臟蛋白雙向電泳結(jié)果的影響Fig.2 Effects of time and DTT concentration on 2-DE of chicken liver proteins

由圖2可知,當(dāng)水化液中DTT含量一致時,等電聚焦時間越長,蛋白點拖尾的現(xiàn)象就越明顯.當(dāng)?shù)入娋劢箷r間一致時,水化液中DTT含量稍低時效果稍好一點.當(dāng)在8 000 V下等電聚焦伏特小時為45 000時,水化液中4mol/LDTT 2.5μL時,斑點的橫條紋幾乎沒有.因此,本文認(rèn)為8 000 V時等電聚焦伏特小時為45 000,同時水化液（500μL）中4mol/LDTT 2.5μL為雞肝臟雙向電泳的較優(yōu)的等電聚焦時間.

2.4 雞肝臟雙向電泳圖譜特征分析

圖2（C）是較好的雞肝臟蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜.從左至右,蛋白的等電點逐漸升高,從上到下,蛋白的分子量逐漸降低.酸性端的蛋白點比較多,而堿性端的蛋白點主要集中在低分子量部分.但是,在等電點大約7~8的地方,有比較模糊的區(qū)域,這個現(xiàn)象在多次的試驗中均如此.通過軟件分析,可以至少檢測到1 200多個點.

3 結(jié)論與討論

在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究技術(shù)中,雙向電泳（又稱二維電泳）是最常用的一種技術(shù).雙向電泳是利用蛋白質(zhì)的等電點和相對分子量的差異將各種蛋白質(zhì)分離開來的一種有效手段.肝臟是機(jī)體的重要器官之一,是機(jī)體內(nèi)多種重要信息調(diào)控分子的集散地,執(zhí)行著物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)化等多種生命功能.而生命功能的主要執(zhí)行者是蛋白.因此,建立雞肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)二維電泳方法對研究和探尋雞在收到不同刺激（如病原感染、營養(yǎng)差異、中毒等）后肝臟中的差異蛋白及為揭示這種刺激的機(jī)制具有重要意義.

在本研究中,使用GE公司雙向電泳的各種試劑配方較快捷地對雞肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳方法進(jìn)行了優(yōu)化.在優(yōu)化過程中,使用了18 cm和24 cm的膠條.18 cm膠條的電泳圖譜上沒有橫向拖尾,但在右側(cè)上方區(qū)域有不是很明顯的縱向拖尾,同時中間部分有幾乎空白的不清晰區(qū)域.而24 cm膠條的電泳圖譜上沒有縱向拖尾,但有少部分的橫向拖尾；18 cm膠條的電泳圖譜上中間不清晰區(qū)域在24 cm膠條的電泳圖譜上呈現(xiàn)出較多的蛋白點.因此,選擇24 cm的膠條繼續(xù)進(jìn)行優(yōu)化,以最大可能消除橫向拖尾.

雙向電泳中蛋白點的橫向拖尾可由很多因素造成[9],如樣品的制備及預(yù)處理、等電聚焦程序、蛋白的溶解性、殘留多量核酸、鹽濃度過高、聚焦不足或過度、上樣量過大、膠條表面殘留蛋白以及過多的DTT等.本研究通過多次超聲裂解和多次離心以去除不溶解的顆粒和核酸以便保證樣品中的蛋白均處于溶解狀態(tài),通過長時間的主動水化和聚焦后用去離子水徹底清除膠條表面的殘留蛋白以及使用公司推薦的上樣量基本上達(dá)到了試驗要求.同時,本研究對等電聚焦程序、聚焦時間、除鹽、DTT含量進(jìn)行了重點優(yōu)化.在等電聚焦早期,低電壓具有除鹽的作用.本實驗中,將等電聚焦時低電壓維持了較長時間,充分達(dá)到了除鹽的目的.對聚焦時間和DTT含量的優(yōu)化結(jié)果表明,在雞肝臟雙向電泳中,水化液（500μL）中2.5μL 4mol/LDTT和45 000 Vh的聚焦是較優(yōu)的條件,成功減少了橫向拖尾的出現(xiàn).

本文通過對膠條的長度和等電聚焦程序以及水化液中DTT的量進(jìn)行了簡單的優(yōu)化,初步建立了雞肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)雙向電泳方法,為后續(xù)研究雞肝臟的功能及病原對肝臟的損傷機(jī)制提供了有效方法.

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