陳豫,褚倩,郭娟,黃玉,李文雯,田逸俊,夏曙,于世英

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤科,武漢 430030)

·藥物研究·

依維莫司對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549放射增敏作用*

陳豫,褚倩,郭娟,黃玉,李文雯,田逸俊,夏曙,于世英

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤科,武漢 430030)

目的 通過(guò)使用哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白mTOR抑制藥依維莫司抑制A549細(xì)胞mTOR信號(hào)通路,研究依維莫司是否具有放射增敏作用。方法單純放射治療(放療)或聯(lián)合依維莫司作用于人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549,采用噻唑藍(lán)(MTT)法測(cè)定依維莫司對(duì)A549細(xì)胞抑制率并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。應(yīng)用藥物20%抑制濃度(IC20)作用24 h后X線2,4,6,8 Gy照射。計(jì)算細(xì)胞克隆存活分?jǐn)?shù)及多靶單擊模型擬合生存曲線,并計(jì)算平均致死劑量(D0)、準(zhǔn)閾劑量(Dq)、照射劑量2 Gy下細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(SF2)和放射增敏比(SER)。采用Western blot方法檢測(cè)γ-H2AX蛋白的表達(dá),并分析相對(duì)灰度值。結(jié)果依維莫司聯(lián)合放療可明顯提高A549細(xì)胞對(duì)射線的敏感性,依維莫司+照射組D0、Dq及SF2均明顯低于單純照射組,SER為1.36。依維莫司+照射組X線照射后24 h點(diǎn)γ-H2AX蛋白殘余量明顯高于單純照射組。結(jié)論依維莫司抑制mTOR信號(hào)通路能夠提高A549細(xì)胞的放射敏感性。

依維莫司;癌,非小細(xì)胞肺;放射增敏;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

放射治療(radiotherapy,放療)是非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)治療的重要手段。近年來(lái),各種分子靶向藥物運(yùn)用于放射增敏的基礎(chǔ)研究,以期提高放療效果,但目前臨床上尚無(wú)一種小分子抑制劑類藥物運(yùn)用于肺癌放射增敏治療[1]。依維莫司(everolimus,RAD001)作為口服的小分子哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)抑制藥,已獲得美國(guó)食品藥品管理局(Food and Drug Administration,FDA)批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性腎癌的治療。在NSCLC中,也已開(kāi)展依維莫司單藥治療ⅢB/Ⅳ期NSCLC患者的Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)[2]。因此,筆者以人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞系為研究對(duì)象,使用依維莫司抑制mTOR通路,以期提高A549細(xì)胞放射敏感性,并探討mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在放射增敏中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 依維莫司由諾華公司提供;H2AX抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology;γ-H2AX抗體(pS139)購(gòu)自EPITOMICS;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;噻唑藍(lán)(thiazolyl blue, MTT)試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司; RS2000型實(shí)驗(yàn)用生物學(xué)X線輻照儀(美國(guó)RAD SOURCE公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549為人肺腺癌細(xì)胞株,為本實(shí)驗(yàn)室保存的單層貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞,使用含10%胎牛血清的Roswell Park Memorial Institute 1640(RPMI 1640)培養(yǎng)液,于37℃、5%二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 依維莫司對(duì)A549細(xì)胞的增殖抑制作用 采用MTT法測(cè)定依維莫司對(duì)A549細(xì)胞抑制率。確定放射增敏濃度。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞以適當(dāng)濃度接種于96孔板,培養(yǎng)過(guò)夜貼壁后,加入依維莫司濃度分別為0.1,1,10,100,1 000 nmol·L-1的培養(yǎng)液。藥物作用72 h后,吸去含藥物的培養(yǎng)液,每孔更換新鮮無(wú)血清培養(yǎng)液100μL并加入MTT 10μL,37℃避光培養(yǎng)4 h,去掉MTT加入二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)每孔100μL,水平搖床上搖動(dòng)15 min,酶標(biāo)儀波長(zhǎng)492 nm測(cè)定吸光度(A)值,計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=(加藥組A值-空白組A值)/(未加藥組A值-空白組A值)。按藥物效應(yīng)中效方程式法計(jì)算藥物半數(shù)抑制濃度(50%inhibition concentration,IC50)。

1.4 細(xì)胞照射 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞置于生物學(xué)X線輻照儀樣品箱中,設(shè)備常用輸出劑量為1 Gy·min-1,根據(jù)所需劑量設(shè)置照射時(shí)間。

1.5 克隆形成法測(cè)定依維莫司對(duì)A549細(xì)胞的放射增敏作用 取依維莫司的20%細(xì)胞抑制濃度(20% inhibition concentration,IC20)為藥物增敏濃度[3]。實(shí)驗(yàn)分組為:單純照射組、依維莫司+照射組,每組設(shè)置復(fù)皿3個(gè)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿,加入含有藥物的培養(yǎng)液作用24 h,0,2,4,6,8 Gy X線照射細(xì)胞后更換不含藥物培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)14 d。每皿加入甲醇溶液1 mL固定細(xì)胞20 min,結(jié)晶紫染色15 min。自然干燥后計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆(50個(gè)/克隆),計(jì)算集落形成率(plating efficiency,PE)及細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(surviving fraction,SF)。PE(%)=空白對(duì)照組集落數(shù)/空白對(duì)照組接種細(xì)胞數(shù)×100%;SF=某一劑量照射實(shí)驗(yàn)組的集落數(shù)/該組細(xì)胞接種數(shù)×PE。加藥照射組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)均用單純給藥組細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)校正,以消除藥物作用對(duì)SF的影響。

1.6 細(xì)胞蛋白表達(dá)檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按上述分組給藥作用24 h,X線4 Gy照射細(xì)胞后,于0,30, 60 min和4,12,24 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行處理。細(xì)胞裂解液(50 mmol·L-1Tris-鹽酸,150 mmol·L-1氯化鈉,1% NP-40,0.5%去氧膽酸鈉,0.02%疊氮鈉,0.1%十二烷基硫酸鈉,100μg·mL-1苯甲基磺酰氟,1μg·mL-1抑肽酶,1%磷酸化酶抑制劑)提取細(xì)胞總蛋白,聚氰基丙烯酸正丁酯法測(cè)定蛋白濃度后加入上樣緩沖液,加熱變性后分裝保存于-80℃冰箱。取60μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)電泳,將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上,室溫封閉液(TBS+5%脫脂奶粉+0.5%聚山梨酯-20)封閉1 h,加入相應(yīng)濃度一抗(H2AX 1∶1 000,γ-H2AX 1∶5 000)4℃孵育過(guò)夜, TBS-T洗膜后加入1∶5 000辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育1 h,采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(enhanced chemiluminescene,ECL)曝光膠片,顯像。使用AlphaEaseFC系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度值分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 由SPSS18.0版統(tǒng)計(jì)軟件完成數(shù)據(jù)分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,t檢驗(yàn)比較兩組差異。以P＜0.05表示有差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GraphPad Prism 5進(jìn)行克隆形成實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析及多靶單擊模型曲線擬合,計(jì)算平均致死劑量(D0)、準(zhǔn)閾劑量(Dq)、照射劑量2 Gy下細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)(survival fraction at 2 Gy, SF2)和放射增敏比(sensitivity enhancement ratio,SER)。

2 結(jié)果

2.1 依維莫司對(duì)A549細(xì)胞抑制作用 依維莫司對(duì)A549細(xì)胞有明顯地抑制作用,且該作用存在劑量依賴性。根據(jù)藥物效應(yīng)中效方程式法計(jì)算藥物IC50,依維莫司的IC50為(74.6±1.1)nmol·L-1。通過(guò)中效作圖法,依維莫司的IC20約為0.8 nmol·L-1,取IC20為放射增敏濃度。

2.2 抑制mTOR提高A549細(xì)胞對(duì)射線的敏感性通過(guò)多靶單擊模型擬合細(xì)胞生存曲線發(fā)現(xiàn),依維莫司+照射組的D0、Dq及SF2均明顯低于單純照射組,且SER值為1.36。抑制mTOR后可明顯地提高A549細(xì)胞對(duì)射線的敏感性。結(jié)果見(jiàn)表1,圖1。

2.3 DNA雙鏈斷裂標(biāo)志γ-H2AX及H2AX蛋白表達(dá)變化 Western blot檢測(cè)兩組0,0.5,1,4,12及24 h點(diǎn)γ-H2AX蛋白表達(dá)。與單純照射組比較,依維莫司+照射組γ-H2AX蛋白表達(dá)持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng),在24 h點(diǎn)殘余量增高。結(jié)果見(jiàn)圖2,3。

表1 兩組多靶單擊模型擬合實(shí)驗(yàn)參數(shù)Tab.1 Fitted parameters ofmultitarget one-hitmodel in two groups

圖1 兩組A549細(xì)胞生存曲線圖Fig.1 Survival curves of A549 cells in two groups

圖2 兩組γ-H2AX蛋白表達(dá)變化電泳圖Fig.2 Electrophotogram ofγ-H2AX protein expression in two groups

圖3 兩組A549細(xì)胞γ-H2AX蛋白灰度值變化柱狀圖Fig.3 Histograms of the gray values ofγ-H2AX protein in A549 cells in two groups

3 討論

PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞一系列重要的生理活動(dòng),包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及生存[4],抑制這條通路治療腫瘤成為研究熱點(diǎn)之一[5]。絲氨酸-蘇氨酸激酶mTOR是蛋白質(zhì)合成的主要調(diào)節(jié)因子,在與細(xì)胞生長(zhǎng)及生存相關(guān)的其他重要進(jìn)程如血管發(fā)生及自噬中也起到關(guān)鍵作用[6]。mTOR在細(xì)胞中存在兩種不同功能的復(fù)合體,分別是mTORC1和mTORC2。mTORC1復(fù)合體由mTOR、Raptor、mLST8和PRAS40蛋白組成,對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素雷帕霉素及其類似物敏感[7]。作為雷帕霉素類似物,與前者相比,依維莫司在分子結(jié)構(gòu)上增加了羥乙基,使其水溶性更好,提高了口服吸收效率,因此具有更好的藥動(dòng)學(xué)效應(yīng)[8]。與雷帕霉素一樣,依維莫司在細(xì)胞內(nèi)與FK506結(jié)合蛋白-12(FKBP-12)形成復(fù)合體后被mTOR識(shí)別并抑制其活性[9]。其抑制作用也主要針對(duì)mTORC1,通過(guò)抑制mTOR的非正常激活可抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、生存及血管生成等[10]。

放射線可直接或間接作用于DNA,導(dǎo)致DNA損傷,其中DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break, DSBs)是最致命的。研究顯示當(dāng)DSBs產(chǎn)生后,人組蛋白H2A家族成員H2AX蛋白C端Ser殘基可被DNAPK及ATM等PI3K家族成員磷酸化。ROGAKOU等[11]通過(guò)研究首次發(fā)現(xiàn)這一現(xiàn)象并將磷酸化的H2AX定名為γ-H2AX。隨后的研究發(fā)現(xiàn),電離輻射后細(xì)胞中殘存的γ-H2AX的數(shù)量可代表未被修復(fù)的DNA雙鏈斷裂損傷的數(shù)量。如果損傷不能被及時(shí)正確地修復(fù)便可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,暴露后24 h殘存的γ-H2AX的數(shù)量越多則表示此腫瘤細(xì)胞對(duì)放療越敏感[12]。因此,筆者在本實(shí)驗(yàn)中選擇γ-H2AX作為檢測(cè)DSBs的指標(biāo),測(cè)定放療后腫瘤細(xì)胞損傷程度,評(píng)估依維莫司對(duì)人肺非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549放射增敏作用。

本研究結(jié)果顯示,依維莫司對(duì)A549細(xì)胞的IC50為(74.6±1.1)nmol·L-1,提示單用依維莫司具有藥物濃度依賴的抗腫瘤作用,相關(guān)機(jī)制可能是由于細(xì)胞周期蛋白(cyclins)尤其是cyclin D的減少抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent protein kinases, CDKs)的活化相關(guān)[13]。取IC20作為增敏濃度,研究結(jié)果顯示,在mTOR上游調(diào)控基因PIK3CA野生型的人肺非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549中,依維莫司具有明顯的增敏效果(SER=1.36)。相關(guān)機(jī)制可能是抑制mTOR后進(jìn)行照射,阻斷了mTOR依賴途徑的激活,抑制下游細(xì)胞修復(fù)相關(guān)基因的啟動(dòng),促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并抑制細(xì)胞增殖,增大了放射線引起的損傷效應(yīng)[14]。這一結(jié)果與KIM等[6]在張力蛋白同源物基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)缺失的非小細(xì)胞肺癌中的研究結(jié)論一致,mTOR抑制劑可抑制同源重組及非同源斷端鏈接兩種DNA損傷主要的修復(fù)方式,從而起到放射增敏作用。進(jìn)一步的蛋白研究顯示,依維莫司+照射組放療后24 h點(diǎn),γ-H2AX殘留量較單純照射組明顯增加,證實(shí)了前面克隆形成的結(jié)果。CHEN等[15]在使用雷帕霉素抑制乳腺癌細(xì)胞系MCF7 mTOR通路的研究中,也觀察到了類似現(xiàn)象。推測(cè)與抑制mTOR通路后,下調(diào)了染色體完整性相關(guān)的蛋白表達(dá),阻止DNA損傷修復(fù)等機(jī)制相關(guān)[16]。

綜上所述,依維莫司抑制mTOR通路聯(lián)合放療可增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549對(duì)射線的敏感性,說(shuō)明mTOR通路在肺癌細(xì)胞損傷修復(fù)中具有一定作用。但本研究目前僅限于mTOR上游調(diào)控基因PIK3CA基因野生型的細(xì)胞系中,若PIK3CA基因存在突變, mTOR處于持續(xù)激活狀態(tài),依維莫司是否具有放射增敏作用,仍有待進(jìn)一步研究。

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DOI 10.3870/yydb.2014.12.001

Effect of Everolimus on Radiosensitivity of Human Non-small Cell Lung Cancer Cell Line A549

CHEN Yu,CHU Qian,GUO Juan,HUANG Yu,LIWen-wen,TIAN Yi-jun,XIA Shu,YU Shi-ying
(Department ofOncology,Tongji Hospital,Tongji Medical College,Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430030,China)

Objective To explore the effect of mammalian target of rapamycin(mTOR)inhibitor everolimus on radiosensitivity of human non-small cell lung cancer cell line in vitro by using everolimus to inhibit mTOR signaling pathway of A549.MethodsHuman non-small cell lung cancer cell line A549 was subjected to radiation alone or in combination with everolimus treatment.The50%inhibition concentration(IC50)of everolimus in A549 cellswas detected bymethylthiazol tetrazolium (MTT)assay in vitro.Everolimus at the 20%inhibition concentration(IC20)was used to pretreat A549 cells for 24 h.Cells were then irradiated by X-ray with 2,4,6,8 Gy.The cell survival fraction was computed by clone formation.Cell survival curvewas fitted bymultitarget one-hit model,and mean lethal dose(D0),dose quasithreshold(Dq),survival fraction at 2 Gy(SF2),and sensitization enhancement ratio(SER)were calculated.The expression ofγ-H2AX was determined byWestern blotting and then the relative gray values were analyzed.ResultsEverolimus significantly improved the sensitivity of A549 cells to radiation.The D0, Dqand SF2of everolimus+irradiation group were significantly lower than those of irradiation group.The SER was1.36.The residual amount ofγ-H2AX protein in the everolimus+irradiation group was significantly higher than that of the irradiation group.ConclusionEverolimus inhibitingmTOR signaling pathway can increase the radiosensitivity of A549 cells.

Everolimus;Cancer,non-small cell lung;Radiosensitization;Signal transduction pathway

R979.1;R734.2

A

1004-0781(2014)12-1541-04

2014-04-15

2014-07-08

*吳階平醫(yī)學(xué)基金資助項(xiàng)目(320.6720. 10010);國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81301929,81372664)

陳豫(1984-),女,湖北武漢人,實(shí)習(xí)研究員,碩士,研究方向:腫瘤信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及腫瘤放射生物學(xué)。電話: 027-83663476,E-mail:veta.chen@163.com。

于世英(1955-),女,四川綿陽(yáng)人,教授,主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師,研究方向:腫瘤診斷與綜合治療。電話:027-83663676,E-mail:syyu@tjh.tjmu.edu.cn。