王鳳梅，蔣克國(guó)，張桂霞，周海勝，查曉軍，郝 麗，王德光

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是我國(guó)終末期腎臟病（ESRD）的主要原因之一，且比重逐年上升。眾多研究表明，長(zhǎng)期血糖升高可激活多元醇通路、PKC通路、已糖胺途徑，促使活性氧類(lèi)產(chǎn)生過(guò)多，以及葡萄糖在非酶促下生產(chǎn)的糖基化終末產(chǎn)物（AEGs）在細(xì)胞外聚集，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)蓄積、腎小球硬化等病理改變。高糖還可誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等表達(dá)參與這一過(guò)程［1］。然而，DN的發(fā)生發(fā)展機(jī)制目前還不是十分清楚，是否有其他重要蛋白和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與其發(fā)病進(jìn)展過(guò)程有待于進(jìn)一步研究。

骨橋蛋白（osteopontin，OPN）是一種具有多種功能的磷酸化糖蛋白，主要與avβ整合素或CD44家族結(jié)合，參與細(xì)胞間黏附、趨化、遷移和信號(hào)傳導(dǎo)等生理及病理過(guò)程，在腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。在糖尿病動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)腎臟OPN表達(dá)升高，利用基因敲除OPN基因后，可減輕系膜細(xì)胞膨脹，降低尿蛋白產(chǎn)生，并發(fā)現(xiàn)OPN通過(guò)激活NF-κB途徑，增加足細(xì)胞能動(dòng)性，參與蛋白尿的形成［2］。在DN中，腎臟局部表現(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)纖維化，伴OPN、TGF-β等表達(dá)升高，利用抗體中和OPN表達(dá)后，減輕局部的巨噬細(xì)胞聚集，延緩纖維化進(jìn)展［3］。以上研究表明，OPN參與DN單核巨噬細(xì)胞聚集、間質(zhì)纖維化及蛋白尿產(chǎn)生等過(guò)程，一定程度上抑制OPN表達(dá)后可減輕上述病變，但引起OPN表達(dá)升高的具體機(jī)制仍不清楚。探討OPN是否能成為逆轉(zhuǎn)DN病理改變新的靶點(diǎn)及其具體的調(diào)控機(jī)制，目前已成為研究熱點(diǎn)。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們以HK-2細(xì)胞為模型，研究高糖刺激下OPN的表達(dá)，并進(jìn)一步探討其調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及藥品 DMEM低糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度4.5 mmol·L－1）、DMEM高糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度25 mmol·L－1）購(gòu)于美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；鼠抗p-AKT（ser473）、p-S6，兔抗 Raptor和 Rictor購(gòu)自 Cell Signaling；兔抗OPN購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；鼠抗β-actin、辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的IgG羊抗鼠和羊抗兔二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。TRIzol試劑盒、DMSO試劑購(gòu)自上海生工；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自立陶宛Fermentas公司；ECL顯影劑和PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。LY294002（溶于DMSO）購(gòu)于碧云天生物研究所；rapamycin（溶于 DMSO）購(gòu)于 Sigma公司；Lipo-fectamine 2000購(gòu)于Invitrogen公司。

1．2 HK-2細(xì)胞培養(yǎng) HK-2細(xì)胞為東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院劉必成教授惠贈(zèng)，給予DMEM低糖培養(yǎng)基和10%胎牛血清，置于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度為80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶（含0.1 mol·L－1EDTA）消化傳代。實(shí)驗(yàn)組換用DMEM高糖培養(yǎng)基，對(duì)照組用含相同濃度甘露醇的DMEM培養(yǎng)基，檢測(cè)高糖刺激不同時(shí)間點(diǎn)（12、24、48、72 h）OPN的表達(dá)。

1．3 RNA干擾 高糖培養(yǎng)24 h的HK-2細(xì)胞接種在12孔板中，繼續(xù)高糖培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞密度達(dá)40%～50%，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)，參照 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染 Raptor、Rictor及隨機(jī)無(wú)靶點(diǎn)陰性對(duì)照（NC）siRNA。以上siRNA均由上海Gene Pharma公司合成，序列分別為 5′-GGACAACGGCCACCAGUAC-3′； 5′-ACUUGUGAAGAAUCGUAUC-3′；5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。siRNA轉(zhuǎn)染4～6 h后換用含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h收樣，Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1．4 Real-time PCR法檢測(cè)OPN mRNA表達(dá) 按TRIzol試劑說(shuō)明書(shū)抽提不同組HK-2細(xì)胞總RNA。按標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)，以β-actin為對(duì)照。Real-time PCR引物由上海生工合成，引物如下：OPN上游5′-AGCACAGCATCGTCGGGAC-3′，下 游 5′-TCCTTGGTCGGCGTTTGGCTG-3′；β-actin上游 5′-CACCCGCCGCCAGCTCAC-3′，下 游 5′-GCCCCACGATGGAGGGGAAGA-3′。以比較Ct法的相對(duì)定量表達(dá)差異計(jì)算，2－△△Ct表示基因的相對(duì)表達(dá)量：△△Ct＝［Ct（待測(cè)基因）－Ct（β-actin）］試驗(yàn)組 －［Ct（待測(cè)基因）－Ct（β-actin）］對(duì)照組。

1．5 Western blot檢測(cè) OPN、p-AKT、p-S6、Raptor、Rictor蛋白表達(dá) 細(xì)胞按實(shí)驗(yàn)分組條件處理后，收集細(xì)胞，加入蛋白提取液裂解細(xì)胞。紫外分光光度計(jì)測(cè)定蛋白含量，每樣本各取50μg蛋白，10%SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)印2 h，以5%脫脂奶粉封閉45 min，分別加入稀釋的一抗OPN（1∶1 000），p-AKT（1 ∶100），p-S6（1 ∶1 000），Raptor（1∶1 000），Rictor（1∶1 000），β-actin（1∶1 000）于4℃孵育24 h后，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠、羊抗兔IgG二抗室溫孵育4 h，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，曝光顯影，掃描儀掃描結(jié)果。GEL-Pro4圖像分析軟件分析結(jié)果，表達(dá)強(qiáng)度用OPN／β-actin，再用對(duì)照組平均值為1進(jìn)行校正。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.0軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用ˉx±s表示，組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 高糖刺激上調(diào)HK-2細(xì)胞中OPN mRNA及蛋白的表達(dá) 為分析高糖對(duì)HK-2細(xì)胞OPN表達(dá)的影響，HK-2細(xì)胞經(jīng)低糖培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)后，換成高糖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，緊接著在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，分析OPN的表達(dá)。如Fig 1 A所示：Real-time PCR分析表明，高糖刺激后OPN mRNA表達(dá)水平呈時(shí)間依賴性升高。高糖刺激48 h后，OPN mRNA的表達(dá)水平達(dá)高峰，是對(duì)照組的（1.60±0.03）倍（P＜0.05）。進(jìn)一步Western blot分析也表明，高糖呈時(shí)間依賴性上調(diào)OPN蛋白的表達(dá)，以72 h最高，但與48 h比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Fig 1 B）。

Fig 1 mRNA and protein expression of OPN in HK-2 cells cultured in 25 mmol·L－1 glucose

2．2 高糖激活 PI3K／AKT／mTOR信號(hào)通路PI3K／AKT／mTOR信號(hào)通路在代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［4］。為研究高糖刺激是否對(duì) PI3K／AKT／mTOR信號(hào)通路有影響，我們提取高糖刺激48 h后的HK-2細(xì)胞蛋白裂解液，并通過(guò)Western blot分析p-AKT和p-S6（mTOR的下游靶分子及活性指標(biāo)）的表達(dá)情況。研究表明，與對(duì)照組相比較，高糖刺激后p-AKT和p-S6蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)。因此，高糖激活PI3K／AKT／mTOR信號(hào)通路（Fig 2）。

Fig 2 Effect of high glucose on protein expression of p-AKT and p-S6 in HK-2 cells induced by 25 mmol·L－1 glucose（HG）for 48 h

2．3 抑制PI3K／AKT／mTOR信號(hào)通路下調(diào)高糖刺激下OPN的表達(dá) 為探討高糖刺激是否通過(guò)激活PI3K／AKT／mTOR信號(hào)通路上調(diào)OPN的表達(dá)，我們應(yīng)用PI3K特異性抑制劑LY290042、mTOR特異性抑制劑rapamycin處理HK-2細(xì)胞，觀察高糖刺激下OPN的表達(dá)情況。研究結(jié)果表明，LY290042和rapamycin均明顯降低了OPN的表達(dá)水平，且兩者聯(lián)合使用發(fā)揮更好的效果（Fig 3）。因此，以上結(jié)果表明，高糖是通過(guò)激活PI3K／AKT／mTOR信號(hào)通路上調(diào)OPN的表達(dá)。

2．4 mTORC1介導(dǎo)了高糖刺激下OPN的表達(dá)mTOR在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中能與不同的蛋白結(jié)合組裝成兩種復(fù)合體，即 mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTORC2）。mTORC1對(duì)rapamycin敏感，它的特有組成成分為Raptor蛋白；而mTORC2對(duì)rapamycin不敏感，其特有組成成分為Rictor蛋白。為進(jìn)一步確認(rèn)mTORC1和mTORC2在高糖刺激下OPN表達(dá)增強(qiáng)中的作用，我們運(yùn)用RNA干擾技術(shù)分別敲低了Raptor和Rictor，然后檢測(cè)高糖刺激下OPN表達(dá)變化的情況。如Fig 4所示，Raptor和Rictor siRNA均成功敲低了相應(yīng)蛋白的表達(dá)；且與對(duì)照細(xì)胞相比，敲低 Raptor后 HK-2細(xì)胞OPN表達(dá)明顯減少（P＜0.05），而敲低Rictor后OPN表達(dá)無(wú)明顯變化。以上結(jié)果表明，高糖刺激是通過(guò)激活 PI3K／AKT／mTORC1信號(hào)通路上調(diào) OPN的表達(dá)。

Fig 3 Effects of LY294002，rapamycin and the combination on protein expression of OPN in HK-2 cells cultured in 25 mmol·L－1 glucose for 48h

3 討論

既往研究探討OPN在糖尿病動(dòng)物模型及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的作用，如參與蛋白尿形成及炎細(xì)胞浸潤(rùn)、氧化應(yīng)激、膠原蛋白合成等過(guò)程［2－3，5－6］。本研究建立在OPN在DN中起作用的前提下，以HK-2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，發(fā)現(xiàn)，高糖刺激呈時(shí)間依賴性上調(diào)OPN mRNA及蛋白水平表達(dá)，同時(shí)高糖激活PI3K／AKT／mTOR信號(hào)通路。進(jìn)一步探討高糖調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞OPN表達(dá)的機(jī)制，運(yùn)用特異性抑制劑和RNA干擾技術(shù)，抑制PI3K／AKT／mTOR信號(hào)通路，創(chuàng)新性提出高糖通過(guò)激活PI3K／AKT／mTORC1信號(hào)通路上調(diào)OPN的表達(dá)。

Fig 4 Protein expression of OPN in HK-2 cells transfected with siRaptor，siRictor

Lee等［7］在鼠腎小球上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)高糖通過(guò)激活PI3K／AKT通路，抑制腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK），活化mTOR，促進(jìn)翻譯抑制分子eIF-4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）磷酸化，進(jìn)而增加蛋白合成，促進(jìn)腎臟肥大?；罨腜I3K／AKT／mTOR通路還參與DN中系膜基質(zhì)增生、EMT等病理改變，并損傷足細(xì)胞參與蛋白尿形成［8］。近年研究發(fā)現(xiàn)，mTOR特異性抑制劑雷帕霉素（rapamycin）能夠延緩DN動(dòng)物模型中GBM增厚及腎小球的肥大，減輕系膜基質(zhì)蓄積、減輕蛋白尿［9－11］。Junaid等［12］在人腎小管上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，抑制PI3K后可降低OPN mRNA表達(dá)，但未進(jìn)一步探討下游具體信號(hào)通路。在DN大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素抑制OPN［13］，據(jù)此，我們推測(cè)雷帕霉素可能通過(guò)抑制PI3K／AKT／mTOR通路，下調(diào)腎小管上皮細(xì)胞OPN的表達(dá)來(lái)減輕DN的病理改變。本研究通過(guò)高糖刺激HK-2細(xì)胞，激活PI3K／AKT／mTOR信號(hào)通路，同時(shí)OPN表達(dá)升高，運(yùn)用特異性抑制劑和RNA干擾技術(shù)從不同途徑抑制PI3K／AKT／mTORC1信號(hào)通路均降低OPN表達(dá)，而干擾mTORC2對(duì)OPN表達(dá)無(wú)影響，證實(shí)高糖通過(guò)激活PI3K／AKT／mTORC1信號(hào)通路上調(diào)OPN的表達(dá)。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖促進(jìn)OPN在mRNA水平表達(dá)增加。OPN基因啟動(dòng)子存在 NF-κB、Smads、TGF-β調(diào)控位點(diǎn)，DN中活化的 NF-κB、TGF-β／Smads通路可以在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)OPN的表達(dá)［14］。此外，高糖活化的PKC、腎小管處蓄積的AGEs，均可激活NF-κB和TGF-β／Smads信號(hào)通路，誘導(dǎo)相關(guān)基因如OPN、TGF-β活化［15］。且 OPN與 TGF-β存在相互作用，共同參與DN的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。在DN動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以抑制 TGF-β／Smads通路及OPN表達(dá)，減輕腎小管－間質(zhì)損傷［13］。因此，活化的PI3K／AKT／mTORC1通路激活4E-BP1調(diào)控 NF-κB、細(xì)胞周期蛋白等蛋白質(zhì)的翻譯過(guò)程，NF-κB、TGF-β、avβ3是 PI3K／AKT／mTORC1通路的下游分子，我們猜測(cè)PI3K／AKT／mTORC1通路可能通過(guò)上調(diào)這些蛋白的活性來(lái)增強(qiáng)OPN的表達(dá)。我們?cè)趯?lái)的研究中要進(jìn)一步探討這個(gè)問(wèn)題。Hsieh等在DN動(dòng)物模型及高糖誘導(dǎo)下的鼠腎小管上皮細(xì)胞中，利用芯片分析發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激、PKC-β1信號(hào)通路及RAS系統(tǒng)均參與調(diào)控OPN，并且之間存在交互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)［16－17］。因此，高糖調(diào)控OPN受多個(gè)信號(hào)通路調(diào)控，抑制 PI3K／AKT／mTORC1并不能完全阻斷OPN表達(dá)。

DN是糖尿病最嚴(yán)重并發(fā)癥之一，發(fā)生率高，危害性大，明確其發(fā)病機(jī)制，進(jìn)而逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)展成為研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)揭示 PI3K／AKT／mTORC1／OPN在DN的發(fā)生、發(fā)展中可能起到重要作用，干擾、抑制這一通路可能是治療DN的一個(gè)新的靶點(diǎn)。我們已完成的研究發(fā)現(xiàn)，mTORC1抑制劑雷帕霉素可延緩DN進(jìn)展［5－6］，我們也將繼續(xù)在動(dòng)物模型中探討該作用是否通過(guò)抑制OPN表達(dá)所致，進(jìn)一步驗(yàn)證OPN調(diào)控機(jī)制。

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