劉 然，蔣建軍，尚蘭琴，魏雪濤，吳 雙，郝衛(wèi)東

(1.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)系食品安全毒理學(xué)研究與評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191;2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)藥檢定所，北京 100125)

雙酚A(bisphenol A，BPA)是一種典型的環(huán)境雌激素，用于生產(chǎn)碳酸聚酯、環(huán)氧樹脂、聚苯乙烯樹脂以及殺真菌劑、抗氧化劑、染料等。隨著塑料制品的廣泛應(yīng)用，BPA造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染，此外BPA還可從聚碳酸酯塑料產(chǎn)品(如嬰兒奶瓶、食品包裝和水瓶等)中遷移到食物和飲料中，通過人類日常使用的生活用品及飲用水進(jìn)入人體內(nèi)［1］。美國疾病預(yù)防控制中心研究估計(jì)約95%美國人的尿液中可以檢測(cè)到BPA［2］，此外，還可以在孕婦血清、羊水、胎盤組織和臍帶血中檢測(cè)到BPA，說明胚胎也可能在一定程度上暴露于BPA［3］。

許多研究表明，發(fā)育期胚胎對(duì)外源化學(xué)物的敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于成年人［1］。盡管沒有直接的證據(jù)證明BPA對(duì)人類發(fā)育有不良影響，但多項(xiàng)嚙齒類動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究顯示，孕期和(或)哺乳期暴露BPA可以降低子代動(dòng)物的存活率、出生體重，抑制其早期生長［4］。本課題組之前的研究也表明 BPA≥20 μg·mL－1可抑制大鼠胚胎肢芽和中腦微團(tuán)細(xì)胞的增殖和集落分化［5］，但是其機(jī)制目前還不清楚。

雌激素對(duì)胚胎發(fā)育產(chǎn)生重要影響，在發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期暴露在外源性雌激素干擾物下，會(huì)影響正常的發(fā)育［6］。BPA可通過與雌激素受體(estrogen receptor，ER)結(jié)合或通過影響細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等其他方式模擬或干擾內(nèi)源性雌激素作用，發(fā)揮擬雌激素樣效應(yīng)［7］。研究表明，ER參與低劑量BPA對(duì)睪丸支持細(xì)胞的促增殖作用［8］;BPA可上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)基因表達(dá)，抑制抗增殖基因的表達(dá)，從而促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖，且此效應(yīng)能被ER抑制劑逆轉(zhuǎn)［9］;BPA可以通過ER途徑抑制小鼠卵子發(fā)生時(shí)印記基因的甲基化［10］。本研究旨在探討ER途徑在BPA對(duì)大鼠胚胎中腦微團(tuán)細(xì)胞毒性中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)成年健康未育Sprague-Dawley大鼠，體質(zhì)量200～220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。于屏障環(huán)境中飼養(yǎng)(溫度:20～26℃，相對(duì)濕度:40% ～70%)，12 h明暗交替循環(huán)，自由進(jìn)食飲水。于18:00雌、雄合籠交配，次日清晨進(jìn)行陰道涂片檢查，查到精子的動(dòng)物定為妊娠第0天。

1.2 主要試劑

BPA(純度 97%)，雌激素受體抑制劑ICI182780，他莫西芬(tamoxifen，TAM)均購自美國Sigma公司;Ham'F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司;二甲基亞砜(DMSO)，中性紅和阿利新藍(lán)購自美國Amresco公司;Trizol Up購自全式金公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Premix ExTag購自日本TaKaRa公司;ERα和β肌動(dòng)蛋白抗體購自美國 Santa Cruz公司，ERβ抗體購自 Abcam公司。

1.3 細(xì)胞制備

孕鼠于妊娠第13天經(jīng)CO2麻醉后脫頸處死，消毒后剖腹，取出子宮分離出胚胎，將胚胎轉(zhuǎn)移至37℃Hank's液中，于解剖顯微鏡下分離中腦。組織塊用37℃PBS洗3次后，放入PBS中37℃孵育20 min，然后棄去PBS，加入0.25%胰蛋白酶，再于37℃孵育10 min。加入Ham's F12培養(yǎng)液(胎牛血清∶谷氨酰胺∶青/鏈霉素為88∶10∶1∶1)終止消化，再用培養(yǎng)液洗3次后，吸凈。加入一定容量的培養(yǎng)液，用200 μL移液槍頭反復(fù)吹吸黏稠的組織塊，至組織塊完全吹散。過200目細(xì)胞篩后，用臺(tái)盼藍(lán)記數(shù)細(xì)胞存活率在90%以上，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度至5 ×109L－1。

1.4 中性紅攝取法檢測(cè)細(xì)胞存活

96孔板每孔加入5 μL制備好的細(xì)胞懸液，2～3 h后染毒，BPA濃度分別為0(溶劑對(duì)照)、10－12、10－10、10－8、10－6和 10－4mol·L－1，于 37℃，5%CO2和100%濕度的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)5 d后去除培養(yǎng)液，加入 200 μL 4.5%戊二醛固定 20 min，生理鹽水清洗3次后加入200 μL 0.05%中性紅，室溫孵育30 min。棄去中性紅，生理鹽水清洗3次后用酸性乙醇提取2 h，540 nm進(jìn)行比色測(cè)量吸光度值(A)。細(xì) 胞 存 活 率 (%)=A染毒組/A溶劑對(duì)照組×100%。

1.5 蘇木精染色法檢測(cè)中腦細(xì)胞分化形成的集落總面積

按照1.4項(xiàng)分組處理的細(xì)胞，經(jīng)不同濃度BPA染毒5 d后加入4%甲醛固定后，用Harries蘇木精染色10 s，棄蘇木精，將96孔板浸于蒸餾水中返藍(lán)15 min，風(fēng)干后于倒置顯微鏡下照相，利用Image圖像處理軟件計(jì)算中腦細(xì)胞分化形成的集落總面積。集落分化百分比(%)=染毒組集落總面積/溶劑對(duì)照組集落總面積×100%。

1.6 檢測(cè)雌激素受體抑制劑和BPA共同培養(yǎng)對(duì)中腦微團(tuán)細(xì)胞存活和集落分化的影響

96孔板每孔加入5 μL制備好的細(xì)胞懸液，2～3 h 后染毒，分別加入溶劑對(duì)照、BPA 0.1 mmol·L－1、ICI182780 0.1 nmol·L－1、TAM 1 nmol·L－1、BPA 0.1 mmol·L－1+ICI182780 0.1 nmol·L－1、BPA 0.1 mmol·L－1+TAM 1 nmol·L－1共同培養(yǎng)5 d，按照1.4和1.5項(xiàng)檢測(cè)細(xì)胞存活率及集落總面積。

1.7 檢測(cè)正常組織細(xì)胞中ER蛋白和mRNA表達(dá)

1.7.1 Western blot法檢測(cè)正常組織細(xì)胞中ER蛋白的表達(dá)

6孔板每孔加入300 μL制備好的中腦細(xì)胞懸液(方法同1.3)，細(xì)胞接種完畢后將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中，貼壁2～3 h后加培養(yǎng)液培養(yǎng)到第5天，棄去培養(yǎng)液，用PBS清洗3次，加入適量蛋白裂解液(每106個(gè)細(xì)胞加入200 μL裂解液)。于冰上裂解30 min后，4℃下離心12 000×g 15 min，取上清。分別取100 mg胎齡18 d(gestation day 18，G18)的胎鼠腦組織和成年雄性大鼠睪丸組織，各加1 mL蛋白裂解液，于冰上裂解30 min后，12 000×g 4℃離心15 min，取上清。上述制備的樣品以50 μg總蛋白含量進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，之后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，5%的脫脂奶粉室溫封閉2 h后，一抗4℃雜交過夜，后再進(jìn)行辣根過氧化物酶修飾的山羊抗兔的二抗標(biāo)記，室溫封閉2 h，最后用化學(xué)發(fā)光法曝光顯影，得到蛋白條帶。用Quantity One軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析，目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白條帶積分光密度值/內(nèi)參β肌動(dòng)蛋白條帶積分光密度值。

1.7.2 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)正常組織細(xì)胞中ER mRNA的表達(dá)

細(xì)胞培養(yǎng)方法同1.7.1，未經(jīng)BPA染毒的中腦細(xì)胞體外培養(yǎng)5 d后棄去培養(yǎng)液，按照Trizol Up使用說明書提取細(xì)胞總RNA。分別取100 mg E13、E18胎鼠腦組織、成年大鼠睪丸和卵巢組織，各加1 mL Trizol Up裂解液提取組織總RNA。各取上述總RNA樣品500 ng進(jìn)行cDNA第一鏈合成。參照熒光定量PCR試劑盒說明進(jìn)行基因表達(dá)的檢測(cè)，引物序列見表1。采用2－△△Ct法進(jìn)行基因表達(dá)相對(duì)定量，以卵巢組織作為參照因子，計(jì)算其他各組織中ER表達(dá)量經(jīng)GAPDH校正后相對(duì)于卵巢的表達(dá)量。

Tab.1 Primers for Real-time PCR

1.8 實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)BPA染毒中腦細(xì)胞中Notch1和Hes1 mRNA的表達(dá)

6孔板每孔加入300 μL制備好的中腦細(xì)胞懸液(方法同1.3)，細(xì)胞接種完畢后將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中，2～3 h后染毒，BPA濃度分別為0(溶劑對(duì)照)和0.1 mmol·L－1。分別在細(xì)胞培養(yǎng)第 2，3，4和5天按1.7.2項(xiàng)進(jìn)行細(xì)胞總RNA的提取、cDNA第一鏈的合成以及Notch1和Hes1 mRNA表達(dá)的檢測(cè)。采用2－△△Ct法進(jìn)行基因表達(dá)相對(duì)定量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。在滿足正態(tài)分布和方差齊性的條件下，各劑量組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析和Tukey's兩兩比較檢驗(yàn)方法，統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水平α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BPA對(duì)中腦微團(tuán)細(xì)胞存活和集落分化的影響

如圖1所示，中腦微團(tuán)細(xì)胞分別在含普通胎牛血清的培養(yǎng)體系和含無雌激素胎牛血清(經(jīng)活性炭處理過)的培養(yǎng)體系中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與溶劑對(duì)照相比，BPA 10－12～10－6mol·L－1對(duì)細(xì)胞存活和集落分化百分比均沒有明顯的影響，BPA 10－4mol·L－1染毒組細(xì)胞存活率為(64.05±5.30)%(P＜0.05)、集落分化百分比(51.90 ±13.82)%(P ＜0.05)。說明培養(yǎng)體系中含有的雌激素不影響B(tài)PA對(duì)中腦微團(tuán)細(xì)胞的毒性作用，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中采用普通胎牛血清配制培養(yǎng)體系，選擇對(duì)中腦微團(tuán)細(xì)胞存活和集落分化影響最為顯著的 BPA 0.1 mmol·L－1進(jìn)行研究。

2.2 雌激素受體抑制劑和BPA共同培養(yǎng)對(duì)中腦微團(tuán)細(xì)胞存活和集落分化的影響

如圖2、圖 3 所示，BPA 0.1 mmol·L－1可以顯著抑制中腦微團(tuán)細(xì)胞的存活和集落分化(表現(xiàn)為集落形成的總面積減少)。ER抑制劑 ICI182780(0.1 nmol·L－1)和 TAM(1 nmol·L－1)均不影響中腦微團(tuán)細(xì)胞的存活和集落分化，但亦不能逆轉(zhuǎn)BPA對(duì)中腦微團(tuán)細(xì)胞存活和集落分化的抑制作用，說明BPA對(duì)中腦微團(tuán)細(xì)胞存活和集落分化的抑制作用可能不是通過ER途徑介導(dǎo)的。

Fig.1 Effect of bisphenol A(BPA)on cell viability(A)and foci differentiation(B)of midbrain(MB)cells under charcoal-treated or charcoal-untreated sera.MB cells were prepared from rat embryonic midbrain on gestation day 13.MB cells were incubated with BPA for 5 d. ±s，n=6.*P ＜0.05，compared with solvent control.

Fig.2 Effects of ICI182780 0.1 nmol·L －1(A，C)and TAM 1 nmol·L －1(B，D)on the inhibition of cell viability(A，B)and foci differentiation(C，D)in MB cell induced by BPA 0.1 mmol·L －1.±s，n=6.*P ＜0.05，compared with solvent control.

Fig.3 Effects of ICI182780 and TAM on the inhibition of foci differentiation in MB cell induced by BPA.A:solvent control;B:BPA 0.1 mmol·L－1;C:ICI182780 0.1 nmol·L－1;D:TAM 1 nmol·L－1;E:BPA 0.1 mmol·L－1+ICI182780 0.1 nmol·L－1;F:BPA 0.1 mmol·L －1+TAM 1 nmol·L －1 .

2.3 正常組織及中腦微團(tuán)細(xì)胞中 ER蛋白和mRNA的表達(dá)

如圖4所示，與陽性對(duì)照(成年大鼠的睪丸組織)相比，G18胚胎腦組織和中腦微團(tuán)細(xì)胞中ERα和ERβ蛋白表達(dá)水平較低(P＜0.05)。睪丸組織、G18胚胎腦組織和中腦微團(tuán)細(xì)胞中ERα相對(duì)表達(dá)量分別為 1.57 ± 0.23，0.35 ± 0.12 和 0.41 ±0.08;ERβ 相對(duì)表達(dá)量分別為0.87 ±0.06，0.56 ±0.07和0.47±0.11。熒光定量 PCR 法對(duì) G13和G18胎鼠腦組織及未經(jīng)BPA染毒的中腦細(xì)胞中ERα和ERβ mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，結(jié)果如圖5所示，與ERα高表達(dá)的睪丸組織相比，胚胎腦組織和中腦微團(tuán)細(xì)胞中ERα mRNA表達(dá)水平極低，約為其1/400;與ERβ高表達(dá)的卵巢組織相比，胚胎腦組織和中腦微團(tuán)細(xì)胞中ERβ mRNA表達(dá)水平很低，約為其1/10。

Fig.4 Protein expression levels of ERα and ERβ in normal adult testis，brain of gestation day 18(G18)and MB cells.Lane 1:adult testis;lane 2:embryonic brain of G18;lane 3:MB cells.

Fig.5 The mRNA expression levels of ERα and ERβ in normal adult testis，ovary，brain of G18 and G13 and MB cells.±s，n=3.*P ＜0.05，compared with ovary

2.4 BPA對(duì)中腦微團(tuán)細(xì)胞Notch1和Hes1 mRNA表達(dá)水平的影響

如圖6 所示，BPA 0.1 mmol·L－1染毒組中腦微團(tuán)細(xì)胞在體外培養(yǎng)第2至5天Hes1 mRNA的表達(dá)水平為對(duì)照組的1.97～2.61倍，Notch1 mRNA表達(dá)水平僅在培養(yǎng)第2天有顯著增加，為對(duì)照組的2.68 倍。

Fig.6 Effect of BPA on mRNA expression levels of Notch1 and Hes1 by real-time PCR.±s，n=5.*P ＜0.05，compared with solvent control.

3 討論

本研究結(jié)果表明，BPA 0.1 mmol·L－1可以抑制中腦微團(tuán)細(xì)胞的存活和集落分化，提示BPA具有潛在的發(fā)育毒性。根據(jù)以往的文獻(xiàn)報(bào)道［11－12］，ICI182780 0.1 nmol·L－1和 TAM 1 nmol·L－1可以拮抗ER且不會(huì)抑制細(xì)胞的存活和分化。本研究結(jié)果顯示，ICI182780和TAM均不能阻斷BPA對(duì)細(xì)胞存活和分化的抑制作用。Lee等［11］發(fā)現(xiàn)BPA在100 ～500 μmol·L－1劑量范圍內(nèi)顯著抑制了 PC12細(xì)胞和皮質(zhì)神經(jīng)元的分化和存活，這種毒性不能被ER阻斷劑逆轉(zhuǎn);將微量的BPA作用于表達(dá)ER的MCF-7細(xì)胞和不表達(dá)ER的C4-12細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)至少有15種基因表達(dá)的變化不依賴于ER［13］;低劑量BPA能夠?qū)π律∈蟮纳窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生雙向影響，加入ER阻斷劑ICI182780后此效應(yīng)沒有發(fā)生改變［12］。上述研究結(jié)果均說明BPA可以不通過ER途徑發(fā)揮作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，蛋白和mRNA的表達(dá)水平均很低。有研究指出，在小鼠胚胎發(fā)育第10.5天的腦組織中開始有ERβ mRNA表達(dá)，第16.5天的腦組織中才有ERα mRNA的表達(dá)［14］。本研究中培養(yǎng)的中腦細(xì)胞源于第13天的胚胎，ER表達(dá)量極低，不能發(fā)揮相應(yīng)作用，所以ER抑制劑不能逆轉(zhuǎn)BPA對(duì)中腦微團(tuán)細(xì)胞的毒性作用。因此，我們推測(cè)BPA誘導(dǎo)的中腦微團(tuán)細(xì)胞的毒性效應(yīng)可能主要不是由ER途徑介導(dǎo)的，而是有其他信號(hào)通路參與的。

Notch-Hes信號(hào)通路是一條保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在多種組織和器官的早期發(fā)育過程中，其家族成員對(duì)細(xì)胞的發(fā)育、生長及凋亡起著重要的調(diào)控作用。Notch信號(hào)由兩個(gè)鄰近細(xì)胞的受體與配體相互作用而激活，進(jìn)而活化Hes等分化拮抗基因的轉(zhuǎn)錄，其表達(dá)產(chǎn)物與相應(yīng)的分化效應(yīng)基因的啟動(dòng)子特異性結(jié)合，阻礙細(xì)胞特異性分化效應(yīng)基因的表達(dá)，最終影響細(xì)胞的分化和增殖［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，BPA 0.1 mmol·L－1在體外培養(yǎng)第 2 至第 5 天的中腦微團(tuán)細(xì)胞中可以上調(diào)Hes1 mRNA的表達(dá)水平，Notch1 mRNA表達(dá)水平僅在培養(yǎng)第2天有顯著上調(diào)。這一結(jié)果說明，BPA可能通過上調(diào)Notch1受體表達(dá)，活化Hes1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抑制細(xì)胞分化的作用。在Notch1表達(dá)恢復(fù)到對(duì)照水平后，Hes1的表達(dá)還可持續(xù)上調(diào)，繼續(xù)抑制細(xì)胞的分化。

目前有關(guān)Notch-Hes通路在BPA毒性中作用的研究并不多。對(duì)非洲爪蟾胚胎的研究結(jié)果表明，BPA 50 和100 μmol·L－1可使10.5 d 胚胎中Notch下游的Esr-1基因表達(dá)下調(diào)，加入Notch配體胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域能夠有效的逆轉(zhuǎn)BPA對(duì)Esr-1的下調(diào)［16］。皮下給予孕鼠低于 NOAEL 劑量(20 μg·kg－1)的BPA，發(fā)現(xiàn)在E12.5胎鼠端腦Hes1和Hes5表達(dá)下調(diào)，而到 E14時(shí)，Hes1表達(dá)上調(diào)［17］。哺乳動(dòng)物中的Hes基因和非洲爪蟾的Esr-1基因?yàn)橥椿?，結(jié)合對(duì)非洲爪蟾的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BPA能影響Notch-Hes信號(hào)通路，且具有時(shí)間效應(yīng)，這與本研究的結(jié)果相一致。

本研究提示，ER途徑在BPA對(duì)中腦微團(tuán)細(xì)胞存活和分化的抑制作用中可能不發(fā)揮主要作用，Notch-Hes信號(hào)通路可能參與了這一效應(yīng)，深入的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

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